Summary
Strålningsinducerad DNA-skaderespons som aktiveras av neutronblyglad som används vid behandling med inskiljning av bor neutron (BNCT) har inte fastställts helt. Detta protokoll ger ett steg-för-steg förfarande för att upptäcka strålning-inducerad foci (RIF) av reparation proteiner genom immunofluorescens färgning i mänskliga kolon cancer cellinjer efter bestrålning med neutron-blandade strålen.
Abstract
Syftet med manuskriptet är att tillhandahålla ett steg-för-steg-protokoll för att utföra immunofluorescensmikroskopi för att studera det strålningsinducerade DNA-skadesvaret som induceras av neutron-gammablandad stråle som används i behandling med infångning av bor neutron (BNCT). Närmare bestämt tillämpas den föreslagna metoden för detektion av aktivering av reparationsproteiner som kan visualiseras som högborgar med antikroppar som är specifika för DNA-dubbelsträngsbrott (DNA-DSB). DNA reparation högborgar bedömdes genom immunofluorescens i kolon cancerceller (HCT-116) efter bestrålning med neutron-blandade balk. DNA-DSBs är de mest genotoxiska lesioner och repareras i däggdjursceller av två stora vägar: icke-homologa end-joining pathway (NHEJ) och homolog rekombination reparation (HRR). Frekvenserna av högborgar, immunokemiskt färgade, för vanliga markörer i radiobiologi som γ-H2AX, 53BP1 är associerade med DNA-DSB-nummer och betraktas som effektiva och känsliga markörer för övervakning av induktion och reparation av DNA-DSB. Det fastställdes att γ-H2AX foci attraherar reparationsproteiner, vilket leder till en högre koncentration av reparationsfaktorer nära en DSB. För att övervaka DNA-skador på cellnivå planerades immunofluorescensanalys för förekomsten av DNA-PKcs representativa reparationsproteinfoci från NHEJ-vägen och Rad52 från HRR-vägen. Vi har utvecklat och infört ett tillförlitligt immunofluorescensfärgningsprotokoll för påvisande av strålningsinducerad DNA-skaderespons med antikroppar som är specifika för reparationsfaktorer från NHEJ och HRR-vägar och observerade strålningsinducerade foci (RIF). Den föreslagna metoden kan användas för att undersöka reparationsprotein som är starkt aktiverat vid neutronblandad strålstrålning, vilket indikerar reparationsvägens dominans.
Introduction
Strålningsinducerad DNA-skaderespons som aktiveras av neutronblyglad som används vid behandling med infångning av bor neutron (BNCT) har inte fastställts fullt ut. Detta protokoll ger ett steg-för-steg-förfarande för att utföra detektion av strålningsinducerade foci (RIF) av reparationsproteiner genom immunofluorescensfärgning t.ex.
Joniserande strålning (IR) inducerar en mängd olika typer av DNA-skador (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA-basskada) varav DNA dubbelsträngsbrott är de mest genotoxiska DNA-lesionerna1. Oreparerade raster kan orsaka celldöd, medan felreparerade raster ökar sannolikheten för kromosom omorganisering, mutagenesis, och förlust av avgörande genetisk information. Skadehanteringsvägarna som svarar på DSB inkluderar dna-reparationsvägar som icke-homologa ändsamnackor (NHEJ), en mekanism som kräver Ku 70/80, DNA–PKcs, Xrcc4 och DNA-ligase IV som nyckelfaktorer2,,3,,4,,5,6. Hos däggdjur är den andra huvudsakliga DNA-reparationsvägen homolog rekombinationsreparation (HRR) som kräver nyckelkomponenter - Genfamiljen Rad52 epistasis– Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 och Rad587. Rad51 och Rad54 är viktiga mänskliga rekombination faktorer som deltar i reparation mekanismer relaterade till replikering stress och DNA-avbrott i eukaryoter. Intressant nog observerades det att nedregleringen av HRR-vägen förbättrar NHEJ-vägen som är felbenägen pekar på HR-utbildningsavsnitt relevans för genomet stabilitet8.
