Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

Published: January 19, 2021 doi: 10.3791/61589
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Department of Biology, San Francisco State University, 2Department of Biochemistry & Biophysics, UCSF Mission Bay

Summary

يتم تقديمها هنا هو بروتوكول لmicroinject وفي وقت واحد صورة الأجنة Drosophila متعددة خلال النمو الجنيني باستخدام لوحة المستندة إلى، صورة عالية المحتوى.

Abstract

وقد أصبحت الأساليب الحديثة في التصوير الحي للخلايا الكمية أداة أساسية لاستكشاف بيولوجيا الخلايا، من خلال تمكين استخدام الإحصاءات والنمذجة الحسابية لتصنيف العمليات البيولوجية ومقارنتها. على الرغم من أن أنظمة نموذج ثقافة الخلية كبيرة للتصوير عالي المحتوى ، فإن دراسات الإنتاجية العالية لمورفولوجيا الخلايا تشير إلى أن ثقافات الخلايا الحية السابقة محدودة في تلخيص التعقيد المورفولوجي الموجود في الخلايا داخل الكائنات الحية. على هذا النحو ، هناك حاجة لنظام نموذج عالي الإنتاجية قابلة للتطوير لصورة الخلايا الحية داخل كائن حي سليم. وصف هنا هو بروتوكول لاستخدام محلل صورة عالية المحتوى للحصول في وقت واحد متعددة الوقت الفاصل الفيديو من الجنينية Drosophila التنمية الميلانوغاستر خلال مرحلة blastoderm متزامن. وقد خدم البلاستدرم المتزامن تقليديا كنموذج كبير في الجسم الحي لتصوير الأحداث البيولوجية; ومع ذلك، فإن الحصول على عدد كبير من النسخ المتماثلة التجريبية للنهج الكمية والعالية الإنتاجية كان كثيف العمالة ومحدودًا من خلال تصوير جنين واحد لكل تكرار تجريبي. هنا هو طريقة لتكييف التصوير وmicroinjection النهج لتتناسب مع نظام التصوير ذات المحتوى العالي ، أو أي مجهر مقلوب قادرة على الحصول الآلي multipoint. يتيح هذا النهج الحصول المتزامن على 6-12 جنينًا، حسب عوامل الاكتساب المرغوبة، في جلسة تصوير واحدة.

Introduction

على مدى السنوات ال 30 الماضية، تقدم التقدم في تقنيات التصوير والتحقيقات الجزيئية للتصوير بالخلايا الحية إلى الأمام فهمنا لتعقيد الخلية وعملها الداخلي. ويرافق هذا التقدم في التكنولوجيا هو زيادة الاعتماد على استخدام السابقين نماذج الخلايا الحية ثقافة للحصول على بيانات التصوير عالية الإنتاجية. توفر نماذج ثقافة الخلايا العديد من المزايا، بما في ذلك التحكم في البيئة الدقيقة من خلال أنظمة microfluidic، والقدرة على تصوير خلايا متعددة في وقت واحد، مما يتيح استخدام الأساليب الكمية اللازمة لفحص الإنتاجية العالية1،2. ومع ذلك ، هناك أيضا عيوب كبيرة مرتبطة بنماذج ثقافة الخلية في سياق الدراسات المورفولوجية ، مثل الزجاج ثنائي الأبعاد أو الأسطح البلاستيكية التي تنتج تأثيرات محيرة على مورفولوجيا الخلية وتنظيمها3،4،5. يمكن أن توفر هذه الآثار بيانات خاطئة أو مضللة فيما يتعلق بدراسة العمليات البيولوجية التي تنظم مورفولوجيا الخلايا.

على الرغم من أن البديل كان لدراسة مورفولوجيا خلوية في سياق كائن حي سليم6، فإن عدد قليل من الكائنات الحية السليمة المناسبة تسهل عالية الإنتاجية التصوير الخلايا الحية الكمية بسبب صعوبات في الحفاظ على الكائنات الحية بأكملها على قيد الحياة من خلال التصوير ، والتحديات المرتبطة بالتصوير داخل كائن حي كبير متعدد الخلايا. ونتيجة لذلك، ركزت الدراسات البيولوجية للخلايا في الكائنات الحية السليمة عموما على مراقبة كائن حي واحد مع مرور الوقت، مما يحد إلى حد كبير من حجم العينة. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الحد من الحيوانات الواحدة في الوقت الواحد يجعل التصوير الحي صعبًا ومكلفًا في استخدام الشاشة ويحد من القدرة على تطبيق أدوات التحليل الكمي نظرًا لأن عدد العينات صغير جدًا بشكل عام. وهكذا، تنشأ الحاجة إلى كائن حي نموذج متعدد الخلايا التي يمكن استخدامها للنهج الكمية ذات المحتوى العالي القائمة.

يكيف هذا البروتوكول جنين دروسوفيليا للتصوير عالي المحتوى القائم على الألواح لتوليد أحجام عينات تجريبية كبيرة بما يكفي للتحليل الكمي. Drosophila الميلانوغاستر المعروف باسم الكائن أول نموذج. وقد أدت البحوث باستخدام Drosophila إلى اختراقات في الخلايا والبيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك نقل المعلومات الوراثية ، وتحديد مسارات إشارات الخلايا ، والمتطلبات الوراثية للتنمية الجنينية7،8،9. وبالإضافة إلى ذلك، وقد استخدم الجنين Drosophila لاستكشاف في ديناميات ميكروتوبول في الجسم الحي خلال التقسيم الخلوي10،11،12. استخدام الحقن المجهرية لتقديم جزيئات صغيرة و تحقيقات الجزيئية يوفر التحكم الزمني الذي يجعل Drosophila تطوير الجنينية قوية بشكل خاص لتحري العمليات الخلوية في الجسم الحي13،14. ومع ذلك، فإن توليد عدد كبير من التكرارات التجريبية باستخدام نهج التصوير التقليدي هو عمل كثيف للغاية وله استخدام محدود في شاشات التصوير عالية الإنتاجية والتحليل الكمي. نهجنا يجعل استخدام محلل محتوى عالية محفوظة عادة لتحليل خلية واحدة ويتكيف في تحليل التصوير في الجسم الحي في syncytium من الدرسونو فيوقت مبكر ه mbryo.

