Summary
La pureté et l’intégrité de l’ARN isolé est une étape essentielle dans les tests dépendants de l’ARN. Ici, nous présentons une méthode pratique, rapide et peu coûteuse pour extraire l’ARN d’une petite quantité de tissu pancréatique intact.
Abstract
Indépendamment de la méthode d’extraction, l’extraction optimisée de l’ARN des tissus et des lignées cellulaires se fait en quatre étapes : 1) homogénéisation, 2) dénaturation efficace des protéines de l’ARN, 3) l’inactivation de la ribonucléase, et 4) l’élimination de la contamination de l’ADN, des protéines et des glucides. Cependant, il est très laborieux de maintenir l’intégrité de l’ARN quand il ya des niveaux élevés de RNase dans le tissu. L’autolyse spontanée rend très difficile d’extraire l’ARN du tissu pancréatique sans l’endommager. Ainsi, une méthode pratique d’extraction d’ARN est nécessaire pour maintenir l’intégrité des tissus pancréatiques pendant le processus d’extraction. Une étude expérimentale et comparative des protocoles existants a été réalisée en obtenant 20-30 mg de tissus pancréatiques de rat en moins de 2 minutes et en extrayant l’ARN. Les résultats ont été évalués par électrophorèse. Les expériences ont été réalisées trois fois pour la généralisation des résultats. L’immersion du tissu pancréatique dans le réactif de stabilisation de l’ARN à -80 °C pendant 24 h a donné un ARN à haute intégrité, lorsque le réactif d’extraction de l’ARN a été utilisé comme réactif. Les résultats obtenus étaient comparables aux résultats obtenus à partir de kits commerciaux avec fixations de colonne de spin.
Introduction
Les données génétiques structurelles peuvent être transcrites à un produit fonctionnel par l’expression des gènes. L’analyse de l’ARN est utilisée pour découvrir des différences dans l’expression des gènes dans différentes conditions. Il existe un certain nombre de méthodes pour extraire les acides nucléiques comme suit : guanidinium thiocyanate, extraction par phénol-chloroforme, chromatographie à base de cellulose, extraction par matrices de silice, et anion-échange1,2.
Une détection adéquate de l’expression génique est influencée par l’intégrité de l’ARN isolé des tissus; par conséquent, il est essentiel d’évaluer l’intégrité de l’ARN isolé des tissus avant que d’autres tests ne soient effectués parce que des tests moléculaires complémentaires sur un ARN de mauvaise qualité peuvent compromettre les résultats des applications diagnostiques. Ainsi, l’ARN à haute intégrité est nécessaire pour les tests biologiques moléculaires avec différentes applications diagnostiques : RT-PCR quantitatif, micro-réseaux, test de protection ribonucléase, analyse de tache nordique, cartographie de l’ARN et construction de bibliothèque cDNA3,4.
L’ARN devient plutôt instable après avoir été longtemps conservé. Les longs fragments d’ARNm de plus de 10 ko sont particulièrement sensibles à la dégradation5,6. Ainsi, les chercheurs doivent tenir compte de divers facteurs qui influencent l’intégrité de l’ARN purifié. La pureté de l’ARN doit être protégée contre les RNases, les protéines, l’ADN génomique et la contamination par les inhibiteurs enzymatiques. En outre, le meilleur et acceptable rapport d’absorption de l’ARN aux UV (260/280) doit être dans la gamme de 1,8-2.0 avec une fragmentation minimale sur l’électrophorèse. Des techniques de laboratoire récemment développées ont permis aux scientifiques d’évaluer l’intégrité de l’échantillon d’analyse moléculaire plus pratiquement7,8.
Il est beaucoup plus difficile d’extraire l’ARN intact du tissu pancréatique que d’autres types de tissus en raison de la grande quantité de ribonucléases (RNases). Cependant, les méthodes d’extraction existantes, à savoir l’éjection rapide du tissu pancréatique de la cavité abdominale et l’homogénéisation à basse température pour entraver RNases, se sont avérées inefficaces7,8,9,10,11,12,13,14.
Le but de la présente étude expérimentale comparative est de modifier et de comparer les méthodes existantes pour déterminer les méthodes les plus efficaces. À cette fin, divers protocoles d’extraction de l’ARN ont été modifiés et comparés. Il visait spécifiquement à déterminer la méthode la moins coûteuse nécessitant une quantité minimale de tissu pancréatique.