Det första steget i DSBs bildandet är fosforylering av γ-H2AX histon på Ser-139 av Ataxia telangiectasia muterade kinas (ATM) från PI3 kinas familjen7,8. Intressant nog kan H2AX fosforylering visualiseras enkelt genom immunofluorescensteknik som foci (γ-H2AX foci) med antikroppar som är specifika för fosforylerade H2AX6. Det finns ett 1:1-förhållande mellan antalet DSB och γ-H2AX foci, därför studeras DSB-markör, γ-H2AX, utförligt genom karakterisering av högborgarbildning, storlek och kvantitet6,7,8,9,,10,11. Bildandet av γ-H2AX foci leder till rekrytering och ackumulering av DNA-skador svar (DDR) proteiner och kromatinmodifierande faktorer, såsom 53BP1 (p53 bindande protein 1), MDC1 (medlare av DNA-skador checkpoint), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, och många andra reparera faktorer som därmed bildar strålning-inducerad foci (RIF). Alla dessa proteiner samlokalisera med γ-H2AX genom direkt eller indirekt bindning1,,11,,12.
Det är viktigt att upptäcka DNA-skador och reparation med ett ordentligt känsligt test, därför ägnas mer uppmärksamhet åt utvecklingen av mycket exakta tekniker13. I samband med DNA-skade- och reparationsstudier är metoden avgörande för känslig dete-dna-skada, beskrivning av skadekategori och kvantifiering av DNA-skador och reparationsmekanismer13. För att upptäcka enstaka celler med skadat DNA används kometanalys vanligen i radiobiologiska studier14. Andra tillgängliga cytogenetiska metoder känner igen kromosomal avvikelser, inklusive dicentrics, flyttningar, acentric fragment, ringar och kromatid typ avvikelser och mikrokärnor kromosomskador (Mn). Den vanligaste metoden i radiobiologi, särskilt i biologisk dosimetri, är den dicentriska kromosomanalysen på grund av dess höga specificitet för strålning15. PCR, en klassisk molekylär metod, kan till exempel inte känna igen den typ av upptäckta DNA-skador. I detta fall passerar de immunometriska metoderna känslighetsnivån eftersom reaktionerna är specifika mellan antigenet och antikroppen. Immunofluorescensavbildning ger visuella bevis för utseendet på olika proteiner i distinkta högborgar som svar på DNA-skadliga ämnen som joniserande strålning16. Aktiveringsnivåerna för skador och reparation av proteiner mRNA-nivåer kan dock lätt detekterbara genom PCR i realtid, vilket är en lämplig kvantitativ metod för ytterligare molekylära studier i samband med DNA-skador17.
Med tanke på att γ-H2AX foci lockar reparationsfaktorer18, för att övervaka DNA-skador och reparation på cellnivå, har vi utvecklat ett tillförlitligt immunfluorescensfärgningsförfarande, baserat på analysen av den representativa reparationsproteinfoci från NHEJ-vägen (DNA-PKcs) och Rad52 från HRR-vägen.
Här föreslår vi användning av immundetection för dessa proteiner som ett effektivt och känsligt förfarande för övervakning av DNA-DSB induktion och reparation. Hittills har det inte funnits några tillgängliga data om DNA-DSB baserat på högborgar för reparationsproteiner på cellnivå efter neutronblygstrålningen för BNCT, utom γ-H2AX och 53BP1 markörer19. Vi föreslår anpassning av HCT-116 tjocktarmscancer cellinje, eftersom det är rik sig i DSBs högborgar, som en standard cellinje för DNA-skada analys, eftersom RIFs är lätta att upptäcka. Denna vidhäftande cellinje är lätt att underhålla och korrekt för bestrålning förfaranden. Det föreslagna förfarandet bygger på en enorm mängd tidigare studier relaterade till det allmänna immunofluorescensförfarandet för γ-H2AX-färgning. Den innehåller dock alla detaljer om valet av lämpliga antikroppar med testade utspädningar för varje representativt protein som tillhör varje reparationsväg. Dessutom beskriver den utnyttjandet av en unik neutronblandad stråle som används i BNCT-behandling. Vi rekommenderar dock att man utökar studierna med båda metoderna, immunofluorescensfärgning först och sedan, med högkostnadsmolekylär analys som utförts tidigare4,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av cellodling och experimentell uppbyggnad
- Underhåll mänskliga kolon cancerceller, HCT-116 som rekommenderas av leverantören, i monolayers i 75 cm2 kulturflaskor som innehåller 10 ml formulerade McCoy's 5a Medium Modified, kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum och 1% antimykotisk antibiotikalösning.
- Odla celler i en fuktad 5% CO2-miljö vid 37 °C tills 70% av samflödet med medelstor förnyelse var 2 till 3 dagar.