تم استخدام هذا البروتوكول لجمع، مرحلة، وmicroinject الأجنة Drosophila لاستكشاف الآليات التي تدفع التغيرات المورفولوجية في إندوبلاسميك ريتيكولوم (ER) خلال الانقسام15. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد حددت الطبيعة الديناميكية لـ ER خلال دورة الخلية16،17،18،19، فقد كان من الصعب مقارنة آثار الانزعاجات المتعددة عبر الزمن على مورفولوجيا ER. لتحديد المكونات التي تدفع التغييرات في ER مورفولوجيا عبر انقسام الخلايا، واستخدمت الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول للتحقيق في دور microtubules وغيرها من العوامل الخلوية في إعادة تنظيم ER ميتوسيتيك باستخدام الانقسام المتزامن القشرية في الجنين الدروسوفيا في وقت مبكر. إذا ما أخذت معا، وتوافر الانزعاج الوراثي داخل المجتمع Drosophila، والقدرة على microinject المخدرات و التحقيقات الجزيئية في أوقات دقيقة أثناء التنمية، وتكلفة غير مكلفة للعمل مع Drosophila يجعل هذا النهج قابل جدا لفحص الصورة عالية الإنتاجية على أساس. الأساليب المذكورة هنا قابلة للتطبيق لدراسة مجموعة واسعة من العمليات الخلوية والتنموية في الجسم الحي باستخدام الجنين Drosophila 20. على وجه التحديد، هذا البروتوكول هو جيد التكيف لدراسة الأحداث البيولوجية التي تحدث على مدى فترة طويلة وضمن 100 ميكرون من قشرة الجنين دروسوفيليا.

Protocol

ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على وصفات وسائل الإعلام والحل.

1- إنشاء وصيانة قفص لجمع الأجنة من أجل التحليل الحي21

  1. ملء قفص جمع الأجنة الطازجة مع الذباب الطازجة.
    ملاحظة: في حين ينصح أقفاص جمع المتاحة تجاريا، يمكن بسهولة بناء أقفاص جمع من فارغة يطير زجاجات21.
    1. تجاهل أو نقل الذباب الكبار من الزجاجات عندما تبدأ العديد من pupae سواد في المرحلة p14; في 20 °C يحدث هذا تقريبا 14 أيام بعد أن وضعت البيض22.
    2. السماح pupae ليفقس وملء الزجاجات لمدة 12-24 ساعة.
    3. نقل الذباب الطازج إلى قفص جمع صغير باستخدام قمع صغير فوق فتح قفص جمع لمنع الذباب من الهروب. الجمع بين ما يصل إلى 3 زجاجات لإنتاج قفص مكتظة بالسكان تحتوي على 200-500 الذباب.
    4. نقل الذباب في قفص جمع عن طريق التنصت على زجاجة ذبابة ضد سطح صلب مرارا وتكرارا (لصعق الذباب). ثم فتح وعكس زجاجة ذبابة على قمع قفص جمع. اضغط على الزجاجة المفتوحة على قفص الجمع عدة مرات لإسقاط الذباب في قفص الجمع.
    5. أغلق زجاجة ذبابة مفتوحة عن طريق وضعها بسرعة على قابسها. أثناء نقل زجاجة ذبابة مفتوحة من القمع إلى قابسها، تأكد من أن الزجاجة فتح نقاط إلى أسفل كما الذباب تميل إلى الزحف بعيدا عن مصدر التنصت.
    6. اضغط على القمع ضد فتح قفص ذبابة والاستفادة من القفص مرارا وتكرارا على سطح صلب لصعق الذباب في الداخل. على الفور إزالة القمع وتأمين لوحة العنب الطازجة لفتح قفص ذبابة. استخدام الشريط وضع العلامات لتأمين لوحة العنب. كرر هذه العملية للجمع بين ما يصل إلى 3 زجاجات لإنتاج قفص جمع مكتظ بالسكان.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن أن يكون الذباب تخدير باستخدام CO2 أو غيرها من عوامل النوم الذبابة; ومع ذلك، سيؤدي هذا إلى زيادة فترة التأقلم في الخطوة 1.2.
  2. التأقلم قفص جمع جديدة لمدة 24-48 ساعة. إذا تم استخدام CO2 أو أي عوامل النوم الأخرى، التأقلم قفص جمع لمدة 48 ساعة على الأقل.
    1. استبدال لوحة العنب في قفص جمع مع واحدة جديدة تحتوي على معجون الخميرة مرتين في اليوم، 8-10 ساعة عن بعضها البعض.
  3. إعداد قفص جمع الطازجة كل 5 أيام.