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Protocol
L’approbation éthique de cette étude a été obtenue auprès de l’Université des sciences médicales de Shiraz (numéro d’approbation : 93-01-01-7178\03-07-2014).
REMARQUE : Utilisez des rats mâles Sprague-Dawley pesant 250 g. Placez le flacon contenant un morceau de tissu pancréatique immergé dans le réactif stabilisateur de l’ARN dans un réservoir d’azote liquide à -80 °C et utilisez une solution de réactif d’extraction d’ARN pour maintenir l’intégrité de l’ARN.
1. Ablation du tissu pancréatique du rat
- Préparer la salle d’opération et placer tous les matériaux requis sous le capot.
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux (pansements, forceps Brown-Adson, ciseaux Iris et ciseaux Littler) dans un four pendant au moins 4 h à 240 °C pour inactiver RNases15. Stériliser la surface de la place de chirurgie avec 70% d’alcool sous le capot.
- Injecter de la kétamine/xylazine à l’aide d’une seringue à insuline [80/8 mg/kg]. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils du rat pour un manque de réponse.
- Ajouter 1 mL de réactif de stabilisation de l’ARN dans le microtube approprié (2 mL) pour inhiber l’activation des endonuclées dans les tissus excisés.
- Placez immédiatement le rat sur le tableau chirurgical (éloignez-vous du chirurgien) pour une incision de milieu de ligne.
- Stériliser toute la surface abdominale avec 70% d’alcool et enlever les poils de rat à l’aide d’une tondeuse à cheveux avec des lames #40.
- Faites une incision en forme de V pour ouvrir l’abdomen de la zone pubienne aux pattes avant avec des forceps dressing, des forceps Brown-Adson, des ciseaux Iris et des ciseaux Littler.
- Retournez les organes abdominaux sur le côté gauche pour exposer le pancréas. Trouvez soigneusement le tissu pancréatique, qui se propage dans la cavité abdominale. Localiser la zone sous la rate pour trouver le pancréas sans être confondu avec le tissu adipeux.
- Retirez immédiatement 20-30 mg de pancréas de la cavité abdominale en moins de 2 min. Mettez le tissu enlevé dans le microtube de 2 mL rapidement et coupez-le avec un coupeur stérile pour pénétrer les tissus séparés avec le réactif de stabilisation d’ARN.
- Placez le microtube dans un réservoir d’azote pour geler immédiatement. Conservez le microtube dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h16.
- Après 24 h, transférer les minuscules morceaux de tissus pancréatiques dans un récipient de glace.
- Injecter du chlorure de potassium (KCl) intracrardially pour l’euthanasie des rats après la chirurgie.
2. Extraction de l’ARN
- Stériliser la surface sous le capot avec 70% d’alcool.
- Mettez 1 mL du réactif d’extraction d’ARN, qui contient du guanidinium thiocyanate pour inhiber le RNase, dans le microtube stérile.
- Transférer le tissu pancréatique séparé sur le microtube. Transférer le microtube dans l’azote liquide pour le congeler immédiatement.
- Homogénéiser le tissu avec le sonicateur de sonde micro pointe à 4 °C réglé au niveau 20 pour 60 s sur et 5 s off.
- Incuber chaque échantillon homogénéisé pendant 5 min à 4 °C à l’aide de glace concassée pour permettre aux complexes de nucléoprotéines d’être complètement dissociés.
- Enrichir les échantillons avec 0,2 mL de chloroforme pour chaque 1 mL de réactif d’extraction d’ARN. Capez fermement le tube et secouez-le avec force pendant 15 s.
- Incuber le tube pendant 15 min sur la glace concassée (4 °C) pour séparer le réactif en trois phases.
- Faire fonctionner la centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à +2 à +8 °C. Transférez la phase aqueuse incolore sur un nouveau microtube.
- Ajouter 0,5 mL d’isopropanol à 100% à la phase aqueuse. Fermer le tube, puis l’inverser au moins 3 fois pour bien mélanger l’ARN.
- Incuber l’échantillon de 5 à 10 min sur une boîte froide (4 °C) pour permettre les précipitations d’ARN.