- För att få BNCT-strål (t.ex. neutronstråle plus 10BPA) och BNCT-effekt att döda cancerceller som tunga partiklar och att deponera det mesta av sin energi i de borhaltiga cancercellerna, dagen före bestrålning, tillsätt borleveransmedel till cellodlingsmediet – t.ex., 10BPA, 4-Borono-L-fenylalanin (10 μg 10B/mL, 0,925 mM slutlig) 12–16 h (maximalt upptag av bor) före bestrålningen, som tidigare studerats för tjocktarmscancerceller och sköldkörtelcancerceller20,21.
OBS: Om du använder en annan cellinje, för vilken det inte finns några data för BNCT-studie, testa borupptaget för varje cellinje för att uppnå optimal borkoncentration. Mät 10BPA cellulärt upptag med induktivt kopplad plasmaoptisk emissionsspektroskopi (ICP-OES) enligt Dagrosa grupp21. - Efter 12-16 h bor leverans, aspirera mediet och tvätta cellerna med 10 ml 1x PBS. Försök sedan med att sammanfoga cellerna genom att lägga till 2 ml Trypsin-EDTA-lösning till cellerna och inkubera i 5 min vid 37 °C för att förbättra cellavlossningen. När cellerna börjar lossna, stoppa trypsin-åtgärden genom att lägga till 10 ml komplett medium.
- Aspirera cellupphängningen i 15 ml-röret och räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare genom att tillsätta 10 μL av 0,4% trypan blå till 10 μL celler, blanda och aliquoting 10 μL på en räkningsbild. Späd cellfjädringen till en koncentration av 1 x 106 celler/ml av mediet. Alikvot 1 ml av cellfjädringen per kryotube.
- Förbered termoluminescerande dosimetrar (TLD) för mätning av gammablixt och guldfolie för neutronfluensor och fäst TLDs på kryotuberna eller cellodlingskolven före bestrålningen.
- Bestrå ut 1 x 106 celler/ml med neutronblandad stråle vid rekommenderat minimalt termiskt neutronflöde på 5,9 x 1011 (n/cm-2 min−1)4 i kulturflaskor eller kryotuber beroende på anläggningens kapacitet.
OBS: Ställ in tiden för bestrålning innan du får rekommenderat neutronflöde. - Efter bestrålning, utsäde 1 ml bestrålade celler (1 x 106 celler/ml) på 22 x 22 mm täcken i 35 mm Petriskålar eller 6 brunnsplattor, komplettera med 2 ml nödvändigt medium. Inkubera celler i högst 3 timmar vid 37 °C i en fuktad 5% CO2-miljö så att de kan fästas på täcken. Observera fastsättningen av celler från tid till annan under ett inverterat mikroskop med 20x mål.
OBS: För HCT-116 celler minsta densitet är 600.000 celler till utsäde. För snabb ytterligare färgning förfarande använda kammaren diabilder, minska celldensiteten därefter.
2. Fixering av celler
- Efter bestrålning och inkubation av celler, ta bort mediet från de bifogade cellerna och tvätta cellerna en gång med 2,5 ml PBS.
- Fix celler med 1 ml 70% etanol för 10 min på RT.
Obs: Alternativt använda 1%-3,7% paraformaldehyd (PFA) för fixering som rekommenderas tidigare19. Protokollet pausas här. Förvara fasta celler i etanol i en frys vid -20 °C i högst några veckor för ytterligare analys och immunofluorescensfärgning.
3. Permeabilisering av celler
- Efter fixering avlägsna etanol från petriskålen och tvätta med 2,5 ml 1x PBS.
OBS: Låt inte cellerna torka mellan sköljstegen. - Tillsätt försiktigt 1 ml 0,2 % av Triton X-100/PBS för att täcka täcken med celler i petriskålar.
- Inkubera i 5 min på RT.
- Tvätta cellerna 3x med 2,5 ml 1x PBS.
OBS: Öka andelen Triton X-100 i PBS upp till 0,5% om det behövs (mer högborgslig detekterbar, beroende på den testade cellinjen). Utför ytterligare tvättar med PBST (PBS med 0,5% Interpolering) för att undvika ospecifik bindning. - Block permeabilization steg med 1 ml 2% BSA (Bovin Serum Fraction V albumin) utspädd i PBS och inkubera i minst 30 min eller 1 h med 1% BSA.
OBS: Detta steg kan utelämnas och är beroende av vilken typ av antikropp som används. Alternativt kan du använda 5 % FBS enligt rekommendationen i ref4.
