Summary
Denne protokol giver mulighed for fremstilling af tværgående dele af kornfrø (f.eks. ris) til analyse af endosperm og stivelsesgranulatmorfologi ved hjælp af scanningselektronmikroskopi.
Abstract
Stivelsesgranulat (SGs) udviser forskellige morfologier afhængigt af plantearterne, især i poaceaefamiliens endoperm. Endosperm phenotyping kan bruges til at klassificere genotyper baseret på SG morphotype ved hjælp af scanning elektron mikroskopisk (SEM) analyse. SGs kan visualiseres ved hjælp af SEM ved at skære gennem kernen (pericarp, aleuron lag, og endosperm) og udsætte organellar indhold. De nuværende metoder kræver, at riskernen indlejres i plastharpiks og er opdelt ved hjælp af en mikrotom eller indlejret i en afkortet pipettespids og sektionsopdelt i hånden ved hjælp af et barberblad. Den tidligere metode kræver specialiseret udstyr og er tidskrævende, mens sidstnævnte introducerer en ny række problemer afhængigt af risgenotype. Især kalkholdige rissorter udgør et problem for denne type afdeling på grund af deres endopermvævs friable karakter. Præsenteret her er en teknik til fremstilling af gennemsigtige og kalkholdige riskernesektioner til mikroskopi, der kun kræver pipettespidser og et skalpelblad. Ved tilberedning af sektionerne inden for rammerne af en pipettespids forhindres riskernens endoperm i at splintre (til gennemsigtige eller glasagtige' fænotyper) og smuldrende (for kalkholdige fænotyper). Ved hjælp af denne teknik kan endospermcellemønstre og strukturen af intaktegs observeres.
Introduction
Stivelsesgranulat (SGs) udviser forskellige morfologier afhængigt af plantearterne, især i endosperm af Poaceae-familien 1,2. Endosperm phenotyping kan bruges til at klassificere genotyper baseret på SG fænotype ved hjælp af scanning elektron mikroskopisk analyse. SGs kan visualiseres ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM) ved at skære kernen og lirke væk endosperm cellevægge2.
Formålet med denne teknik er nemt at forberede tværgående riskernesektioner udelukkende til den hurtige SEM-analyse. Udviklingen af denne teknik var motiveret af nødvendigheden af en hurtig tværsnit tilgang, hvor prøver er forberedt til SEM mikroskopi umiddelbart før visualisering ved hjælp af minimalt udstyr.
Denne teknik indebærer indsættelse af afskallet riskerne i pipettenspidsen for fuldstændig immobilisering. Dette er især vigtigt, når krydsafsnittet kridtet riskerne fænotyper, som er friable og let smuldre under tryk3. Chalkiness er en uønsket kvalitet i ris, da det påvirker kernens udseende og får kernen til at bryde let under polering og fræsning3. Chalkiness præsenterer som et uigennemsigtigt område i et tværsnit af kernen, der kan observeres af det blotte øje; på mikroskopisk niveau er kridtighed karakteriseret ved små, løst pakket stivelsesgranulat. Årsager til kridthed kan væregenetiske 4,5 eller miljømæssige6,7.
Krydssnit af kornfrø er traditionelt blevet fremstillet ved hjælp af kemiske fastgørelsesmetoder og indsnit efter prøveindlejring i paraffinvoks eller en anden fast matrix4,8,9,10. I 2010 blev Matsushima-metoden introduceret som en måde at undgå kompliceret og tidskrævende riskerneprøvepræparat4. Denne metode indebar indsættelse af den afskallede riskerne i en afkortet pipettespids. Spidsen holdes stationær af en bloktrimmer, og tynde, delvise endosperm sektioner høstes ved hjælp af et håndholdt barberblad. En anden hurtig teknik udviklet i 2016 tillod tynd hele afsnit af en bred vifte af tørre frø, herunder kridtede sorter10. Disse metoder motiverede udviklingen af den hurtige teknik, der præsenteres her.
Denne nye teknik er velegnet til forskere, der ønsker at opnå intakte tværgående tværsnit af riskerner til endosperm phenotyping og stivelse morfologi analyse ved hjælp af SEM.
Denne protokol repræsenterer en tilpasning af Matsushima afkortet pipettespidsmetode4med flere bemærkelsesværdige ændringer: (1) kerner er ikke imbibed på noget tidspunkt i teknikken; (2) der kræves hverken en bloktrimmer eller en ultramikrotom for at forberede sektionerne. En vild type »gennemsigtig« kultivar(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) og en mutageniseret »chalky« linje af Nipponbare (ssg1, substandard stivelseskorn1)4 blev undersøgt i denne undersøgelse. Disse to sorter blev udvalgt til analysen her for at demonstrere de tekniske og visuelle forskelle i forarbejdningen gennemskinnelige og kridtagtige ris sektioner.