- Faire fonctionner la centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à +2 à +8 °C. Jetez le supernatant.
- Enrichissez chacun des tubes de centrifugeuse avec 1 mL d’éthanol à 75%.
- Laver la pastille d’ARN en inversant le tube au moins 3 fois.
- Faire fonctionner la centrifugeuse à 7 500 x g à +2 à +8 °C pendant 5 min. Jeter le supernatant pour retirer l’excès d’éthanol du granulé d’ARN par séchage à l’air.
- Re-suspendre le granulé d’ARN dans l’eau sans RNase traitée par diéthylpyrocarbonate (DEPC).
- Passer la solution à travers une pointe de pipette plusieurs fois pour dissoudre le granulé d’ARN. Ensuite, incuber la solution pendant 10-15 min à +65 °C.
3. Évaluation de l’intégrité de l’ARN avec électrophorèse de dénaturation
- Préparer le tampon de fonctionnement du gel : 50 mM NaAc (TRAITÉ DEPC) et 0,5 M EDTA (pH 8.0) en H2O traité par DEPC.
- Préparer un tampon de gel de formaldéhyde 5x (tampon de fonctionnement MOPS) : 0,1 M M. MOPS (pH 7,0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
- Dissoudre 20,6 g de MOPS dans 800 mL de DEPC traité 50 mM d’acétate de sodium. Ajuster le pH à 7,0 avec 2 N NaOH. Ajouter 10 mL de DEPC traité 0,5 M EDTA (pH 8.0). Ajuster le volume de la solution à 1 L avec de l’eau traitée par DEPC.
- Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm et la garder à température ambiante à l’écart de la lumière pour la stérilisation. Le tampon devient jaune avec le temps s’il est exposé à la lumière ou s’il est autoclaved. Un tampon de couleur paille fonctionne bien, mais les plus foncés ne sont pas17.
- Préparer un gel agarose de 1,5 %18. Pour 50 mL, ajouter 0,75 g d’agarose et 31 mL de H2O. Micro-ondes la solution au micro-ondes pendant 1 min. Ajouter 9 mL de formaldéhyde et 10 mL de tampon en cours d’exécution MOPS 5x.
- Préparer les échantillons pour le gel. Mélanger ce qui suit dans un tube de microfuge stérile :
ARN X μL (jusqu’à 30 μg)
2 μL de tampon de chargement de gel 5x
10 μL de formamide
4 μL de tampon en cours d’exécution MOPS
1 μL de 0,1 mg/mL EtBr
3 μL de formaldéhyde 5-x μL de DEPC-H2O - Incuber les échantillons à 65 °C pendant 15 min et les refroidir sur la glace. Centrifugeuse pendant 5 s jusqu’à ce que tout le liquide soit déposé.
- Pré-exécuter le gel à 5 V/cm pendant 5 minutes.
- Chargez immédiatement les échantillons dans les voies du gel, puis submergez le gel dans un tampon de 1x gel-running de formaldéhyde. Courir à 3-4 V/cm19.
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Representative Results
Évaluation de l’intégrité de l’ARN dans le réactif d’extraction de l’ARN selon un protocole chirurgical courant et modifié sans réactif de stabilisation de l’ARN
Des bandes inacceptables ont été observées après l’extraction de l’ARN avec le réactif d’extraction d’ARN d’un protocole chirurgical courant. La voie 1 montre l’ARN du foie comme un contrôle. La voie 2 montre l’état dégradé des bandes rRNA 28S/18S dans l’ARN total obtenu à partir d’un protocole chirurgical de routine. Lorsque la quantité de tissu pancréatique a été réduite à 50 mg (voie 3) ou 20-30 mg (voie 4) et la chirurgie a été effectuée immédiatement (protocole modifié) sans le réactif de stabilisation de l’ARN, la séparation de l’ARN a été moins réussie que dans le contrôle des tissus hépatiques et des bandes non spécifiques ont été observées.