2- جمع وإعداد الأجنة للتصوير

  1. الحصول على أجنة مع التطور المتزامن
    1. تبادل لوحة العنب على قفص جمع مع واحد الطازجة التي تحتوي على داب من معجون الخميرة في المركز. السماح للذباب لوضع الأجنة لمدة 1 ساعة. اُرِبِ لوحة العنب القديمة
      ملاحظة: يمكن للذباب تخصيب الأجنة قبل وضعها. ستحتوي لوحة الجمع الأولى على العديد من هذه الأجنة التي تم تطويرها. سيسمح للذباب بإغراق الأجنة القديمة أولاً سيحسن تزامن النمو بين الأجنة.
    2. تبادل صفيحة العنب لواحدة جديدة تحتوي على داب من معجون الخميرة في المركز والسماح للذباب وضع الأجنة لمدة 10 دقيقة. اُرِبِ لوحة العنب القديمة
      ملاحظة: لتجنب تباطؤ التنمية الجنينية على لوحات الباردة، واسخن صفيحة العنب ومعجون الخميرة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    3. تبادل لوحة العنب مع واحدة جديدة (دون معجون الخميرة) وحفظ لوحة العنب القديمة، فقد الأجنة للتصوير. إذا لزم الأمر، مواصلة جمع الأجنة من هذا القفص بتكرار الخطوة 2.1.2 و 2.1.3.
  2. العمر جمع الأجنة لمدة 30-45 دقيقة إلى الانقسامات متزامن صورة23.
    ملاحظة: لتصوير مرحلة الأرمديم المتزامن في التطور الجنيني، يجب تركيب الأجنة وعلى المجهر في غضون 90 دقيقة من جمع. عند محاولة هذا البروتوكول للمرة الأولى، عمر الأجنة 10-20 دقيقة في الخطوة 2.2 لتوفير وقت إضافي لإعداد بين الخطوات.
  3. أجنة dechorionate مع 50٪ تبييض في المياه DI.
    1. نقل الأجنة الذين تتراوح أعمارهم بين من الخطوة 2.2 إلى غربال 140 نانومتر عن طريق ملء صفيحة العنب مع ماء DI، طرد الأجنة بلطف مع فرشاة الطلاء، وصب الماء مع الأجنة في غربال 140 نانومتر(الشكل 1A).
      ملاحظة: يمكن القيام بذلك عبر الحوض أو 1000 مل من القارض.
    2. شطف الأجنة بقوة مع ماء DI باستخدام زجاجة بخ. أجنة جافة عن طريق النشاف منخل على منشفة ورقية جافة. لطخة المنخل حتى يتوقف عن ترك علامات المياه على منشفة ورقية (الشكل 1B).
      ملاحظة: إزالة جميع معجون الخميرة من الأجنة لأنها يمكن أن تجعل علاج التبييض غير فعالة في الخطوة التالية.
    3. ملء لوحة فارغة 10 سم مع إعداد الطازجة 50٪ التبييض المخفف مع المياه DI (1:1 التبييض: DI الماء). تراجع منخل في 50٪ التبييض لمدة 2 دقيقة 45 s. بدء ساعة توقيت بمجرد أن يلمس الغربال 50٪ التبييض. لطخة المنخل داخل وخارج 50٪ تبييض 3-4x في أول 15 ق لتفكك كتل الجنين (الشكل 1C).
    4. شطف بقوة الأجنة مع DI المياه باستخدام زجاجة بخ. جفف الأجنة عن طريق النشاف المنخل على منشفة ورقية جافة. كرر شطف قوية ولطخة عملية التجفيف لمدة 5x (الشكل 1D).
      ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر أهمية لإزالة اليسار فوق chorion. استخدام زجاجة بخ DI كامل واستخدام نصف زجاجة في هذه الخطوة.
    5. نقل لطخة المجففة من منخل إلى 10 سم العنب لوحات باستخدام فرشاة الطلاء21 (الشكل 1E)
      ملاحظة: يمكن استخدام الزّيود اليدوي كبديل للديكور24.

Figure 1
الشكل 1: تخسر الجنين. (أ)تم جمع الأجنة باستخدام زجاجة DI H20 بخ وفرشاة الطلاء و 140 نانومتر منخل. (ب) تم شطف الأجنة بقوة باستخدام زجاجة DI H20 بخ ولطخة جافة فوق منشفة ورقية. (C) تم إجراء إزالة الغموض من الأجنة في 50٪ تبييض لمدة 2 دقيقة و 45 s. (D)تم شطف الأجنة بقوة باستخدام زجاجة DI H20 بخ ولطخة جافة على منشفة ورقية. وتكرر هذا 4 مرات لإزالة الترشي الزائد. (E) ثم تم نقل الأجنة إلى لوحة العنب 10 سم باستخدام فرشاة الطلاء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تركيب الأجنة إلى أغطية

  1. تحت مجسم مجسم مجهز بإضاءة عنق الأوزة العلوية، قم بتنظيم صفين من 15-20 جنينًا على قسم نظيف من صفيحة العنب باستخدام أداة منتقي البيض. محاذاة الأجنة على الجانب البطني في نفس التوجه فيما يتعلق الأمامي والخفي ينتهي. لجعل جامعي البيض ينحني غرامة تلميح الفولاذ المقاوم للصدأ ملاقط إلى زاوية 45 درجة. لمراجعة اتجاه الأجنة D/ V انظر كامبوس أورتيغا وآخرون20.
    ملاحظة: من المهم للسطح البطني الجلوس على لوحة العنب كما سيتم الضغط على الأجنة على زلة غطاء في الخطوة 3.5، مما يعرض سطح الظهر للتصوير. منذ سطح الظهر هو تملق بكثير من السطح البطني، والتصوير سطح الجانب الظهر يزيد من عدد النوى الموجودة داخل طائرة Z واحدة.
  2. إعداد 75 مم × 25 مم غطاء أغطية سيليكون.
    ملاحظة: يمكن إعداد هذا قبل الوقت. إعداد العديد من الأغطية وتخزينها في مربع شريحة للحفاظ على نظافتها.
    1. تتبع الخطوط العريضة ل75 مم × 25 مم coverslip على ورقة 1.6 مم سيليكون الفضاء سميكة وقطع من الفضاء سيليكون باستخدام مقص (الشكل 2A).
    2. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع 40 مم × 15 ملم inset من الفضاء(الشكل 2A).
    3. التمسك بمسافة على غطاء و 10 μL من الغراء heptane أسفل الزجاج غطاء مكشوف inset (الشكل 2A).
      ملاحظة: سوف اخماد وحتى سلسلة ضمان التصوير الأجنة على نفس الطائرة z.
  3. في حين أن الغراء heptane من الخطوة 3.2.3 يجف، قطع مقطع مستطيل من لوحة العنب التي تحتوي على الأجنة من الخطوة 3.1.
    1. استخدم شفرة حلاقة لقطع مستطيل (أصغر من 40 مم × 15 مم) حول صفين من الأجنة. لا تقم بإزالة المستطيل حتى الآن.
    2. قطع مستطيل الثاني بجانب الأول. قم بإزالة المستطيل الثاني باستخدام جانب الحافة المستقيمة من ملعقة الفولاذ المقاوم للصدأ.
    3. الشريحة بعناية على حافة مستقيمة من ملعقة الفولاذ المقاوم للصدأ تحت المستطيل الأول وإزالته(الشكل 2B).
  4. ضع ألواح العنب مع الأجنة على الجانب الخارجي من طبق 3.5 سم (الشكل 2C).
  5. تحت منظار مجسم، قم بخفض غطاء معد فوق الأجنة واضغط بلطف على صفين من الأجنة على الغراء(الشكل 2D).
  6. إذا microinjecting الأجنة، انتقل إلى الخطوة 4.1. إذا لم يكن microinjecting متابعة الخطوة 3.7.
  7. تغطية الأجنة عن طريق ملء الفضاء سيليكون (في منتصف الطريق إلى الأعلى) مع 1:1 - زيت الهالوكربون 700: زيت الهالوكربون 27.
  8. خط الحواف السفلية من محول لوحة 4-الشريحة مع الشريط من جانبين لمنع زلة الغطاء من التحرك ولكن ضمان عدم وضع الشريط في مسار العدسة الهدف. هذا الشريط مهم إذا كان الغطاء يجلس فقط على المحول ، فإنه سينتقل في جميع أنحاء الاستحواذ. قم بتركيب زلة الغطاء على محول لوحة الشريحة 4.