Protocol
1. Forberedelse af tværgående ris sektion
- Tørre, intakte kerner som vist i figur 1A.
- Løsn skallerne og dehull riskernerne ved at slibe kernerne mellem to flade gummipropper. Fjern de afskallede riskerner fra panikken, hvis det er nødvendigt.
- Placer en enkelt kerne på en flad gummiprop på en arbejdsbænk (Figur 1B). Sørg for, at proppen forbliver stationær.
- Brug en anden flad gummiprop (Figur 1C) til at holde kernen fast ved at dreje den ind mod den første gummiprop ved hjælp af tilstrækkeligt tryk (Figur 1D). Fjern skaller fra kernen, idet du sørger for ikke at splintre endospermen. Fjern eventuelle resterende skaller ved hjælp af fine sammentak. En afskallet kerne er vist i figur 1E.
- Ved hjælp af fine sammentræd skal du indsætte en individuel afskallet kerne i en plast pipettespids (250 μL størrelse, et frø /spids) (Figur 1F). Sørg for, at kerneens fosterende vender mod den (koniske) ende af pipettespidsen (Figur 1G).
BEMÆRK: Hvis kernen indsættes på denne måde, sikres det, at kernen passer så tæt som muligt ind i pipettespidsen, da kernen er smallere mod dens proksimale ende. - Sæt endnu en 250 μL pipettespids ind for at tvinge kernen ind i pipettespidsen og holde kernen ubevægelig under indsnit, idet du sørger for ikke at beskadige kernen eller bøje den anden pipettespids (Figur 1H). Den korrekte »teleskop«-samling er angivet i figur 1I.
- Læg pipettenspidsen fladt på en arbejdsbænk, og hold den i hånden (figur 1J). Brug med den anden hånd en skarp skalpelblad (nr. 20) til at skære gennem kernens midte og skære enden af pipettespidsen af (Figur 1K). Brug skalpel skåret 1 mm tykke dele af riskernen (Figur 1L).
BEMÆRK: Kernesektionen er tæt omsluttet af en annulus af plast (Figur 1M). Gennemsnitlig sektionstykkelse for tre eksemplariske genotyper findes i tabel 1. Sektioner betydeligt tyndere end 1 mm vil splintre eller smuldre. Det er vigtigt at bemærke fra hvilken del af kernen hvert afsnit stammer, hvis dette eksperiment udføres på flere sorter af ris til sammenligning, da stivelse morfologi varierer i hele endosperm11.
2. Reflekteret lysmikroskopi af tværgående rissektioner
- Brug fine sammenkrumper til at placere de tværgående rissektioner (fremstillet i afsnit 1) på et sort stykke tungt måler sort papir.
- Få lette billeder af tværgående dele af Nipponbare ved hjælp af et stereomikroskop med monterede svanehals til skrå belysning, som vist i figur 1N-S.
- Overhold endosperm morfologi under mindst 10x forstørrelse.
BEMÆRK: Enhver epilight kilde er at foretrække frem for lyse feltmikroskopi som sektioner opnået ved hjælp af denne teknik er ikke tynde nok til, at lyset kan passere igennem.
3. Scanning elektronmikroskopi af tværgående ris sektioner
- Placer prøverne på en carbon disk fast til en aluminium stub og placere på en opladning reduktion prøve indehaveren. Fjern plastringen fra pipettespidsbeslaget ved hjælp af fine sammenkværn for at forhindre plasten i at komme ind i SEM'ens vakuumapparat.
BEMÆRK: Billeder af endospermceller, SGs og underudsigter opnås ved hjælp af en stationær SEM-maskine, der ikke kræver, at prøverne sputteres belagt. - Få fat i billederne ved hjælp af en høj følsomhed multi-mode backscatter elektron (BSE) detektor på 10 kV.
Representative Results
Afsnit af wild type Nipponbare (figur 2A) og ssg1 - afsnit (figur 2B) blev undersøgt under tre forstørrelser: 260x, 920x og 4200x. Denne teknik gør det muligt at udarbejde sektioner af tilstrækkelig kvalitet til at observere hele endospermcellen (figur 3A), granuler af sammensat stivelse (figur 3B) og individuelle undergranler (figur 3C). Afskallede kerner tager længere tid at behandle end polerede kerner, da det tørre skrog skal fjernes ved slid før indskæring. Chalky kerner også tage længere tid at behandle end polerede gennemsigtige kerner, som skal sørge for ikke at splintre kernen under indsnitning. En korrekt forberedt rissektion skal være ca. 0,9 mm tyk(tabel 1) med minimal til ingen brud på endospermen (Figur 1N) og intakte pericarp- og aleuronlag (figur 1O). Forkert placering af skalpellen på pipettespidsen, når afsnittene kan føre til 'tilhuggede' sektioner (Figur 1P). På samme måde viste lyse feltbilleder af optimale tværgående dele af ssg1 (Figur 1Q) intakte endosperm-, pericarp- og aleuronlag intakte og tilgængelige til visualisering (Figur 1R). En brudt kridtagtig kernesektion (Figur 1S) kan stadig bruges til visualisering, hvis det eneste formål er at observere mål, men endospermcellemønster vil ikke være synligt. En ødelagt sektion kan være vanskelig at håndtere til analyse. Mere klipning af endosperm cellevægge blev observeret i vilde type Nipponbare, da cellerne er mere tæt pakket og mindre friable end ssg1 kerner. Ingen klipning af endospermceller blev observeret i ssg1 sektioner og sammensatte stivelse granulater er intakt.
Figur S1 viser pålideligheden af resultater ved hjælp af 'teleskop' teknik til at afsnit riskerner. Ris linjer identificeret som gennemskinnelige kerne producenter – vilde type Resistent Stivelse (RS) hybrid linje Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica)12,13,14 (Figur S1A) og kobolt-genereret mutant RS11113,15 (Figur S1B) produceret sektioner, hvorigennem lys var synligt ved hjælp af et stereomikroskop. De tilsvarende SEM-billeder viste, at disse linjer producerer den »normale« ris endosperm fænotype: tætpakkede, polyhedral stivelse granulat. Chalky kerne producenter, kommercielle sort Yi-Tang16 (Figur S1C) og RS413, en mutant af RS11115 (Figur S1D), udstillet hvide, uigennemsigtige kerne sektioner. De tilsvarende SEM-billeder viste markant forskellige morfologi sammenlignet med den vilde type gennemskinnelige RS-baggrundslinje: stivelsesgranulat var runde og løst pakket. Wild type Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (Figur S1E) og dens mutant, KMD1 (Kemingdao1), som udtrykker Cry1Ab genet til at hæmme insekt prædation17,18,19 ( FigurS1F) udstillet sektioner og endosperm morphotyper svarende til de gennemsigtige RS linjer.
Den teknik, der præsenteres her, er optimal til fremstilling af prøver af kridtagtige riskerner til fænotypisk analyse, men giver også fordele til at skære gennemsigtige riskernen fænotyper20: udskæring af prøverne ved hjælp af tryk ovenfra reducerer risikoen for brud på endopomsen og dislokation. Prøverne kan let tilberedes inden for få sekunder (tabel 2). Flere genotyper blev analyseret ved hjælp af denne teknik for at teste dens effektivitet (tabel 3). Som vist i figur S2kan denne teknik anvendes på frø af andre arter. Modellen monocot Brachypodium distachyon producerer meget hårde frø, der kun indeholder B-granulatstivelse21, som mangler puroindolin A, et protein, der giver blødhed til stivelse granulat22. Det var stadig muligt at opnå en intakt tværgående sektion (Figur S2A). Opnåelse af en intakt tværgående sektion fra blød hvid vinterhvede (SWWW) var udfordrende, men kan udføres (Figur S2B). SWWW frø er højt i puroindolin A og store i forhold til B. distachyon frø og riskerner. Disse frø smuldre ofte, når de deler ved hjælp af teleskopet assemblage.
| Genotype | Gennemsnitlig sektionsbredde (μm) ved hjælp af teleskopabsage | Middelsektionsbredde (μm) på frihånd |
| Nipponbare (afskallet) | 971,7 ± 152,4ab | 1059.571 ± 394,2ab |
| Xieyou 7954 | 825,1 ± 128,3b | 1306.187 ± 179,1a |
| RS4 | 910,6 ± 165,0ab | 1126.694 ± 395,3ab |
| Midler efterfulgt af de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige ved P < 0,01 ved hjælp af en envejsanalyse af varians (ANOVA) og Tukeys test (n = 10). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af JMP 15-software. | ||
Tabel 1: Gennemsnitlig kernesektionens tykkelse.
| Genotype | Gennemsnitlig tid (r)* |
| Nipponbare (afskallet) | 14.7 ± 1.36a |
| Xieyou 7954 | 9.81 ± 0,98b |
| RS4 | 11.9 ± 1.28c |
| * Ved hjælp af teleskopet samling. | |
| Midler efterfulgt af de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige ved P < 0,01 ved hjælp af en envejsanalyse af varians (ANOVA) og Tukeys test (n = 10). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af JMP 15-software. | |
Tabel 2: Gennemsnitlig forberedelsestid for prøve.
| Genotype | Baggrund | Kvalitet |
| Nipponbare | Vild type | Gennemskinnelig |
| Stivelseskorn af substandard1 (ssg1) | Nipponbare | Kridtagtige |
| Resistent stivelse (RS) Xieyou 7954 | Vild type | Gennemskinnelig |
| RS111 | Xieyou 7954 | Gennemskinnelig |
| RS4 | RS111 | Kridtagtige |
| Yi-Tang, 'New Life', Lujuren mærke | Xieyou 7954 | Kridtagtige |
| Xiushui 11 | Vild type | Gennemskinnelig |
| Kemingdao1 (KMD1) | Xiushui 11 | Gennemskinnelig |
Tabel 3: Risgenotyper, der undersøges i denne undersøgelse.
Figur 1: Forberedelse af tværgående rissektioner. (A) Wild type Nipponbare kerne med intakt skaller. (B). Kerne placeret på en flad fire-tommer diameter gummiprop. (C) Skaller blev fjernet ved at slibe kernen mellem to apposing gummipropper. (D) Husk er blevet adskilt fra riskernen. (E) Nærbillede af afskallet riskerne. Embryoden er angivet. (F) Indsættelse af kerne i pipettespidsen ved hjælp af fine sammentak. (G) Kernen blev sat ind i den distale ende af pipettespidsen. (H) Indsættelse af den anden pipettespids for at immobilisere kernen til indsnit (teleskopets samling). (I) Riskernen blev monteret tæt ind i den distale ende af pipettespidsen. (J) 4 1) 1) 1985, punkt 1.3.100 (K) Nærbillede af sektionssnittet. (L) En del af kernen omgivet af plast annulus. (M) Nærbillede af den tværgående sektion. (N) Tværgående del af den vilde type Nipponbare. (O) Nærbillede af endospermen i den vilde type Nipponbare-sektionen. (P) Dårlig, suboptimal del af vild type Nipponbare kerne. (Q) Tværgående del af Nipponbare mutant ssg14. (R) Nærbillede af endospermen i strækningen ssg1. (S) Dårlig, suboptimal del af ssg1. Bar (paneler A, N-S) = 1 mm. Hele riskerne og sektioner blev afbildet ved hjælp af et stereomikroskop med et digitalt zoomkamera og svanehalslys. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: SEM-billeder af tværgående kernesektioner. (A) Wild type Nipponbare, en gennemsigtig kultivar. De sammensatte stivelsesgranulat blev cementeret tæt til hinanden; (B) Nipponbare mutant ssg14, en kalkholdig fænotype. Den sammensatte stivelse granulat var løst pakket og mangler cementitious karakter af vilde type Nipponbare stivelse morphotype. Forstørrelse fra venstre mod højre: 260x, 920x og 4200x. Bar længde er angivet i paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: SEM mikroskopisk anatomi af en tværgående kerne del af Xiushui 11. (A) En enkelt endospermcelle er skitseret med rødt. 260x forstørrelse. (B) Et sammensat stivelsesgranulat er beskrevet med rødt. 920x forstørrelse. (C) Flere stivelsesundergranler er beskrevet med rødt. 2250x forstørrelse. Bar længder er angivet i panelerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: Tværgående dele af andre risgenotyper, der er fremstillet til SEM ved hjælp af denne teknik. (A) Resistent stivelse (RS) Xieyou 795412. (B) RS111, en transparent mutant på høj RS på 795413. C) RS4, en kalkholdig mutant af RS11115. (D)Yi-Tang, en kommerciel række høje amylose ris16. (E) Xiushui 11. (F) KMD1 (Kemingdao1)17,18,19. 10x forstørrelse til lyse feltbilleder. Hvid bjælke = 1 mm. 2250x forstørrelse til SEM-billeder. Bar længder er angivet i panelerne. Klik her for at downloade dette tal.
Figur S2: Teknik er nyttig for andre frø. (A) Tværgående del af falsk lilla brome(Brachypodium distachyon L. tiltrædelse Bd21) frø. (B) Tværgående del af blød hvid vinterhvede(Triticum aestivum L. cv. Augusta) frø. Lyst felt, 20x forstørrelse. Bar = 1 mm. Klik her for at downloade dette tal.
Discussion
Den teknik, der præsenteres her repræsenterer en hurtig, enkel og ivrig tilgang til at forberede tværgående ris tværsnit til desktop SEM visualisering. Denne sektionsteknik giver mulighed for hurtig observation af endosperm struktur, endosperm celle form, størrelse og mønster, sammensatte granulater, og stivelse morfologi. Med henblik på endosperm phenotyping og germplasm screening, er det afgørende at opnå et helt tværsnit af riskernen4,23,24. Det er altafgørende at indsætte kernen helt i pipettespidsen for at forhindre, at skalpelbladets tryk tvinger endospermen til at smuldre eller splintre. Forudsat at 'teleskopet' assemblage er korrekt konstrueret, kan prøverne fremstilles til visualisering inden for 15 sekunder (tabel 2) med materialer, der allerede er i hånden i en typisk laboratorieindstilling. Denne teknik gælder for tværsnit af ellipsoide frø ca. fire millimeter i diameter på det bredeste punkt. Frø af modelgræs Brachypodium distachyon (Figur S2A) kan ligeledes adskilles, men forbliver ikke omgivet af annulus. Større frø, som hvede, fraktur let og kræver pleje ved indsnit (Figur S2B).
Der er dog flere begrænsninger for den teknik, der præsenteres her. Sektioner, der er fremstillet ved hjælp af denne teknik, er ikke tynde nok til, at lyset kan passere igennem, hvilket forbyder anvendelse af denne teknik til transmitterede lysbaserede mikroskopiske tilgange som lyst felt (500 μm maksimal prøvetykkelse for riskernesektioner25) og transmissionselektronmikroskopi (TEM) (500 nm maksimal prøvetykkelse26 ). Brugen af en pipettespids som afsnittet 'matrix' begrænser også størrelsen af frø, der kansektiones ved hjælp af denne teknik. Yderligere fejlfinding ville være nødvendig for at tilpasse denne teknik til arter, der er meget forskellige fra ris, og størrelsen af 'matrixen' er begrænset af størrelsen af pipettespidser, der kan købes.
En anden klar fordel, at denne teknik giver, er kvaliteten af prøver, der kan fremstilles af kalkholdige fænotype riskerner. Det er værd at bemærke, at selv Matsushima-undersøgelsen indrømmede, at det var vanskeligt at opnå tværsnit ved hjælp af denne særlige metode til kridtede fænotyper4, som replikeret i denne undersøgelse med henblik på sammenligning (Figur 1S). I deres tilfælde blev det nødvendigt at kemisk fastsætte deres kalkholdige risprøver og indlejre dem i harpiks til sektion. Den nye teknik, i forbindelse med desktop SEM imaging, gør det muligt for forskeren nemt at forberede tværgående dele af riskerner til mikroskopi med mere konsistens end uden immobilisering støtte (Tabel 3).
I den nye æra af fanomics og metabolomics er det vigtigt at overvåge mutageniserede linjer og transposon-tagged biblioteker for bedre at forstå funktionen og betydningen af stivelse i frø. Derudover har Den Internationale Ris Genebank over 130 000 ristiltrædelse27. En hurtig frø phenotyping teknik som den, der præsenteres her ville fremskynde klassificering og prøveudtagning for ernæringsmæssig kvalitet28. Endelig kan denne teknik være nyttig i lyset af de indgribende klimaændringer virkninger. Sæsonbetinget højtemperaturbelastning under kornfyldning var allerede blevet identificeret som en væsentlig årsag til kridthed6, men nylige undersøgelser har impliceret stigende globale temperaturer i at øge kridtheden af risudbyttet7,29. Sådanne fremskyndede endosperm phenotyping kan bidrage til at give et bredt landbrugsbillede af effekten af stigende globale temperaturer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Systems for Research (SFR Corp.) for brug af deres Phenom ProX Desktop SEM instrument, samt for den tekniske bistand fra Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) og Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculty of Medicine, University of Ottawa). Finansiering blev ydet af Low Carbon Innovation Fund (LCIF) fra regeringen i Ontario's Ministeriet for Økonomisk Udvikling, Jobskabelse og Handel, og Proteiner Easy Corp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
| Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
| Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
| Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
| SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
| Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
| Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
| Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |
References
- James, M. G., Denyer, K., Myers, A. M.
- Shapter, F. M., Henry, R. J., Lee, L. S. Endosperm and starch granule morphology in wild cereal relatives. Plant Genetic Resources. 6 (2), 85-97 (2008).
- Ashida, K., Iida, S., Yasui, T. Morphological, physical, and chemical properties of grain and flour from chalky rice mutants. Cereal Chemistry. 86 (2), 225-231 (2009).
- Matsushima, R., Maekawa, M., Fujita, N., Sakamoto, W. A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 728-741 (2010).
- Zhao, X., et al. Identification of stable QTLs causing chalk in rice grains in nine environments. Theoretical and Applied Genetics. 129 (1), 141-153 (2016).
- Nagato, K., Ebata, M. Effects of high temperature during ripening period on the development and the quality of rice kernels. Japanese Journal of Crop Science. 34 (1), 59-66 (1965).
- Zhao, X., Fitzgerald, M. Climate change: implications for the yield of edible rice. PLoS One. 8 (6), 66218 (2013).
- Zhao, Z. K., Mu, T. H., Zhang, M., Richel, A. Effects of high hydrostatic pressure and microbial transglutaminase treatment on structure and gelation properties of sweet potato protein. LWT - Food Science and Technology. 115, 108436 (2019).
- Feiz, L., et al. Puroindolines co-localize to the starch granule surface and increase seed bound polar lipid content. Journal of Cereal Science. 50 (1), 91-98 (2009).
- Zhao, L., Pan, T., Guo, D., Wei, C. A simple and rapid method for preparing the whole section of starchy seed to investigate the morphology and distribution of starch in different regions of seed. Plant Methods. 14 (1), 16 (2018).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Li, C., Dong, S., Li, G., Yuan, G., Dong, W. Breeding and application of the new combination of hybrid rice "Xieyou 7954". Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences). 19 (3), 179-181 (2002).
- Shu, X., Jia, L., Ye, H., Li, C., Wu, D. Slow digestion properties of rice different in resistant starch. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (16), 7552-7559 (2009).
- Zhou, H., et al. Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (45), 12844-12849 (2016).
- Yang, C. Z., et al. Starch properties of mutant rice high in resistant starch. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, 523-528 (2006).
- Zhou, Y., Zou, Y., Jiang, Y., Li, B. Detection methods for resistance starch content of Yi-Tang rice and optimization of pretreatment. Food Science and Biotechnology. 36, 416-419 (2017).
- Cheng, X., Sardana, R., Kaplan, H., Altosaar, I. Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2767-2772 (1998).
- Liu, H., et al. Rapid detection of P-35S and T-nos in genetically modified organisms by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip. Food Control. 107, 106775 (2020).
- Shu, Q., et al. Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepidopteran rice pest species. Molecular Breeding. 6 (4), 433-439 (2000).
- Lisle, A. J., Martin, M., Fitzgerald, M. A. Chalky and translucent rice grains differ in starch composition and structure and cooking properties. Cereal Chemistry. 77 (5), 627-632 (2000).
- Chen, G., et al. Dynamic development of starch granules and the regulation of starch biosynthesis in Brachypodium distachyon: comparison with common wheat and Aegilops peregrina. BMC Plant Biology. 14 (1), 198 (2014).
- Giroux, M. J., Morris, C. F. Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6262-6266 (1998).
- Matsushima, R., Hisano, H. Imaging amyloplasts in the developing endosperm of barley and rice. Scientific Reports. 9, 3745 (2019).
- Matsushima, R., et al. Amyloplast-localized SUBSTANDARD STARCH GRAIN4 protein influences the size of starch grains in rice endosperm. Plant Physiology. 164 (2), 623-636 (2014).
- Monjardino, P., et al. Development of flange and reticulate wall ingrowths in maize (Zea mays L.) endosperm transfer cells. Protoplasma. 250 (2), 495-503 (2013).
- Tizro, P., Choi, C., Khanlou, N. Sample preparation for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1897, 417-424 (2019).
- International Rice Genebank. , Available from: www.irri.org (2018).
- Liu, Q. H., Zhou, X. B., Yang, L. Q., Li, T. Effects of chalkiness on cooking, eating and nutritional qualities of rice in two indica varieties. Rice Science. 16 (2), 161-164 (2009).
- Morita, S., Wada, H., Matsue, Y. Countermeasures for heat damage in rice grain quality under climate change. Plant Production Science. 19 (1), 1-11 (2016).