Évaluation de l’intégrité des échantillons d’ARN selon un protocole chirurgical modifié immergé dans le réactif de stabilisation de l’ARN
L’intégrité des ARN produits avec le réactif d’extraction de l’ARN dépend du temps et de la température de conservation (voie 5-8). En comparaison avec le tissu de foie témoin, la séparation d’ARN n’a pas été réussie quand la quantité de tissu pancréatique était 50 mg (voie 5) ou 20-30 mg (voie 6). L’ARN a été extrait immédiatement après que le tissu ait été immergé dans le réactif de stabilisation d’ARN. Aucune bande spécifique n’a été observée lorsque 20-30 mg de tissu a été submergé dans le réactif de stabilisation de l’ARN à -80 °C pendant 48 h et l’ARN a été extrait sur la base du protocole. Selon les résultats de l’électrophorèse, l’ARN a été complètement dégradé (voie 7). Comme indiqué dans la voie 8, des bandes acceptables (RRNA 28S/18S) ont été observées après avoir submergé 20 à 30 mg de tissu pancréatique dans le réactif de stabilisation de l’ARN à -80 °C pendant 24 h, puis l’ARN a été extrait.
Figure 1 : Évaluation de l’intégrité de l’ARN isolé des tissus pancréatiques de rat utilisant le réactif d’extraction d’ARN selon les protocoles sous l’enquête. La voie 1 décrit l’intégrité de l’ARN obtenu du foie comme un contrôle. La voie 2 représente l’état des bandes rRNA 28S/18S dans l’ARN total obtenu à partir d’un protocole chirurgical de routine. La voie 3 représente l’état des bandes rRNA 28S/18S dans l’ARN total obtenu à partir d’un protocole chirurgical modifié et de 50 mg de tissu. La voie 4 représente l’état des bandes rRNA 28S/18S dans l’ARN total obtenu à partir d’un protocole chirurgical modifié et de 20 à 30 mg de tissu. La voie 5 représente l’état des bandes rRNA 28S/18S dans l’ARN total obtenu à partir d’un protocole chirurgical modifié et de 50 mg de tissu extrait immédiatement après avoir été immergé dans le réactif de stabilisation de l’ARN. La voie 6 montre l’intégrité de l’ARN obtenu à partir de 20-30 mg de tissu pancréatique à partir d’un protocole chirurgical modifié extrait immédiatement après avoir été immergé dans le réactif de stabilisation d’ARN. La voie 7 représente l’intégrité de l’ARN obtenu à partir de 20-30 mg de tissu à partir d’un protocole chirurgical modifié après 48 h d’immersion dans un réactif de stabilisation de l’ARN à -80 °C. La voie 8 représente l’intégrité de l’ARN obtenu à partir de 20 à 30 mg de tissu à partir d’un protocole chirurgical modifié après 24 h d’immersion dans un réactif de stabilisation de l’ARN à -80 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
En biologie moléculaire, il est essentiel d’obtenir un ARN de haute qualité. La présence des enzymes ribonucléase dans les cellules et les tissus dégrade rapidement l’ARN et rend l’extraction complexe. RNases sont des enzymes stables fonctionnant sans aucun co-facteur. De petites quantités de RNase sont suffisantes pour détruire l’ARN. Lorsque le tissu pancréatique du rat est retiré de la cavité abdominale, il est nécessaire de désinfecter les instruments chirurgicaux par des détergents solides, les rincer soigneusement et les mettre dans un four pendant au moins 4 h à 240 °C pour inactiver RNases avant la chirurgie. Étant donné que le niveau de RNase est extrêmement élevé dans le pancréas, le lieu de la chirurgie est stérilisé avec naoh et de l’eau de Javel légère pour désactiver les RNases. Tandis que le tissu pancréatique est enlevé pendant la dissection, l’ARN se dégraderait. Pour augmenter l’efficacité, il est nécessaire que la dissection soit effectuée le plus rapidement possible20,21,22,23,24.
Le pancréas est un tissu critique pour les mécanismes homéostatiques du corps. Par conséquent, l’amélioration des procédures d’extraction de l’ARN pancréatique aident les chercheurs à mieux comprendre les voies actives. Le présent protocole proposait un modèle pour une méthode efficace, simple et optimisée pour l’extraction de l’ARN du pancréas. Différentes méthodes communes d’extraction d’ARN du tissu pancréatique ont été évaluées. Il a été concentré sur l’effet du stockage congelé et des stratégies d’inhibition RNase influençant la qualité de l’ARN. Les deux facteurs les plus significatifs influençant l’intégrité de l’ARN sont la durée de la chirurgie et la quantité de tissu pancréatique recueilli. Des études récentes ont révélé qu’il existe une corrélation positive entre la dégradation de l’ARN et la quantité de tissu pancréatique8,13,20.