Figure 2
الشكل 2: إعداد Coverlip وتركيبها. (أ) تم تتبع مخطط 75 مم × 25 مم على ورقة سيليكون سميكة 1.6 مم. استخدام مقص لقطع الخطوط العريضة. تم قطع 40 مم × 15 مم من الفضاء سيليكون ثم شنت على غطاء. Streaked 15 μL أسفل مركز inset. (ب) تم تنظيم صفين من 15-20 جنينا على صفيحة عنب في منطقة أصغر من 40 مم × 15 ملم، ثم تم قطع تلك المنطقة باستخدام ملعقة حلاقة و بلا أساس من الفولاذ المقاوم للصدأ. (C) تم وضع لوحة العنب قطع على الجزء العلوي من طبق فارغ 3.5 سم. (D) تحت منظار مجسم، تم خفض الغطاء من (A) وعلقت الأجنة على سلسلة من الغراء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4- إزالة الاستئصال وصغر الأجنة

  1. ضع غطاء الأغطية مع الأجنة على شريحة لمنع الجزء السفلي من الغطاء من أن يصبح قذرًا أثناء الجفاف والضين الدقيق.
    ملاحظة: سيتم تصوير قسيمة الغلاف بدون شريحة مرفقة به. ولذلك، فإن المجهر المقلوب ضروري للتصوير.
  2. المجفف الأجنة لمدة 5-10 دقيقة، اعتمادا على درجة حرارة الغرفة. تم تجفيف الأجنة المستخدمة للتصوير في النتائج التمثيلية لمدة 7 دقائق عند 20 درجة مئوية في غرفة تحتوي على طبقة 1:1 من حبات السيليكا الهلامية على عامل تجفيف (الشكل 3A).
  3. مباشرة بعد الجفاف، وتغطي الأجنة مع 1:1 - زيت الهالوكربون 700: زيت الهالوكربون 27. ملء الفضاء سيليكون في منتصف الطريق إلى الأعلى.
    ملاحظة: من المهم خلط زيت الهالوكربون عالي اللزوجة مع زيت الهالوكربون منخفض اللزوجة. نقية الهالوكربون النفط 700 (اللزوجة العالية) يبطئ دورات الخلية التقدم 30 دقيقة بعد التطبيق. 1:1 خليط من زيت الهالوكربون 700 وزيت الهالوكربون 27 ثابتة هذه القطعة الأثرية.
  4. تحميل الإبر الحقن المجهري مع حقن، ثم جبل واحد إلى الحقن المجهري وقطع عليه فتح تحت الضغط.
    ملاحظة: الخطوة الممارسة 4.4 عدة مرات قبل تنفيذ فحص كامل مع أي الكواشف قيمة. هذه هي الخطوة الأكثر صعوبة في عملية الحقن المجهري.
    1. تحميل الإبر الحقن المجهري مع 2 ميكرولتر من حقن باستخدام طرف تحميل موسعة. مطلوب واحد فقط الحقن المجهري الإبر، ولكن من الجيد أن يكون الإبر محملة الغيار قريبة من قبل حتى إعداد 2 أو 3 إبر.
      ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على المواصفات على تلميحات التحميل الموسعة. لا يمكن تحميل إبر الحقن المجهري دون نصائح التحميل الموسعة بسبب الطبيعة الفريدة لتقنية الحقن المجهري لدينا ، والتي تعتمد على بناء ضغط الهواء داخل إبرة مختومة ومحملة قبل فتح طرفها.
    2. جبل إبرة على الحقن المجهري والاكتئاب المكبس في منتصف الطريق إلى طرف. والهدف هو زيادة ضغط الهواء داخل الشعيرات الدموية الزجاجية (الشكل 4A).
      ملاحظة: استخدام الزبيب المعدنية الزيوت على أساس ناخن صغير دون النفط المعدنية. بدلا من بناء الضغط مع النفط المعدني، واستخدام المكبس لبناء ضغط الهواء.
    3. خفض إبرة الزجاج على شريحة زجاجية وقطع غيض من إبرة مفتوحة باستخدام شفرة حلاقة #9 جديدة. قطع الإبرة في زاوية 45 درجة لإنتاج طرف مفتوح حاد. يجب أن تتدفق الحقنة إلى أسفل الطرف دون أن تتدفق من الإبرة. إضافة بعناية 20 ميكرولتر من زيت الهالوكربون على طرف الإبرة وإعادة قطع فتحه في 45 درجة. يجب أن يبدأ حقن في التدفق بسرعة.
    4. على الفور خفض ضغط الهواء عن طريق سحب المكبس ولكن ضمان الحفاظ على معدل التدفق المستمر لمنع الإبرة من انسداد مع غشاء الجنين بين الحقن. (الشكل 4B).
      ملاحظة: إذا كان الحقن واضحًا، فانظر معدل تدفق الحقن عن طريق رفع إبرة الحقن المجهري داخل وخارج زيت الهالوكربون ومراقبة معدل تكوين قطرات الحقن تحت منظار مجسم. ضبط ضغط الهواء عن طريق الاكتئاب المكبس بضع نقرات في وقت واحد، ثم تراجع تلميح الحقن المجهري داخل وخارج زيت الهالوكربون لعرض معدل تشكيل لتعديل مقر عمل قطرات جديدة.
    5. استخدام micromanipulator لوضع الإبرة في وسط مجال الرؤية، ثم رفع الإبرة باستخدام micromanipulator وإزالة الشريحة الزجاجية من تحته. يتم معايرة الإبرة الآن للحقن.