4. Immunofluorescensfärgning
- Tillsätt rätt mängd primär antikropp (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs och Anti-Rad52) utspädd i PBS med BSA (2% Bovinum serumfraktion V albumin) som rekommenderas (se tabell 1 med rekommenderade utspädningar) (100 μL behövs per prov).
| Primär antikropp | Funktion | Rekommenderad utspädning | lagring [°C] |
| Anti-ɣ-H2AX | upptäckt av DNA-DSB | 01:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-pkcs | detektion av RIFs av DNA-PKcs protein som tillhör NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | detektion av RIFs av Rad52-protein som tillhör HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Sekundär antikropp | Ovetande | ||
| anti-mus IgG FITC | ɣ-H2AX högborgar | 01:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Get Anti-Kanin IgG H & L (Alexa Fluor 488) | för NHEJ och HRR reparation proteiner foci | 01:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tabell 1: Rekommenderade utspädningar och anmärkningar för användning av antikroppar som används i avsnitt 4.
- Täck petriskålen för att bibehålla luftfuktigheten i en plastlåda med återfuktad lignin med destillerat vatten och inkubera i 30 min vid 37 °C i inkubatorn.
Protokollet kan pausas här. Inkubation kan utföras vid 4 °C för över natten. - Efter inkubation utföra 3 tvättar med 2,5 ml PBS.
OBS: Låt inte rutschkanan torka under sköljstegen. - Tillsätt rätt mängd sekundär antikropp (antimus IgG FITC, Get Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) utspädd i PBS med BSA (se tabell 1) (100 μL behövs per prov). För detta och följande steg fungerar i mörkret.
- Täck petriskålen igen för att bibehålla luftfuktigheten i en plastlåda med återfuktad lignin och inkubera i minst 30 min vid 37 °C i inkubatorn.
- Efter inkubation utföra 3 tvättar med 2,5 ml PBS.
- Tillsätt 100 μl DAPI utspädd i PBS till en slutlig koncentration på 1 μg/ml för att motverka kärnorna.
- Inkubera inom kort, i högst 2 min vid RT.
- Efter inkubation utföra 3 tvättar med 2,5 ml PBS.
- Ta bort PBS och försiktigt sätta ett täckslip på toppen av monteringsmediet, undvika bildandet av luftbubblor och tätningskanter av täcken med nagellack. Vänta tills lacken torkar och måla täcket runt.
- Vänta på härdning av monteringsmediet (upp till 3 h) före bildanalys under fluorescensmikroskopi.
Protokollet kan pausas här. Förvara glasglas i en plastlåda vid 4 °C i mörker.
5. Bildförvärv och analys
- Förvärva bilder med fluorescensmikroskop under 100x mål med nedsänkningsolja.
- Analysera foci i kärnorna med ett fluorescensmikroskop utrustat med följande filter för: Alexa Fluor 488: excitation,emission (nm): 496/519, utsläpp färggrön; DAPI: excitation/emission (nm): 358/461, utsläpp färgar blått.
OBS: Analys av DSB längs enpartikelspår kan kräva avancerad mikroskopi som konfokal laserscanningsmikroskopi med högre upplösning.
- Analysera foci i kärnorna med ett fluorescensmikroskop utrustat med följande filter för: Alexa Fluor 488: excitation,emission (nm): 496/519, utsläpp färggrön; DAPI: excitation/emission (nm): 358/461, utsläpp färgar blått.
- Spara förvärvade bilder och processer med lämplig bildhanteringsprogram,3,20t.ex.
OBS: Användning av enskilda makron och plugins som utvecklats för automatisk analys eller utveckling / inköp av enskilda bioinformatiska programvara rekommenderas. - Om du använder Image-Pro-programvara för foci-analys, bearbetar bilder i TIFF-filer: välj Räkna/storleksknapp och sedan på Typer [välj typ av mätning (t.ex. diameter eller område)], klicka på Intervall [mätintervall], klicka på Dela objekt om det behövs. Om du vill justera ljusstyrkan klickar du på Ljus [justera treshold]. Klicka sedan på Räkna [röd knapp].
- Om du vill exportera data klickar du på Datatabell | Statistik | Exportera till Excel. Rita grafer med den statistiska analys som krävs i kalkylprogrammet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För det första utförde vi en analys av en standardmarkör för detektion av DNA-DSBs, γH2AX foci i kolon cancerceller, icke-utstrålade och bestrålade med neutron-blandade strålen. γ-H2AX foci visas som distinkta fluorescerande prickar och visar bildandet av DNA-DSB (eftersom varje γ-H2AX lysrör representerar en enda DSB) (se figur 1).
Figur 1: Representativa bilder av mönster av γ-H2AX foci i koloncancerceller i cellinjen HCT-116 (utan strålning) och efter neutronblandad strålbestrålning. Neutronblandad strålbestrålning utfördes med en dos på 2,6 Gy i celler som behandlades dagen innan med BPA (N+BPA). (A) Den vänstra panelen representerar DAPI-färgning av kärnor. Den högra panelen, grön foci (Alexa 488), motsvarar immunodetection av γ-H2AX. Den gula pilen indikerar spår av α-partikel som korsar kärnan (skalstång = 10 μm). B)Representativa diagram som illustrerar den observerade ökningen av storleken på radioinducerade högborgar. Medelvärdet av γ-H2AX foci diameter utfördes automatiskt av Image-Pro programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Intressant, i bestrålade celler med neutronblandad stråle (N+BPA) vid en dos av cirka 2,6 Gy (1,33 Gy (γ) + 1,26 Gy (N)), observerade vi högre diameter nivåer av γ-H2AX foci (figur 1B). Dessutom upptäcktes ett enda spår av hög LET α-partikel (på grund av BNCT-kärnreaktion) som korsade cellkärnorna (gul pil) (figur 1A). Olika typer av strålning kan orsaka olika effekter: ju högre LET-strålning, desto mer komplex DNA-DSB, desto större är γ-H2AX foci och de högre nivåerna av reparationsproteiner synliga som strålningsinducerade foci18.
Därför testade vi nivåer av representativa reparation proteiner av DNA-PKcs (från NHEJ reparation väg) och Rad52 (från HR väg) genom immunofluorescensmikroskopi under samma förhållanden, som inte utfördes tidigare när det gäller BNCT balk. Vi kunde upptäcka det höga medelvärdet av foci diametern av DNA-PKcs vid DNA-pauser efter en neutron-blandas i jämförelse med kontrollceller (ingen strålning) (se figur 2).
Figur 2: Representativa bilder av dna-pkcs- och rad52-reparationsfoci i tjocktarmscancerceller i cellinjen HCT-116 (utan strålning) och efter neutronblandad strålbestrålning. Neutronblandad strålbestrålning utfördes med en dos på 2,6 Gy i celler som behandlades dagen innan med BPA (N+BPA). (A) Den vänstra panelen representerar DAPI-färgning av kärnor. Den mellersta panelen representerar detektion av strålning-inducerad högborgar. Den högra panelen är den kopplade bilden. B)Representativa diagram som illustrerar den observerade ökningen av storleken på radioinducerade högborgar. Medelvärdet för Rad52 och DNA-PKcs foci diameter utfördes automatiskt med hjälp av bildanalys programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I detta fall har vi observerat klustrade DNA-DSBs i bestrålade HCT-116 celler av neutron-blandade strålen som DNA-PKcs är specifik för mer komplexa högborgar. I bestrålade celler, genom neutronblandad stråle, observerades dessa högborgar endast inom cellkärnan som mer komplex, större och klustrade med högre intensitet (figur 2A,B). När det gäller Rad52 var effekten inte lika stark som för DNA-PKcs som anger NHEJ-vägens dominans i denna typ av strålning. Dessutom, baserat på litteraturdata, komplexa DSBs långsamt repareras och DNA-PKcs endast rekryteras till längre livslängd komplexa DSBs som visar att neutron-blandade strålen leder till bildandet av komplexa DSBs och reparation genom DNA-PKcs, men mer forskning behövs på molekylär nivå för att bekräfta dessa tidigare erhållna resultat22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frekvenserna av högborgar, immunokemiskt färgade för γ-H2AX och 53BP1 används ofta i radiobiologi och är associerade med DNA-DSB-nummer och betraktas som effektiva och känsliga markörer för övervakning av induktion och reparation av DNA-DSB19. Co-staining-proceduren för γ-H2AX och 53BP1 är ett standardförfarande för detektion av DNA-DSB. Bildandet av γ-H2AX foci är associerad med rekrytering av 53BP1, en regulator av DNA-skadehantering23. Olika cellinjer kan dock variera i bakgrundsnivåerna för γ-H2AX /53BP1 foci 11. Det har visat sig att γ-H2AX foci lockar reparationsfaktorer18, ackumulera en högre koncentration av reparationsproteiner nära en DSB-anläggning. Ju mer komplexa DNA-DSB: er, desto större är γ-H2AX foci och desto högre nivåer av reparationsproteiner. Det aktiverar en kaskad av reparation vägar, om reparationsfaktorer ackumuleras i en högre koncentration i en DSB plats, de är lätt att upptäcka med hjälp av specifika antikroppar och det föreslagna protokollet tillåter dem att visualiseras lätt. Här visar vi en metod för att studera de biologiska effekterna på cellnivå för BNCT terapi effekterna av neutron-blandade strålen på DNA reparation med hjälp av immunfluorescens teknik i mänskliga kolon cancerceller. Författarna utvecklat och infört steg-för-steg tillförlitlig protokoll med specifika antikroppar för att upptäcka DNA reparation vägar baserat på immunofluorescent färgning med en antikropp som är specifik för reparation faktorer från NHEJ och HRR väg och observerade strålning-inducerad foci (RIF). Dessutom föreslår författarna användning av HCT-116 kolon cancer cellinje som en standard cellinje för DNA-skador analys och som en kontroll cellinje för test av DNA reparation antikroppar eftersom denna cellinje är i sig rik på DSBs högborgar. DNA-DSBs är lätta att upptäcka, och olika cellinjer, särskilt cancerceller som livmoderhalscancer cellinjen representerar olika bakgrundsnivåer av H2AX foci, och intensitet24.
Det finns två viktiga kritiska steg i protokollet, fixering av celler och immunstainning förfarande. Författarna rekommenderar fixering av celler i 70% etanol eftersom det bevarar celler under lång tid, och det inkuberas i frysen inte mer än några veckor. Det här steget är också kritiskt eftersom detta kan pausas efter att bestrålningsproceduren har utförts t.ex. Ett annat kritiskt steg är den korrekta koncentrationen av antikroppen. Författarna har fäst i tabellen de testade koncentrationerna av primära och sekundära antikroppar.
Det presenterade förfarandet ger ett steg-för-steg-protokoll för att få tillförlitliga resultat, men vissa parametrar kan ändra resultaten av experimenten, som rätt val av antikroppar som används, olika reagenser som används för fixering och permeabilisering steg, tid för inkubationer, kritisk andel av reagenser, tvättsteg, arbete i mörker, och rätt fluorescerande mikroskop. Författarna förklarar hur man får tillförlitliga och repeterbara resultat i anteckningarna.
En mindre begränsning av denna teknik är att ha tillgång till strålkällan som neutronkälla, men protokollet kan användas som ett allmänt protokoll för detektion av DNA-reparationsvägar som erhållits efter olika typer av strålning och kan behandlas som universellt protokoll för olika typer av strålning, t.ex.
Vi tillhandahåller en universell, färdig att använda metod som kan användas på cellnivå för att analysera biologiska effekter i samband med BNCT-behandling. I BNCT bestrålas icke-radioaktiva bor-10 (t.ex. efter behandling med 4-Borono-L-fenylalanin, BPA – boreleveransmedel) med termiska neutroner med låg energi och som ett resultat av kärnreaktionsfabe partiklar och litium-7 kärnor med hög LET produceras25,,26. Därför kan vårt protokoll vara användbart för analys av biologiska effekter på cellnivå även för strålning som representeras av andra höga LET balkar som protoner som används i protonstråle terapi27, och kol-joner som används i hadron terapi28. Vi har observerat att mer detaljerad forskning behövs inom området hög-LET strålning och blandade strålar, och kunskap om DNA reparationsprocessen krävs för att utveckla effektiva anti-cancer terapier, därför har vi utvecklat ett protokoll som gör det möjligt att forska strålning-inducerad DNA-skador svar aktiveras av neutron-blandade strålen. Dessutom kan immunofluorescensmetoden för detektion av DNA-skador svar och DNA reparation vara en potentiell metod för att bedöma och detektion av tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Neutronblandad stråle bestående av neutron/gammastrålning kom åt från Marias forskningsreaktor vid Nationellt centrum för kärnforskning i Polen. K.M.O. stöddes av National Science Centre, Polen (Miniatura 2) grant no. #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , Springer. Tokyo. 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M.
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , geaa011 (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), Basel. 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), Basel. 66 (2017).