Dans ce protocole, 20-30 mg de tissu pancréatique a été obtenu en moins de 2 min des rats anesthésiés. De longues étapes chirurgicales peuvent conduire à l’activation des endonucléases endogènes dans le pancréas et dégrader l’ARN rapidement. Dans cette étude, l’ARN a été isolé de différents échantillons avec le thiocyanate de guanidinium, et les techniques d’extraction de phénol-chloroforme ont employé l’azote liquide pour entraver l’activité d’ARN. La méthode a atteint trois objectifs : la perméation rapide du réactif de stabilisation d’ARN dans les tissus pancréatiques, la protection de l’ARN cellulaire, et le temps de conservation accru. Les résultats étaient optimaux lorsque les échantillons contenant du réactif de stabilisation de l’ARN ont été conservés à -80 °C pendant 24 h.
Cependant, l’intégrité d’ARN a augmenté de manière significative quand le réactif de stabilisation d’ARN a été introduit. De plus, ce processus était reproductible. Une petite section du pancréas (20-30 mg) a été disséquée pendant la chirurgie des rats anesthésiés et submergée dans 1 mL de réactif de stabilisation d’ARN à -80°C pendant 1-2 jours. Comme on le voit dans la voie 8, le stockage pendant 24 h était le moment optimal.
Les méthodes susmentionnées ont permis à une plus petite quantité de réactif de stabilisation de l’ARN de pénétrer dans l’organe. En outre, le processus de dégradation a cessé peu de temps après les expériences parce que la taille des morceaux disséqués était faible. Dans ce protocole, l’étape vitale est de couper le tissu immergé dans le réactif de stabilisation de l’ARN en très petits morceaux dès que possible jusqu’à ce qu’il pénètre dans les cellules et supprime l’activation de RNase. Dans l’étape homogénéisante, il est très crucial d’empêcher la production de bulles dans le réactif d’extraction d’ARN et d’effectuer toutes les étapes à 4 °C. Il est crucial de séparer très soigneusement la phase aqua (la phase contenant l’ARN) afin d’éviter la contamination par l’ADN. Bien que l’autolyse et la présence de RNases endogènes compromettent l’isolement intact d’ARN du pancréas de rat, l’intégrité de l’ARN a été maintenue dans la méthode proposée de perfusion de pancréas. Ainsi, la méthode proposée est une procédure simple, reproductible et peu coûteuse qui nécessite de plus petites quantités de réactif de stabilisation de l’ARN que les autres méthodes existantes.
Comme toute étude, ce protocole a certaines limites. Tout d’abord, l’intégrité et le rendement de l’ARN obtenu est inférieur à l’utilisation de tissu pancréatique entier comme seulement 20-30 mg de tissu est utilisé. Deuxièmement, un grand nombre d’échantillons ne peuvent pas être prélevés en une seule journée parce que l’extraction de l’ARN et aussi les tests de synthèse de l’ADN CD doivent être effectués rapidement et consécutivement pour diminuer la dégradation de l’ARN. Troisièmement, pour effectuer des projets de recherche avec différents groupes de rats, il est essentiel de prendre exactement 20-30 mg de tissu de la même zone chirurgicale pour diminuer la variation des données parce que le tissu pancréatique rat diffuse complètement dans la cavité péritonéale.
Pour conclure, l’utilisation de la solution de réactif d’extraction d’ARN après la perfusion de réactif de stabilisation de l’ARN est une bonne alternative aux kits d’extraction d’ARN coûteux et basés sur la colonne.
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Disclosures
Aucun n’a été déclaré.
Acknowledgments
La présente étude a été soutenue financièrement par l’Université des sciences médicales de Shiraz (subvention no 93-01-01-7178\03-07-2014). Nous remercions M. Zomorodian et M. Rostami du Département d’e-Learning en sciences médicales, de l’École virtuelle et du Centre d’excellence en e-Learning de l’Université des sciences médicales de Shiraz pour avoir modifié la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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