Figure 3
الشكل 3: مخطط غرفة الجفاف. (أ) هذا مخطط لغرفة الجفاف. تتكون الغرفة من طبقة 1:1 من حبات هلام السيليكا على طبقة من الدريريت. لإجراء جفاف، وضعت الأجنة على رأس غطاء صفيحة بئر واحد. تم إغلاق غرفة الجفاف 7 دقائق.

  1. الأجنة الدقيقة
    1. ضع الأجنة على مرحلة منظار المجسم تحت إبرة الحقن المجهري ولكن لا تخفض الإبرة.
    2. التركيز على الأجنة في التكبير 50x.
    3. خفض الإبرة حتى يأتي في نفس الطائرة التركيز مثل الأجنة. تحريك الشريحة بيد واحدة وتشغيل الحقن المجهري مع الآخر، حقن صف واحد من الأجنة.
    4. رفع الإبرة وتدوير الشريحة 180 درجة لفضح الصف الثاني من الأجنة لإبرة الحقن المجهري. خفض الإبرة وحقن الصف الثاني من الأجنة.
      ملاحظة: حاول القيام بذلك في أقل من 10 دقيقة. اترك بعض الأجنة غير المحنَنة لاستخدامها كضوابط.

Figure 4
الشكل 4: إعداد إبرة الحقن المجهري. (A) في هذا التوضيح، فإن شدة أرجواني في إبرة هو ممثل لضغط الهواء. تم تركيب إبرة محملة على الحقن المجهري وتم تمديد المكبس بنسبة 50٪ لزيادة ضغط الهواء داخل الإبرة. تأكد من أن المكبس هو تراجع الحد الأقصى قبل تصاعد. (B) تم قطع طرف الإبرة تحت الضغط وتم سحب المكبس لتقليل ضغط الهواء ومعدل التدفق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. التصوير على محلل محتوى عالية

  1. قبل تشغيل هذا الفحص إنشاء مخطط لوحة لمحول شريحة. استخدم محرر حامل اللوحة الموجود في قائمة "إدارة خرائط لوحة" لإدخال البعد لمحول لوحة مخصص.
    ملاحظة: تم إنشاء مخطط لوحة مخصص لمحول اللوحة المتوفرة تجارياً (راجع جدول المواد). تحتوي خريطة اللوحة على الإعدادات التالية؛ سمك الشريحة: 1000 ميكرومتر، الارتفاع السفلي: 1.607 مم، تباين ارتفاع القاع: 100 ميكرومتر، المواد الركيزة: الزجاج، سمك الغطاء: 150 ميكرومتر، موقف الغطاء: أسفل – الصفوف: 1 – التباعد: 56.987 مم، الأعمدة: 4 – تباعد 28.391، الحجم والشكل: مستطيل، عرض 23.00 مم، الارتفاع: 73.00 مم، إزاحة إلى A1 21.29 مم – 42.74 mm)
  2. تحميل محول الشريحة على المجهر واستخدام ميزة معاينة لتجانب صورة 10x brightfield من الغطاء.
  3. حدد جنينًا من أعلى أو أسفل الصف، ثم حدد الهدف والتبديل إلى 60x (NA 0.95). تحديد التعرض المناسب لقناة الفلوريسنس المطلوبة.
    ملاحظة: حافظ على كثافة الليزر أقل من 25% لتصوير الخلايا الحية.
  4. على لوحة المعلومات الرئيسية، استخدم ميزة المعاينة لتجانب صورة 60x الفلورسنت التي تحتوي على كلا الصفين من الأجنة.
  5. على لوحة المعلومات الرئيسية، حدد القائمة المنسدلة Binning وقم بتعيين binning إلى 1 × 1 للحصول على الدقة المثلى.
  6. استخدم علامة التبويب إعداد المكدس z لتعريف المعلمات الخاصة بـ z المكدسات.
    1. في علامة التبويب إعداد المكدس z، استخدم السهمين لأعلى ولأسفل للبحث عن ثم تحديد حدود مكدس z العلوية والسفلى. بمجرد تحديد الحدود العليا والسفلى، حدد رمز القلم الأخضر لحفظ موضع المكدس z. لاحظ موضع المكدس z كما سيتم استخدامه في الخطوة 5.6.5.
    2. في علامة التبويب إعداد المكدس z، استخدم مربع إدخال الخطوة z تعريف التباعد بين شرائح z.
      ملاحظة: يتم تحديد العدد الإجمالي للشرائح بواسطة التضمين الخطوة 5.6.1 و 5.6.2.
    3. على لوحة القيادة الرئيسية، انقر بزر الماوس الأيمن على قناة الفلورسنت واستخدم القائمة المنسدلة وضع الصورة لتعيين وضع التصوير إلى 3D.
    4. على لوحة المعلومات الرئيسية، حدد مربع التركيز التلقائي بالليزر لتعطيل التركيز التلقائي.
    5. على لوحة المعلومات الرئيسية، حدد التركيز الأولي مع موضع z-المكدس من الخطوة 5.6.1 ثم حدد مربع التركيز الأولي لتعطيل ميزة " إعادة التركيز في كل نقطةوقت".
  7. في علامة التبويب حقول، استخدم القائمة المنسدلة موضع الحقل لتمكين النقاط المخصصة، ثم استخدم الأسهم لتحديد النقاط للتصوير.
    ملاحظة: الفاصل الزمني بين عمليات الاستحواذ (الخطوة 5.8) تحديد عدد النقاط المخصصة يمكن أن يكون صورة في نفس الوقت.
  8. في علامة التبويب سلسلة زمنية، حدد المربع الحصول على سلسلة زمنية لتمكين ميزة السلسلة الزمنية، ثم حدد العدد الإجمالي للنقاط الزمنية.
    ملاحظة: 6 نقاط مخصصة × 5 ثواني 5 ثواني × 80 مكدسات = 2,400 صورة، 2,400 صورة × 8.2 ميغابايت لكل صورة = 19.68 غيغابايت مساحة القرص.
  9. في لوحة المعلومات الرئيسية، استخدم مربع إدخال الاسم لتسمية إعدادات الامتلاك ثم حدد ملف وحفظ لحفظ إعدادات الامتلاك.
  10. في لوحة المعلومات الرئيسية، حدد الزر Scan لتشغيل عملية الاستحواذ.

