Summary
Este protocolo permite a preparação de seções transversais de sementes de cereal (por exemplo, arroz) para a análise da morfologia do endosperma e do grânulo de amido usando microscopia eletrônica de varredura.
Abstract
Os grânulos de amido (SGs) exibem diferentes morfologias dependendo da espécie vegetal, especialmente no endosperma da família Poaceae. O fenotismo endosperm pode ser usado para classificar genótipos baseados no morótipo SG usando a análise microscópica eletrônica de varredura (SEM). Os SGs podem ser visualizados usando SEM cortando através do kernel (pericarp, camadas de aleurone e endosperm) e expondo o conteúdo organellar. Os métodos atuais exigem que o grão de arroz seja embutido em resina plástica e seccionado usando um microtome ou embutido em uma ponta de pipeta truncada e seccionado à mão usando uma lâmina de barbear. O método anterior requer equipamentos especializados e é demorado, enquanto este apresenta uma nova série de problemas dependendo do genótipo do arroz. As variedades de arroz chalky, particularmente, representam um problema para este tipo de secção devido à natureza friável de seu tecido endosperm. Apresentada aqui é uma técnica para preparar seções de grãos de arroz translúcidos e calcâneos para microscopia, exigindo apenas pontas de pipeta e uma lâmina de bisturi. Preparar as seções dentro dos limites de uma ponta de pipeta evita que o endosperm do grão de arroz se quebre (para fenótipos translúcidos ou 'vítreos' ) e desmorone (para fenótipos chalky). Utilizando esta técnica, pode-se observar a padronização celular endosperm e a estrutura de SGs intactas.
Introduction
Os grânulos de amido (SGs) apresentam diferentes morfologias dependendo da espécie vegetal, especialmente no endosperma da família Poaceae 1,2. Fenotipos de endosperm podem ser usados para classificar genótipos baseados no fenótipo SG usando análise microscópica eletrônica de varredura. Os SGs podem ser visualizados usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) cortando o kernel e afastando as paredes celulares endosperm2.
O objetivo desta técnica é preparar facilmente seções transversais de grãos de arroz apenas para a rápida análise sem. O desenvolvimento dessa técnica foi motivado pela necessidade de uma abordagem transversal rápida em que as amostras são preparadas para microscopia SEM imediatamente antes da visualização utilizando equipamentos mínimos.
Esta técnica envolve a inserção do grão de arroz cascado na ponta da pipeta para a imobilização completa. Isso é particularmente importante quando seção transversal fenótipos de grão de arroz chalky, que são friáveis e facilmente desmoronam sob pressão3. A calcidez é uma qualidade indesejável no arroz, pois afeta o aparecimento do grão e faz com que o kernel quebre facilmente durante o polimento e moagem3. Chalkiness apresenta-se como uma área opaca em uma seção transversal do kernel que pode ser observada a olho nu; no nível microscópico, a chalkiness é caracterizada por pequenos grânulos de amido embalados. As causas da chalkiness podem sergenéticas 4,5 ou ambientais6,7.
As seções transversais de sementes de cereal têm sido tradicionalmente preparadas usando métodos de fixação química e secção após a incorporação da amostra em cera de parafina ou outra matriz sólida4,8,9,10. Em 2010, o método Matsushima foi introduzido como uma forma de evitar a preparação complicada e demorada da amostra de grãos de arroz4. Este método envolveu a inserção do grão de arroz cascado em uma ponta de pipeta truncada. A ponta é mantida estacionária por um aparador de blocos, e seções finas e parciais de endospermia são colhidas usando uma lâmina de barbear portátil. Outra técnica rápida desenvolvida em 2016 permitiu a secção integral fina de uma grande variedade de sementes secas, incluindo variedades de calcinhas10. Esses métodos motivaram o desenvolvimento da técnica rápida aqui apresentada.
Esta nova técnica é apropriada para pesquisadores que desejam obter seções transversais intactas de grãos de arroz para fenotipagem e endosperma e análise de morfologia de amido usando SEM.
Este protocolo representa uma adaptação do método de ponta de pipeta truncada de Matsushima4, com várias modificações notáveis: (1) os grãos não são absorvidos em nenhum ponto da técnica; (2) nem um aparador de blocos nem um ultramicrotome são necessários para preparar as seções. Um tipo selvagem de cultivar 'translúcido'(Oryza sativa L. sp. japonica cv. Nipponbare) e uma linha "chalky" mutagenizada de Nipponbare(ssg1, grão de amido subpadrão1)4 foram examinados neste estudo. Estas duas cultivares foram selecionadas para a análise aqui para demonstrar as diferenças técnicas e visuais no processamento de seções de arroz translúcida e chalky.
Protocol
1. Preparação da seção de arroz transversal
- De-casca seca, grãos intactos como mostrado na Figura 1A.
- Solte as cascas e os grãos de arroz desemarante, moendo os grãos entre duas rolhas de borracha planas. Retire os grãos de arroz husked do pânico, se necessário.
- Coloque um único kernel em uma rolha de borracha plana em um banco de trabalho(Figura 1B). Certifique-se de que esta rolha permanece estacionária.
- Use uma segunda rolha de borracha plana(Figura 1C) para abrasar o kernel torcendo-o contra a primeira rolha de borracha, usando pressão suficiente(Figura 1D). Remova as cascas do kernel, tomando cuidado para não quebrar o endosperm. Remova qualquer casca restante usando fórceps finos. Um kernel desalmado é mostrado na Figura 1E.
- Utilizando fórceps finos, insira um kernel lacaado individual em uma ponta de pipeta de plástico (tamanho de 250 μL, uma semente/ponta)(Figura 1F). Certifique-se de que a extremidade do embrião do kernel está voltada para a extremidade (cônica) da ponta da pipeta(Figura 1G).
NOTA: Inserir o kernel desta forma garante que o kernel se encaixe o mais feio possível na ponta da pipeta, pois o kernel é mais estreito em direção à extremidade proximal. - Insira uma segunda ponta de pipeta de 250 μL para forçar o kernel na ponta da pipeta e mantenha o kernel imóvel durante a secção, tomando cuidado para não danificar o kernel ou dobrar a segunda ponta pipeta(Figura 1H). O conjunto adequado do "telescópio" é indicado na Figura 1I.
- Coloque a montagem da ponta da pipeta plana em um banco de trabalho e segure no lugar à mão(Figura 1J). Por outro lado, use uma lâmina de bisturi afiada (nº 20) para cortar o centro do kernel e cortar a ponta da pipeta(Figura 1K). Utilizando o bisturi corte 1 mm de espessura do grão de arroz(Figura 1L).
NOTA: A seção do kernel está bem fechada dentro de um anulo de plástico(Figura 1M). A espessura média da seção para três genótipos exemplares são encontradas na Tabela 1. Seções significativamente mais finas que 1 mm vão quebrar ou desmoronar. É importante notar a partir de que parte do kernel cada seção se origina se este experimento está sendo realizado em várias variedades de arroz para comparação, pois a morfologia do amido varia ao longo do endosperm11.
2. Microscopia de luz refletida de seções de arroz transversal
- Use fórceps finos para colocar as seções de arroz transversais (preparadas na seção 1) em um pedaço preto de papel preto de bitola pesada.
- Obtenha imagens leves de seções transversais de Nipponbare usando um estereótipo com pescoços de ganso montados para iluminação oblíqua, como mostrado na Figura 1N-S.
- Observe a morfologia do endosperma sob pelo menos 10x de ampliação.
NOTA: Qualquer fonte epileve é preferível à microscopia de campo brilhante, pois as seções obtidas usando esta técnica não são finas o suficiente para que a luz passe.
3. Escaneamento de microscopia eletrônica de seções de arroz transversal
- Coloque as amostras em um disco de carbono preso a um stub de alumínio e coloque em um suporte de amostra de redução de carga. Remova o anel plástico do suporte da ponta da pipeta usando fórceps finos para evitar que o plástico entre no aparelho de vácuo do SEM.
NOTA: Imagens de células endosperm, SGs e subgranules são obtidas usando uma máquina SEM desktop que não requer amostras para serem revestidas de sputter. - Obtenha as imagens usando um detector de elétrons backscatter (BSE) de alta sensibilidade a 10 kV.
Representative Results
As seções Nipponbare(Figura 2A) e ssg1 (Figura 2B)foram examinadas sob três ampliações: 260x, 920x e 4200x. Esta técnica permite a preparação de seções de qualidade suficiente para observar toda a célula endosperm (Figura 3A),grânulos compostos de amido(Figura 3B)e subgranules individuais(Figura 3C). Os grãos husked demoram mais tempo para processar do que os grãos polidos, pois os cascos secos precisam ser removidos por abrasão antes da secção. Os grãos chalky também demoram mais para processar do que os núcleos translúcidos polidos, pois deve-se tomar cuidado para não quebrar o kernel durante a secção. Uma seção de arroz devidamente preparada deve ter aproximadamente 0,9 mm de espessura(Tabela 1)com mínima a nenhuma quebra do endosperma(Figura 1N) e camadas intactas de pericarp e aleurone(Figura 1O). Colocação inadequada do bisturi na ponta da pipeta ao separar pode levar a seções 'lascadas'(Figura 1P). Da mesma forma, imagens de campo brilhante de seções transversais ideais de ssg1 (Figura 1Q) demonstraram camadas intactas de endosperm, pericarp e aleurone intactas e disponíveis para visualização(Figura 1R). Uma seção de kernel calcária quebrada(Figura 1S) ainda pode ser utilizável para visualização se o único propósito é observar os SGs, mas o padrão celular endosperm não será visível. Uma seção quebrada pode ser difícil de manusear para análise. Mais corte de paredes celulares endosperm foi observado no tipo selvagem Nipponbare, já que as células são mais apertadas e menos friáveis do que os grãos ssg1. Não foi observada a tesoura das células de endosperm nas seções ssg1 e os grânulos compostos de amido estão intactos.
A Figura S1 demonstra a confiabilidade dos resultados usando a técnica do "telescópio" para seção de grãos de arroz. Linhas de arroz identificadas como produtores de kernel translúcidos – tipo selvagem Amido Resistente (RS) linha híbrida Xieyou 7954(Oryza sativa L. ssp. indica)12,13,14 (Figura S1A) e mutante gerado por cobalto RS11113,15 (Figura S1B) produziram seções através das quais a luz era visível usando estereoscópio amico. As imagens SEM correspondentes revelaram que essas linhas produzem o fenótipo de endosperma de arroz 'normal': grânulos de amido poliédrico bem embalados. Os produtores de kernel chalky, a variedade comercial Yi-Tang16 (Figura S1C) e RS413, um mutante de RS11115 (Figura S1D),exibiram seções brancas e opacas do kernel. As imagens SEM correspondentes exibiam morfologia marcadamente diferente em comparação com a linha de fundo RS translúcida do tipo selvagem: grânulos de amido eram redondos e vagamente embalados. Tipo selvagem Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (Figura S1E) e seu mutante, KMD1 (Kemingdao1), que expressam o gene Cry1Ab para inibir a predação de insetos17,18,19 (Figura S1F) exibiram seções e morótipos de endosperm semelhantes às linhas translúcidas de RS.
A técnica aqui apresentada é ideal para o preparo de amostras de grãos de arroz do tipo chalky para análise fenotípica, mas também oferece vantagens para a secção de fenótipos translúcidos do grão de arroz20: cortar as amostras usando pressão acima reduz o risco de quebra do endosperm e deslocamento. As amostras podem ser facilmente preparadas em segundos(Tabela 2). Vários genótipos foram analisados utilizando essa técnica para testar sua eficácia(Tabela 3). Como mostrado na Figura S2,esta técnica pode ser aplicada às sementes de outras espécies. O modelo monococo brachypodium distachyon produz sementes muito duras contendo apenas amido de b-granulo21, que carece de puraindolina A, uma proteína que confere maciez aos grânulos de amido22. Ainda era possível obter uma seção transversal intacta(Figura S2A). A obtenção de uma seção transversal intacta do trigo branco macio de inverno (SWWW) foi desafiadora, mas pode ser realizada(Figura S2B). As sementes SWWW são ricas em puroindolina A e grandes quando comparadas com sementes de B. distachyon e grãos de arroz. Estas sementes desmoronam frequentemente ao seção usando o conjunto do telescópio.
| Genótipo | Largura média da seção (μm) usando conjunto de telescópios | Largura de seção média (μm) seção à mão livre |
| Nipponbare (casca) | 971,7 ± 152,4ab | 1059.571 ± 394,2ab |
| Xieyou 7954 | 825,1 ± 128,3b | 1306.187 ± 179,1a |
| RS4 | 910,6 ± 165,0ab | 1126.694 ± 395,3ab |
| Os meios seguidos pelas mesmas letras não são significativamente diferentes em P < 0,01 usando uma análise unidirecional de variância (ANOVA) e teste de Tukey (n = 10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software JMP 15. | ||
Tabela 1: Espessura média da seção do kernel.
| Genótipo | Tempo médio (s)* |
| Nipponbare (casca) | 14,7 ± 1,36a |
| Xieyou 7954 | 9.81 ± 0,98b |
| RS4 | 11,9 ± 1,28c |
| *Usando o conjunto do telescópio. | |
| Os meios seguidos pelas mesmas letras não são significativamente diferentes em P < 0,01 usando uma análise unidirecional de variância (ANOVA) e teste de Tukey (n = 10). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software JMP 15. | |
Tabela 2: Tempo médio de preparação da amostra.
| Genótipo | Fundo | Qualidade |
| Nipponbare | Tipo selvagem | Translúcido |
| Grão de amido abaixo do padrão1 (ssg1) | Nipponbare | Chalky |
| Amido resistente (RS) Xieyou 7954 | Tipo selvagem | Translúcido |
| RS111 | Xieyou 7954 | Translúcido |
| RS4 | RS111 | Chalky |
| Yi-Tang, 'New Life', marca Lujuren | Xieyou 7954 | Chalky |
| Xiushui | Tipo selvagem | Translúcido |
| Kemingdao1 (KMD1) | Xiushui | Translúcido |
Tabela 3: Genótipos de arroz examinados neste estudo.
Figura 1: Preparação de seções de arroz transversal. (A) Kernel nipponbare tipo selvagem com casca intacta. (B). Kernel colocado em uma rolha de borracha de quatro polegadas plana. (C) As cascas foram removidas moendo o kernel entre duas rolhas de borracha que apirem. (D) A casca foi separada do grão de arroz. (E) Close-up do grão de arroz husked. O fim do embrião é indicado. (F) Inserção do kernel na ponta da pipeta usando fórceps finos. (G) O kernel foi alojado na extremidade distal da ponta da pipeta. (H) Inserção da segunda ponta de pipeta para imobilizar o kernel para secção (o conjunto 'telescópio'). (I) O grão de arroz foi instalado de forma confortável na extremidade distal da ponta da pipeta. (J) Secção do grão de arroz dentro da montagem. (K) Close-up da seção cortada. (L) Uma seção do kernel fechado pelo anulo plástico. (M) Close-up da seção transversal. (N) Seção transversal do tipo selvagem Nipponbare. (O) Close-up do endosperm dentro da seção nipponbare tipo selvagem. (P) Pobre, seção subótimal do núcleo nipponbare tipo selvagem. (Q) Seção transversal do mutante Nipponbare ssg14. (R) Close-up do endosperm dentro da seção ssg1. (S) Pobre, seção subótimal do ssg1. Barra (painéis A, N-S) = 1 mm. Grãos de arroz inteiros e seções foram imagens usando um estereómico com uma câmera de zoom digital e luzes de pescoço de ganso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens SEM de seções de kernel transversais. (A) Tipo selvagem Nipponbare, uma cultivar translúcida. Os grânulos compostos de amido foram cimentados firmemente um para o outro; (B) Nipponbare mutante ssg14, um fenótipo chalky. Os grânulos compostos de amido estavam vagamente embalados e não têm a natureza cimentiosa do tipo selvagem nipponbare amido morphótipo. Ampliação da esquerda para a direita: 260x, 920x e 4200x. O comprimento da barra é indicado em painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Anatomia microscópica SEM de uma seção de kernel transversal de Xiushui 11. (A) Uma única célula endospermia é delineada em vermelho. Ampliação de 260x. (B) Um grânulo composto de amido é delineado em vermelho. Ampliação de 920x. (C) Subgrões de amido múltiplos são delineados em vermelho. Ampliação de 2250x. Os comprimentos da barra são indicados nos painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S1: Seções transversais de outros genótipos de arroz preparados para SEM utilizando esta técnica. (A) Amido Resistente (RS) Xieyou 795412. (B) RS111, um mutante transparente de alta RS de 795413. (C) RS4, um mutante chalky de RS11115. Yi-Tang, uma variedade comercial de arroz de alta amilose16. Xiushui 11. (F) KMD1 (Kemingdao1)17,18,19. Ampliação de 10x para imagens de campo brilhante. Barra branca = 1 mm. 2250x de ampliação para imagens SEM. Os comprimentos da barra são indicados nos painéis. Clique aqui para baixar este número.
Figura S2: A técnica é útil para outras sementes. (A) Seção transversal de falso brome roxo(Brachypodium distachyon L. adesão Bd21) semente. (B) Seção transversal de trigo branco macio de inverno(Triticum aestivum L. cv. Augusta) semente. Campo brilhante, ampliação de 20x. Barra = 1 mm. Clique aqui para baixar este número.
Discussion
A técnica aqui apresentada representa uma abordagem rápida, simples e aguçada para preparar seções transversais de arroz transversal para visualização SEM desktop. Esta técnica de secção permite a observação rápida da estrutura do endosperma, forma celular endosperma, tamanho e padrão, grânulos compostos e morfologia do amido. Para efeitos de fenotipagem e germoplasma e endosperm, é fundamental obter uma seção transversal inteira do grão de arroz4,23,24. É primordial inserir o kernel inteiramente dentro da ponta da pipeta para evitar que a pressão da lâmina do bisturi force o endosperm a desmoronar ou quebrar. Desde que o conjunto do "telescópio" seja devidamente construído, as amostras podem ser preparadas para visualização dentro de 15 segundos(Tabela 2) empregando materiais já em mãos em um ambiente típico de laboratório. Esta técnica é aplicável à secção transversal de qualquer semente elipsoidal de aproximadamente quatro milímetros de diâmetro em seu ponto mais largo. As sementes da grama modelo Brachypodium distachyon (Figura S2A) podem ser igualmente seccionadas, mas não permanecem fechadas dentro do anulo. Sementes maiores, como trigo, fraturam facilmente e requerem cuidados ao seção(Figura S2B).
No entanto, existem várias limitações à técnica aqui apresentadas. As seções obtidas usando esta técnica não são finas o suficiente para que a luz passe, que proíbe o uso desta técnica para abordagens microscópicas baseadas em luz transmitida, como campo brilhante (espessura máxima da amostra de 500 μm para seções de grãos de arroz25) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (500 nm de espessura máxima da amostra26 ). O uso de uma ponta de pipeta como a "matriz" de secção também limita o tamanho da semente que pode ser seccionada usando esta técnica. Mais solução de problemas seria necessária para adaptar essa técnica para espécies altamente diferentes do arroz, e o tamanho da 'matriz' é limitado pelo tamanho das pontas de pipeta disponíveis para compra.
Outra vantagem distinta que esta técnica proporciona é a qualidade das amostras que podem ser produzidas a partir de grãos de arroz de fenótipo chalky. Vale ressaltar que mesmo o estudo de Matsushima admitiu que era difícil obter seções transversais utilizando esse método específico para fenótiposcalcários 4, replicados neste estudo para fins de comparação(Figura 1S). No caso deles, tornou-se necessário fixar quimicamente suas amostras de arroz calcário e incorporá-las em resina para secção. A nova técnica, em conjunto com a imagem SEM desktop, permite ao pesquisador preparar facilmente seções transversais de grãos de arroz para microscopia com mais consistência do que sem suporte à imobilização(Tabela 3).
Na nova era da fenômica e metabolômica, é importante monitorar linhas mutagenizadas e bibliotecas marcadas por transposon para entender melhor a função e a importância do amido nas sementes. Além disso, o International Rice Genebank possui mais de 130.000 adesões de arroz27. Uma técnica rápida de fenotipagem de sementes como a apresentada aqui agilizaria a classificação e amostragem para a qualidade nutricional28. Por fim, essa técnica pode ser útil à luz dos impactos das mudanças climáticas. O estresse sazonal de alta temperatura durante o enchimento de grãos já havia sido identificado como uma das principais causas de chalkiness6, mas estudos recentes implicaram o aumento das temperaturas globais no aumento da calcidez da produção de arroz7,29. Esse fenotipagem acelerada de endosperm pode ajudar a fornecer uma imagem agrícola ampla do efeito do aumento das temperaturas globais.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores são gratos à Systems for Research (SFR Corp.) pelo uso de seu instrumento Phenom ProX Desktop SEM, bem como pela assistência técnica prestada por Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) e Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculdade de Medicina da Universidade de Ottawa). O financiamento foi fornecido pelo Fundo de Inovação de Baixo Carbono (LCIF) do Ministério do Desenvolvimento Econômico, Criação de Empregos e Comércio de Ontário e Proteínas Easy Corp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
| Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
| Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
| Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
| SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
| Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
| Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
| Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |
References
- James, M. G., Denyer, K., Myers, A. M.
- Shapter, F. M., Henry, R. J., Lee, L. S. Endosperm and starch granule morphology in wild cereal relatives. Plant Genetic Resources. 6 (2), 85-97 (2008).
- Ashida, K., Iida, S., Yasui, T. Morphological, physical, and chemical properties of grain and flour from chalky rice mutants. Cereal Chemistry. 86 (2), 225-231 (2009).
- Matsushima, R., Maekawa, M., Fujita, N., Sakamoto, W. A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 728-741 (2010).
- Zhao, X., et al. Identification of stable QTLs causing chalk in rice grains in nine environments. Theoretical and Applied Genetics. 129 (1), 141-153 (2016).
- Nagato, K., Ebata, M. Effects of high temperature during ripening period on the development and the quality of rice kernels. Japanese Journal of Crop Science. 34 (1), 59-66 (1965).
- Zhao, X., Fitzgerald, M. Climate change: implications for the yield of edible rice. PLoS One. 8 (6), 66218 (2013).
- Zhao, Z. K., Mu, T. H., Zhang, M., Richel, A. Effects of high hydrostatic pressure and microbial transglutaminase treatment on structure and gelation properties of sweet potato protein. LWT - Food Science and Technology. 115, 108436 (2019).
- Feiz, L., et al. Puroindolines co-localize to the starch granule surface and increase seed bound polar lipid content. Journal of Cereal Science. 50 (1), 91-98 (2009).
- Zhao, L., Pan, T., Guo, D., Wei, C. A simple and rapid method for preparing the whole section of starchy seed to investigate the morphology and distribution of starch in different regions of seed. Plant Methods. 14 (1), 16 (2018).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Li, C., Dong, S., Li, G., Yuan, G., Dong, W. Breeding and application of the new combination of hybrid rice "Xieyou 7954". Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences). 19 (3), 179-181 (2002).
- Shu, X., Jia, L., Ye, H., Li, C., Wu, D. Slow digestion properties of rice different in resistant starch. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (16), 7552-7559 (2009).
- Zhou, H., et al. Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (45), 12844-12849 (2016).
- Yang, C. Z., et al. Starch properties of mutant rice high in resistant starch. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, 523-528 (2006).
- Zhou, Y., Zou, Y., Jiang, Y., Li, B. Detection methods for resistance starch content of Yi-Tang rice and optimization of pretreatment. Food Science and Biotechnology. 36, 416-419 (2017).
- Cheng, X., Sardana, R., Kaplan, H., Altosaar, I. Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2767-2772 (1998).
- Liu, H., et al. Rapid detection of P-35S and T-nos in genetically modified organisms by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip. Food Control. 107, 106775 (2020).
- Shu, Q., et al. Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepidopteran rice pest species. Molecular Breeding. 6 (4), 433-439 (2000).
- Lisle, A. J., Martin, M., Fitzgerald, M. A. Chalky and translucent rice grains differ in starch composition and structure and cooking properties. Cereal Chemistry. 77 (5), 627-632 (2000).
- Chen, G., et al. Dynamic development of starch granules and the regulation of starch biosynthesis in Brachypodium distachyon: comparison with common wheat and Aegilops peregrina. BMC Plant Biology. 14 (1), 198 (2014).
- Giroux, M. J., Morris, C. F. Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6262-6266 (1998).
- Matsushima, R., Hisano, H. Imaging amyloplasts in the developing endosperm of barley and rice. Scientific Reports. 9, 3745 (2019).
- Matsushima, R., et al. Amyloplast-localized SUBSTANDARD STARCH GRAIN4 protein influences the size of starch grains in rice endosperm. Plant Physiology. 164 (2), 623-636 (2014).
- Monjardino, P., et al. Development of flange and reticulate wall ingrowths in maize (Zea mays L.) endosperm transfer cells. Protoplasma. 250 (2), 495-503 (2013).
- Tizro, P., Choi, C., Khanlou, N. Sample preparation for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1897, 417-424 (2019).
- International Rice Genebank. , Available from: www.irri.org (2018).
- Liu, Q. H., Zhou, X. B., Yang, L. Q., Li, T. Effects of chalkiness on cooking, eating and nutritional qualities of rice in two indica varieties. Rice Science. 16 (2), 161-164 (2009).
- Morita, S., Wada, H., Matsue, Y. Countermeasures for heat damage in rice grain quality under climate change. Plant Production Science. 19 (1), 1-11 (2016).