6. آخر معالجة الصور

  1. سحب وإسقاط ملف xdce في فيجي لفتح سلسلة الصور كما هوكة متعددة الأبعاد.
  2. حفظ كومة الذاكرة المؤقتة كملف tif.
  3. إنشاء أقصى كثافة الإسقاطات وحفظها كملفات tif.
  4. تجميع مكتبة من التوقعات كثافة ماكس وبناء خط أنابيب لاستخراج البيانات وتحليلها.

Representative Results

وقد استخدم النهج المقدم في هذا البروتوكول لدراسة دور microtubules في إندوبلاسميك Reticulum (ER) إعادة التنظيم أثناء الانقسام في الجنين Drosophila 15. خلال الانقسام ، وهيكل ER يعرض إعادة تنظيم مثيرة ، ومع ذلك ، فإن القوى التي تدفع هذه التغييرات غير مفهومة بشكل جيد. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن عائلة من البروتينات تشكيل ER لتعزيز تشكيل أنبوبER 25،26،27،28، والتي هي معروفة لقربها من قرب مع microtubules28. لدراسة لفة microtubules على ER مورفولوجيا، واستخدمت الأساليب المنصوص عليها في البروتوكول لتوليد البيانات لمقارنة كمية آثار العديد من العلاجات الدوائية microinjected على إعادة تنظيم ER أثناء الانقسام. كولشيسين، الذي يمنع البلمرة microtubule جديدة، ووجد أن تقلل بشكل كبير من إعادة تنظيم ER أثناء الانقسام كما هو مبين في الشكل 5 والشكل 6. وعلاوة على ذلك، فإن النهج الموصوف هنا مكّن من إنتاج بيانات التصوير في اللفات الزمنية لـ 32 جنيناً. تم إنتاج قياسات الكثافة القصوى والأقصى من 12800 منطقة ذات أهمية باستخدام سيناريو MATLAB مخصص ، والذي أدى أيضًا إلى توليد إحصاءات وصفية واستدلية حيوية لإجراء مقارنات بين علاجات الأدوية. نظرا لتوافر المسابير الجزيئية وسهولة الحقن المجهري، والطرق المذكورة هنا قابلة للتكيف بسهولة لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية عن طريق القياس الكمي كثافة الفلوريسين.

Figure 5
الشكل 5: صور تمثيلية لإثراء Rtnl1-GFP و ReepB-GFP في قطبي المغزل أثناء الانقسام. (أ) 60x مجال الرؤية من ReepB-GFP خلال الانقسام في دورة الخلية 10. ويمثل المربع الأزرق مجال الرؤية المستخدم في اللوحات B-E. تتم معالجة اللوحة A مع عامل تصفية ثنائي العتبة. لم يتم تطبيق هذا المرشح على لوحات B-E لأنه يستبعد البيانات من وحدات البكسل تحت العتبة المحددة. (B, D) ReepB-GFP في السيطرة، وفي colchicine. (C, E) Rtnl1-GFP في السيطرة، وفي colchicine. وقد تم تعديل هذا الرقم من دياز وآخرون15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: كمية الإثراء من Rtnl1-GFP و ReepB-GFP في قطبي المغزل أثناء الانقسام. تم تحليل 20 مغزل و 20 سيتوبلازم ريال عماني عبر 10 إطارات ل32 أجنة في الظروف التالية. (أ)10% حقن التحكم في DMSO لRtnl1-GFP. أظهرت الأجنة التحكم زيادة 0.1 أضعاف في التخصيب (p<0.001 لجميع العينات في T210) مقارنة مع العينات غير المحقونة (p < 0.001 لجميع العينات في T210). (ب) الأجنة ReepB-GFP حقن مع 10٪ DMSO لتكون بمثابة السيطرة. وأظهرت الأجنة التحكم زيادة 0.1 أضعاف في التخصيب (p< 0.001 لجميع العينات في T210) مقارنة بالعينات غير المحقونة(الشكل 1E؛ p < 0.001 لجميع العينات في T210). (C)Rtnl1-GFP الأجنة حقنها مع 5 μM كولشيسين. هنا قمنا بقياس انخفاض في إثراء Rtnl1-GFP إلى مغزل (p < 0.001 لجميع العينات في T210) مقارنة بالضوابط (A) (p < 0.001 لجميع العينات في T210). (د)الأجنة ReepB-GFP حقن مع 5 μM كولشيسين. قمنا بقياس انخفاض في إثراء ReepB-GFP إلى مغزل (p< 0.001 لجميع العينات في T210) مقارنة بالضوابط (B) (p<0.001 لجميع العينات في T210). وقد تم تعديل هذا الرقم من دياز وآخرون15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. معجون الخميرة21 2. صفائح العنب21 3. هيبتان الغراء24
1.1 إضافة 7 غراما من الخميرة الجافة النشطة إلى 50 مل مخروطي. إضافة 9 ملليلتر من المياه DI ويخلط حتى إلى ثبات مع ملعقة معدنية. 2.1 جعل الحل أ: إضافة 6 غرامات من أجار إلى 140ml من المياه DI في قارورة 250ml وautoclave ذلك. 3.1 ملء قارورة التألق الزجاجي مع 50 بوصة من الشريط على الوجهين.
1.1 إضافة 7 غراما من الخميرة الجافة النشطة إلى 50 مل مخروطي. إضافة 9 ملليلتر من المياه DI ويخلط حتى إلى ثبات مع ملعقة معدنية. 2.2 جعل حل ب: مزيج 0.1 غرام من البارابين الميثيل في 2ml من الإيثانول، ثم إضافة هذا الحل إلى 60ml من عصير الجريب فروت التركيز. 3.2 إضافة 20 مل من heptane وختم الزجاج المظلة مع قارورة البارا فيلم. تدوير بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
2.3 مباشرة بعد حل autoclaving a، مزيج في حل ب وتصب الخليط في 10 × 35mm أطباق بيرتي. (يجعل 35 صفائح العنب) 3.3 إزالة الحطام الشريط البلاستيك عن طريق نقل الغراء في 2 15 مل أنابيب المخروطية وsuguging في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
2.4 السماح للوحات العنب لتعيين في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها مع أغطية لوحة قبالة. لوحات تغطية مع الأغطية وتخزينها في 4C درجة بعد تعيينها. 3.4 نقل الغراء supernatant في أنابيب 1.5 مل microcentrifuge للتخزين.

الجدول 1: وصفات وسائط الإعلام والحلول.

Discussion

البروتوكول الموصوف هنا متعدد الاستخدامات للغاية ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة الأحداث البيولوجية في مجموعة متنوعة من المراحل في التنمية الجنينية دروسوفيليا. وهذا البروتوكول مناسب تماما لدراسة العمليات البيولوجية التي تحدث على مدى فترات زمنية طويلة. على سبيل المثال، يمكن أن تستفيد دراسات الخلايا29،30 أو تشكيل مجالات هيتروكروومتين في Drosophila31،32 من استخدام الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول لأن هذه العمليات تحدث على مدى فترة طويلة من الزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة حجم العينة عن طريق تقليل التكبير لدراسة الأسئلة التي تتطلب أقل دقة البصرية، مثل توقيت بين الانقساماتالمتزامنة 33 أو مدة gastrulation34.  وبالمثل، فإن الهدف 20x يسمح لتصوير جنينين داخل طائرة تصوير واحدة. وتوفر الأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول منصة دينامية لطرح الأسئلة البيولوجية باستخدام التنمية الجنينية كنظام نموذجي للتحليل الكمي.

هناك 3 خطوات هامة في هذا البروتوكول. بعد dechorionation في 50٪ تبييض من الضروري أن يتم شطف الأجنة وتجفيفها بقوة 5 مرات (2.3.4). هذه الخطوة يزيل أي بقايا قطع صغيرة من chorion. سوف بقايا chorion عرقلة مجال الرؤية عند تصوير الجنين. عند تركيب الأجنة على غطاء الزجاج (3.5)، من المهم الضغط على الأجنة على الغراء مع ضغط موحد. وهذا سوف يضع الأجنة على نفس الطائرة z. عند قطع فتح إبرة الحقن المجهري، من المهم سحب المكبس على الفور لضبط معدل تدفق الإبرة أو سوف تفقد كل ما تبذلونه من الحقن.

كانت دراستنا محدودة بعوامل اثنين. العامل الأول هو عدم وجود عملية تجزئة آلية. قمنا بتصميم سيناريو تجزئة يدوي باستخدام MATLAB ، ومع ذلك ، مع علامة المغزل المشفرة وراثيا يمكن أن تكون هذه العملية الآلي. في المستقبل نود أن تنتج CNN-RFP21،RTLN1-GFP و CNN-RFP؛ خطوط ReepB-GFP المعدلة وراثيا لتمكين تجزئة المغزل الآلي. لمزيد من المعلومات حول خط MATLAB وخط أنابيب التحليل ، راجع المواد التكميلية من Diaz etal. 15. ثانيا، كنا أيضا محدودة من قبل لدينا فترة اقتناء 35 s، والتي سمحت لنا فقط لتصوير 6 أجنة في وقت واحد. فترة حيازة أطول من شأنها أن تسمح لنا لصورة المزيد من الأجنة في وقت واحد. على الرغم من أن إنتاجية تسليم المخدرات يمكن أن تزيد عن طريق استبدال الحقن المجهري مع خطوة تغلغل، وجدنا أن هذا غير ضروري لأن حجم العينة لدينا كان محدودا بالفعل من قبل فترة الاقتناء.

في حين تم استخدام هذا البروتوكول لصورة Drosophila تطوير الجنينية، والنهج الشامل هو قابل للتكيف لدراسة التنمية الجنينية في أنظمة نموذج متعددة الخلايا الأخرى، مثل C. elegans،قنفذ البحر، وXenopus. الأجنة مفيدة للغاية للتحليل الكمي لأنها متزامنة بسهولة عن طريق الجمع أو الإخصاب. بالإضافة إلى ذلك، لا تتحرك الأجنة أو تسبح بعيداً عن مجال الرؤية، مما يتيح استخدام برنامج بسيط للاكتساب متعدد النقاط قادر على إنتاج مقاطع فيديو متعددة للفاصل الزمني للتحليل الكمي. على الرغم من أننا استخدمنا محلل محتوى عالي في دراستنا ، يمكن أن يقترن أي نظام مجهر مقلوب قادر على الاستحواذ متعدد النقاط بالطرق المشار إليها هنا.

ويمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام احتياز متعدد النقاط يمكن أن يُعكس مجهراً مقلوباً؛ ومع ذلك، تظهر مزايا محلل المحتوى العالي كـ أحد يزيد حجم العينة لدراسة الأسئلة التي تتطلب دقة أقل في الوقت. ميزة واضحة لاستخدام محلل المحتوى العالي هو القدرة على صورة 4 شرائح منفصلة في وقت واحد مقارنة مع 1 الشريحة على النظم التقليدية. مع مجموعة كاملة من 4 شرائح و 40 أجنة على كل شريحة، يمكن تصوير 160 جنينا على مدى عدة ساعات، طالما أن فترة الاستحواذ هي 15 دقيقة على الأقل بين الإطارات. ميزة أخرى هامة لاستخدام محلل المحتوى العالي هي أن العينات مغلقة تماما من أي مصادر الضوء الخارجي، وهو أمر ضروري لقياسات كثافة الفلوريسينس القائمة على. وأخيرا، فإن محلل المحتوى العالي المستخدم في دراستنا لديه كاميرا CMOS 5.5 ميجابيكسل التي توفر حقل عرض سخي 221.87 ميكرومتر في التكبير 60x. وقد مكننا هذا المجال الأكبر من الرؤية من تصوير نصف جنين لكل نقطة اقتناء.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

UD، WFM و BR مدعومة من قبل مركز البناء الخلوي، وهو مركز العلوم والتكنولوجيا (NSF) المؤسسة الوطنية، بموجب اتفاقية منحة DBI-1548297. كما يتم دعم BR من خلال جائزة NSF Career، 1553695.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x 35mm Micro Dish VWR Cat #: 10799-192 N/A
100% grape juice concentrate Welch's, 100% Concentrate Grape Juice N/A Purchase at Grocery Store
250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth VWR Cat #: 10536-914 N/A
3" Non-Metallic Sieve No. 140 Gilson Company SV-165 #140 N/A
4 Slide Imaging Tray Grace Biolabs SKU: 400104 N/A
ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy Fisher Scientific Cat #: AC411255000 N/A
Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof Fisher Scientific Cat# : AC615095000 N/A
Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) Fisher Scientific Cat#: AC126961000 N/A
Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass Fisher Scientific Cat #: 50-143-782 N/A
Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick Grace Biolabs SKU: 664273 N/A
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials Fisher Scientific Cat #: 03-341-71A N/A
Embryo Collection Cage-Mini Genesee Scientific Cat #: 59-105 N/A
Eppendorf Microloader Pipette Tips Fisher Scientific Product Code: 10289651 N/A
Falcon 15mL Conical Centrifuge Fisher Scientific Cat #: 05-527-90 N/A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific Cat #: 14-432-22 N/A
Fleischmann's, Active Dry Yeast Fleischmann's N/A Purchase at Grocery Store
Grape Plates REFFER TO RECIPE PREP N/A N/A
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific Cat #: 59-133 N/A
Halocarbon 700 Oil Genesee Scientific Cat #: 59-131 N/A
Heptane Glue REFFER TO RECIPE PREP N/A N/A
Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 VWR Cat #: 55411-050 N/A
Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll Fisher Scientific Cat #: 50-998-944 N/A
Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy Fisher Scientific Cat #: NC0879005 N/A
Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm Millipore Sigma SKU: 1077351000 N/A
Stainless Steel Spoon/Spatula VWR Cat #: 470149-044 N/A
W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents Fisher Scientific Cat #: 23-116582 N/A
Yeast Paste REFFER TO RECIPE PREP N/A N/A
EQUIPMENT
Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge Beckman Coulter N/A You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.
Autoclave N/A N/A Any autoclave will do fine.
Drummond Nanoject II Microinjector. Drummond Scientific N/A This is a mineral oil based injection system.
GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. GE healthcare N/A A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.
Refrigerator (4C°) N/A N/A Fly media and yeast paste must be stored at (4C°).
Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. Zeiss Microscopy N/A The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zanella, F., Lorens, J., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Jennings, B. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  3. Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).
  4. Bickle, M. The beautiful cell: high-content screening in drug discovery. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).
  5. Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy based high content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
  6. Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).
  7. Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  8. Letsou, A., Bohmann, D. Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).
  9. Sullivan, W., Theurkauf, W. The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo. Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).
  10. Schejter, E., Wieschaus, E. Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo. Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).
  11. Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos. Development. 103 (4), 675-686 (1988).
  12. Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development. Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).
  13. Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).
  14. Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  15. Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis. PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).
  16. Shibata, Y., et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).
  17. Bergman, Z., et al. Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo. PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).
  18. Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
  19. Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells. The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer Science & Business Media. eBook ISBN 978-3-662-22489-2 (2013).
  21. Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-087969827-0 (2000).
  22. Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
  23. Bate, M., et al. Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. Chapter 3. ISBN 978-087969899-7 (1993).
  24. Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, Academic Press. 113-123 (2001).
  25. Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  26. Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules. Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).
  27. Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).
  28. Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network. The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).
  29. Loncar, D., Singer, S. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  30. Mazumdar, A., Mazumdar, M. How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster. Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).
  31. Yuan, K., O'Farrell, P. TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos. Genes & Development. 30 (5), 579-593 (2016).
  32. Walther, M., et al. Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis. Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).
  33. McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos. Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).
  34. Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos. Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).

Tags

علم الأحياء التنموي، الإصدار 167، تصوير الخلايا الحية، تكوين جنين Drosophila، التصوير الآلي عالي المحتوى، المجهر القائم على الألواح، الاستحواذ متعدد النقاط، تحليل الصور شبه الآلي
Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz, U., Marshall, W., Riggs, B.… More

Diaz, U., Marshall, W., Riggs, B. Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer. J. Vis. Exp. (167), e61589, doi:10.3791/61589 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter