Summary
Здесь представлен протокол микроинъекционного и одновременного изображения нескольких эмбрионов дрозофилы во время эмбрионального развития с использованием изображения на основе пластин с высоким содержанием.
Abstract
Современные подходы в количественной визуализации живых клеток стали важным инструментом для изучения клеточной биологии, позволяя использовать статистику и вычислительное моделирование для классификации и сравнения биологических процессов. Хотя системы модели клеточной культуры отлично подходят для визуализации высокого содержания, высокопрочные исследования клеточной морфологии показывают, что культуры ex vivo ограничены в повторном воспроизведении морфологической сложности, найденной в клетках в живых организмах. Таким образом, существует необходимость в масштабируемой высокой пропускной способности модели системы для изображения живых клеток в нетронутом организме. Описано здесь протокол для использования анализа изображений с высоким содержанием одновременно приобрести несколько замедленного видео эмбрионального развития Drosophila melanogaster во время синцитиальной стадии бластодерма. Синцитиальный бластодерм традиционно служил отличной моделью in vivo для визуализации биологических событий; однако получение значительного числа экспериментальных репликаций для количественных и высокоопутных подходов было трудоемким и ограничивалось визуализацией одного эмбриона на экспериментальное повторение. Здесь представлен метод адаптации подходов к визуализации и микроинъекции в соответствии с системой визуализации высокого содержания или любым перевернутым микроскопом, способным к автоматическому приобретению многоточек. Такой подход позволяет одновременно приобретение 6-12 эмбрионов, в зависимости от желаемых факторов приобретения, в течение одного сеанса визуализации.
Introduction
За последние 30 лет достижения в области технологий визуализации и молекулярных зондов для визуализации живых клеток продвинули наше понимание сложности и внутренней работы клетки. Сопровождающим этот прогресс в технологии является большая зависимость от использования моделей культуры ex vivo для получения данных с высокой пропускной способностью изображений. Модели клеточной культуры обеспечивают ряд преимуществ, в том числе контроль микроокноронности через микрофлюидные системы, а также способность изображения нескольких клеток одновременно, что позволяет использовать количественные подходы, необходимые для высокой пропускнойспособности скрининга 1,2. Однако, Есть также значительные недостатки, связанные с моделями клеточной культуры в контексте морфологических исследований, таких как двумерные стеклянные или пластиковые поверхности, производящие смешанные эффекты наморфологию клеток и ее регулирование 3,4,5. Эти эффекты могут предоставить ложные или вводящие в заблуждение данные в отношении изучения биологических процессов, регулирующих клеточную морфологию.
Хотя альтернативой было изучение клеточной морфологии в контексте нетронутогоорганизма 6, несколько подходящих нетронутых организмовспособствуют высокой пропускной способности количественной визуализации живых клеток из-за трудностей в поддержании жизни целых организмов через вне изображения, и проблемы, связанные с изображением внутри большого многоклеточного организма. В результате, биологические исследования клеток в нетронутых организмах, как правило, сосредоточены на наблюдении одного организма с течением времени, что значительно ограничивает размер выборки. Кроме того, это ограничение на использование изображений в реальном времени затрудняет и обходится дорого в виде экрана и ограничивает возможность применения количественных аналитических инструментов, поскольку количество образцов, как правило, слишком мало. Таким образом, возникает необходимость в многоклеточной модели организма, который может быть использован для высококонтентных количественных подходов.
Этот протокол адаптирует эмбрион Drosophila для изображений с высоким содержанием пластин для создания экспериментальных размеров образцов, достаточно больших для количественного анализа. Drosophila меланогастер широко известен как первая модель организма. Исследования с использованием дрозофилы привели к прорывам в клеточной и молекулярной биологии, включая передачу генетической информации, идентификацию путей сигнализации клеток, а такжегенетические требования эмбрионального развития 7,8,9. Кроме того, эмбрион дрозофилы был использован для изучения динамики микротрубочек in vivo вовремя клеточного деления 10,11,12. Использование микроинъекции для доставки малых молекул и молекулярных зондов обеспечивает временный контроль, что делает эмбриональное развитие Дрозофилы особенно мощным для зондирования клеточных процессов in vivo13,14. Тем не менее, создание значительного числа экспериментальных повторов с традиционным подходом к визуализации является чрезвычайно трудоемким и имеет ограниченное использование в высокой пропускной способности экранов изображений и количественного анализа. Наш подход использует анализатор высокого содержания, обычно зарезервированный для анализа одной клетки, и адаптирует анализ изображений in vivo в синцитиуме раннего Drosophila embryo.
Этот протокол был использован для сбора, стадии, и микроинъект drosophila эмбрионов для изучения механизмов, которые управляют морфологических изменений в эндоплазмической reticulum (ER) во времямитоза 15. Хотя многие исследования изложили динамический характер ER во время клеточногоцикла 16,17,18,19, было трудно сравнить последствия многочисленных возмущений во времени на ER морфологии. Для определения компонентов, которые управляют изменениями в морфологии ER через деление клеток, методы, перечисленные в этом протоколе, были использованы для зондирования роли микротрубочек и других цитоскелетных факторов на митотической реорганизации ER с использованием коркового синцитиального деления в раннем эмбрионе дрозофилы. В совокупности наличие генетических возмущений в сообществе дрозофилы, способность к микроинъекции наркотиков и молекулярных зондов в точное время во время разработки, а также недорогая стоимость работы с Drosophila делает этот подход весьма приемлемым для высокой пропускной способности изображения на основе скрининга. Описанные здесь методы применимы для изучения широкого спектра клеточных и процессов развития in vivo с использованием эмбриона Дрозофилы 20. В частности, этот протокол хорошо приспособлен для изучения биологических событий, которые происходят в течение длительного периода и в пределах 100 микрон коры эмбриона Дрозофилы.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице 1 для рецептов средств массовой информации и решения.
1. Настройка и поддержание клетки сбора эмбрионов для живого анализа21
- Заселите свежую клетку сбора эмбрионов свежими мухами.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как коммерчески доступные клетки коллекции рекомендуется, сбор клетки могут быть легко построены из пустых бутылоклетать 21.- Отбросить или передать взрослых мух из бутылок, когда многие куколки начинают затемнение на этапе p14; при 20 градусов по Цельсию это происходит примерно через 14 дней после того, как яйца былиотложены 22.
- Разрешить куколки люк и заполнить бутылки на 12-24 ч.
- Передача свежих мух в небольшой клетке сбора с помощью небольшой воронки над коллекцией клетки открытия, чтобы предотвратить мух от побега. Объедините до 3 бутылок для производства густонаселенной клетки, содержащей от 200 до 500 мух.
- Передача летит в клетку сбора, нажав бутылку мухи против твердой поверхности неоднократно (оглушить мух). Затем откройте и инвертировать бутылку мухи над воронкой клетки сбора. Нажмите открытую бутылку на коллекционую клетку несколько раз, чтобы бросить мух в клетку сбора.
- Закройте открытую бутылку мухи, быстро установив его на его вилку. При передаче открытой бутылки мухи из воронки в его вилку, убедитесь, что бутылка открытия точек вниз, как мухи, как правило, ползти от источника постукивания.
- Нажмите воронку против открытия клетки мухи и нажмите клетку несколько раз на твердой поверхности, чтобы оглушить мух внутри. Немедленно удалите воронку и закрепайте свежую виноградную тарелку к открытию клетки мухи. Используйте маркировку ленты для обеспечения виноградной пластины. Повторите этот процесс, чтобы объединить до 3 бутылок для производства густонаселенной клетке сбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, мухи могут быть анестезировать с помощью CO2 или других летать спальные агенты; однако это увеличит период акклиматизации в шаге 1.2.
- Акклиматизировать новую коллекционую клетку на 24-48 ч. Если были использованы CO2 или любые другие спящие агенты, акклиматизуумизууте клетку сбора, по крайней мере 48 ч.
- Замените виноградную тарелку в клетке сбора свежей, содержащей дрожжевую пасту два раза в день, 8-10 ч друг от друга.
- Установка свежей клетки коллекции каждые 5 дней.
2. Сбор и подготовка эмбрионов для визуализации
- Получение эмбрионов с синхронизированным развитием
- Обмен виноградной пластины на коллекционные клетки со свежим, содержащим мазок дрожжевой пасты в центре. Разрешить мухам заложить эмбрионы в течение 1 ч. Подай старую виноградную тарелку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи могут оплодотворять эмбрионы до их укладки. Первая пластина сбора будет содержать многие из этих предварительно развитых эмбрионов. Разрешение мухам сбрасывать старые эмбрионы в первую очередь улучшит синхронизацию развития между эмбрионами. - Обмен виноградной пластины на свежий, содержащий мазок дрожжевой пасты в центре и пусть мухи лежали эмбрионы в течение 10 минут. Подай старую виноградную тарелку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать замедления эмбрионального развития на холодных тарелках, разогрейте виноградную пластину и дрожжевую пасту до комнатной температуры перед использованием. - Обмен виноградной пластины со свежим (без дрожжевой пасты) и сохранить старую виноградную тарелку, он имеет эмбрионы для визуализации. При необходимости продолжайте собирать эмбрионы из этой клетки, повторяя шаг 2.1.2 и 2.1.3.
- Обмен виноградной пластины на коллекционные клетки со свежим, содержащим мазок дрожжевой пасты в центре. Разрешить мухам заложить эмбрионы в течение 1 ч. Подай старую виноградную тарелку.
- Возраст собирать эмбрионы в течение 30-45 мин для изображения синцитиальных подразделений23.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изображения синцитиальной стадии бластодерма в эмбриональном развитии эмбриональные эмбрионы должны быть установлены и на микроскопе в течение 90 минут после сбора. При попытке этого протокола в первый раз, возраст эмбрионов 10-20 мин в шаге 2.2, чтобы обеспечить дополнительное время для настройки между шагами. - Дехорионатные эмбрионы с 50% отбеливателем в воде DI.
- Передача выдержанных эмбрионов из шага 2.2 в сито 140 нм путем заполнения виноградной пластины водой DI, мягко вытесняя эмбрионы с помощью кисти краски, и заливки воды эмбрионами в сито 140 нм(рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано над раковиной или 1000 мл стакана. - Энергично промыть эмбрионы с помощью воды DI с помощью шприц бутылки. Сухие эмбрионы, смая сито на сухом бумажном полотенце. Пятно сито, пока он не перестанет оставлять водяные следы на бумажном полотенце (Рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите все дрожжевой пасты из эмбрионов, как это может сделать лечение отбеливателя неэффективным в следующем шаге. - Заполните пустую 10-сантиметровую тарелку свежеприготовленным 50% отбеливателем, разбавленным водой DI (1:1 отбеливатель: DI вода). Опустите сито в 50% отбеливатель в течение 2 мин 45 с. Запустите секундомер, как только сито коснется 50% отбеливателя. Пятно сито в и из 50% отбеливателя 3-4x в первые 15 с распада эмбриона сгустки (Рисунок 1C).
- Энергично промыть эмбрионы с помощью воды DI с помощью шприц бутылки. Высушите эмбрионы, смая сито на сухом бумажном полотенце. Повторите энергичный промыть и помарки процесса сушки для 5x (Рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это самый важный шаг для удаления оставшихся над хорионом. Используйте полную бутылку ди-шприц и использовать половину бутылки в этом шаге. - Передача помарки высушенных эмбрионов из сито на 10 см виноградных пластин с помощьюкисти 21 (рисунок 1E)
ПРИМЕЧАНИЕ: Ручная дихлоринация может быть использована в качестве альтернативы декорации отбеливателя24.
- Передача выдержанных эмбрионов из шага 2.2 в сито 140 нм путем заполнения виноградной пластины водой DI, мягко вытесняя эмбрионы с помощью кисти краски, и заливки воды эмбрионами в сито 140 нм(рисунок 1A).
Рисунок 1: Дехорионация эмбрионов. (A)Эмбрионы были собраны с помощью бутылки шприца DI H20, кисти краски и сито 140 нм. (B)Эмбрионы были промыты энергично с помощью бутылки шприца DI H20 и пятно сухой над бумажным полотенцем. (C) Дехорионация эмбрионов была выполнена в 50% отбеливатель в течение 2 мин и 45с.( D ) Эмбрионы были промыты энергично с помощью бутылки шприца DI H20 и пятно сухой над бумажным полотенцем. Это было повторено 4 раза, чтобы удалить избыток хориона. (E)Эмбрионы затем были перенесены на 10 см виноградной пластины с помощью кисти краски. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
3. Монтаж эмбрионов для крышки
- Под стереомикроскопом, оснащенным накладным освещением гусиной шеи, организуйте два ряда по 15-20 эмбрионов на чистом участке виноградной тарелки с помощью инструмента сборщика яиц. Выравнивание эмбрионов на их брюшной стороне в той же ориентации по отношению к передней и задней концов. Чтобы сделать яйцо сборщиков согнуть тонкий кончик пинцета из нержавеющей стали до 45 "угол. Для просмотра D / V ориентации эмбрионов см Кампос-Ортега и др.20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы брюшной поверхности сидеть на виноградной пластине, как эмбрионы будут нажаты на крышку скольжения в шаге 3,5, подвергая спинной поверхности для визуализации. Так как спинная поверхность намного льстит, чем вентраальная поверхность, визуализация спинной боковой поверхности увеличивает количество ядер, присутствующих в пределах одной плоскости. - Подготовка 75 мм х 25 мм силиконовый спейсер coverslip.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть подготовлено заранее. Подготовьте несколько обложек и храните их в слайд-боксе, чтобы сохранить их в чистоте.- Проследите контур 75 мм х 25 мм крышки на 1,6 мм толщиной силиконовый лист спейсера и вырезать силиконовый спейсер с помощью ножниц(рисунок 2A).
- Используя лезвие бритвы, вырежьте 40 мм х 15 мм вставки из spacer(рисунок 2A).
- Приклейте проем на крышку и полосу 10 йл гептана клей вниз подвергаются крышки стекла вставки (Рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ввод вниз и даже полоса обеспечит визуализации эмбрионов на той же плоскости z.
- Пока гептановый клей из шага 3.2.3 высыхает, вырезаем прямоугольную секцию виноградной пластины, содержащую эмбрионы из шага 3.1.
- Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать прямоугольник (менее 40 мм х 15 мм) вокруг двух рядов эмбрионов. Не удаляй прямоугольник еще.
- Вырежьте второй прямоугольник рядом с первым. Удалите второй прямоугольник с помощью прямой стороны края шпателя из нержавеющей стали.
- Аккуратно сдвиньте прямой край шпателя из нержавеющей стали под первый прямоугольник и удалите его(рисунок 2B).
- Поместите вырез виноградной пластины с эмбрионами на внешней стороне 3,5 см блюдо(рисунок 2C).
- Под стереомикроскопом опустите подготовленную крышку над эмбрионами и аккуратно прижимите два ряда эмбрионов к клею(рисунок 2D).
- Если микроинъектирование эмбрионов, пропустить шаг 4.1. Если не микроинъектирование продолжать шаг 3,7.
- Обложка эмбрионов путем заполнения силиконового спейсера (на полпути к вершине) с 1:1 - галоуглеродное масло 700: галоуглеродное масло 27.
- Линия нижние края 4-слайд пластины адаптер с двойной односторонней лентой, чтобы предотвратить крышку скольжения от перемещения, но убедитесь, что не поместить ленту на пути объективного объектива. Эта лента имеет решающее значение. Если крышки только сидя на адаптере, он будет двигаться на протяжении всего приобретения. Намонтировать крышку скольжения на 4 слайд пластины адаптер.
Рисунок 2: Подготовка и монтаж coverslip. (A)Контур 75 мм х 25 мм крышки был прослеживается на 1,6 мм толщиной силиконового листа. Используйте ножницы, чтобы вырезать контур. 40 мм х 15 мм вставка были вырезаны из силиконового спейсера, а затем установлены на крышку. Полосатый 15 йл вниз по центру вставки. (B)Два ряда из 15-20 эмбрионов были организованы на виноградной пластине в области меньше, чем 40 мм х 15 мм, то эта область была вырезана с помощью бритвы и шпателя из нержавеющей стали. (C)Вырезать виноградную тарелку были помещены на верхней части пустой 3,5 см блюдо. (D)Под стереомикроскопом, крышки от (A) был понижен и зародыши были вставлены на полосу клея. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
4. Дестикации и микроинъектирования эмбрионов
- Поместите крышку с эмбрионами на слайд, чтобы предотвратить дно крышки от пачкаться во время высыхания и микроинъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка скольжения будет изображен без слайда прилагается к нему. Поэтому для визуализации необходим перевернутый микроскоп. - Высасывка эмбрионов в течение 5-10 мин, в зависимости от температуры помещения. Эмбрионы, используемые для визуализации в репрезентативных результатах, высыхали в течение 7 минут при 20 градусах Цельсия в камере, содержащей 1:1 слой бусины кремнеземного геля над сушительнымагентом (рисунок 3A).
- Сразу после высыхания накройте эмбрионы 1:1 - галоуглеродным маслом 700: галоуглеродное масло 27. Заполните силиконовый спейсер на полпути к вершине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно смешивать высоковязкое галоуглеродное масло с низкой вязкостью галоуглеродного масла. Чистое галоуглеродное масло 700 (высокая вязкость) замедляет прогрессирование клеточных циклов 30 мин после нанесения. Смесь галоуглеродного масла 700 и галоуглеродного масла 27 1:1 зафиксировала этот артефакт. - Загрузите микроинъекции иглы с инъекционным, а затем смонтировать один к микроинжектору и разрезать его под давлением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Практика шаг 4.4 несколько раз, прежде чем выполнять полный анализ с любыми ценными реагентами. Это самый сложный шаг в процессе микроинъекции.- Загрузите микроинъекции иглы с 2 йл инъекционных с помощью расширенной нагрузки отзыв. Требуется только одна микроинъекция иглы, но это хорошо, чтобы иметь запасные загруженные иглы рядом так подготовить 2 или 3 иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице материалов для спецификаций на расширенные советы погрузки. Микроинъекции иглы не могут быть загружены без расширенной загрузки советы из-за уникальной природы нашей техники микроинъекции, которая опирается на строительство давления воздуха внутри запечатанной и загруженной иглы до открытия его кончик. - Наведать иглу на микроинжектор и угнетать поршень на полпути к кончику. Цель состоит в том, чтобы увеличить давление воздуха внутри стеклянной капиллярной(рисунок 4A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микроинжектор на основе поршеня на основе минерального масла без минерального масла. Вместо того, чтобы наращивать давление с помощью минерального масла, используйте поршень для создания давления воздуха. - Опустите стеклянную иглу на стеклянную горку и разрежьте кончик иглы открытым с помощью новой #9 бритвы. Вырезать иглу под углом 45 ",, чтобы произвести резкий открытый кончик. Инжектор должен стекать вниз к нижней части кончика, не вытекая из иглы. Аккуратно добавьте 20 мкл галоуглеродного масла над кончиком иглы и перережьте его открытым при 45 градусах. Инъекционные должны начать течь быстро.
- Немедленно понижает давление воздуха путем вытягивать plunger но обеспечить поддерживать непрерывную скорость потока для того чтобы предотвратить иглу от засорять с мембраной зародыша между инъекциями. (Рисунок 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если инжектор ясен, просмотрите скорость инъекционной потока, подняв микроинъекцию иглы в и из галоуглеродного масла и наблюдая скорость образования инъекционных капель под стереомикроскопом. Отрегулируйте давление воздуха, угнетая поршень несколько кликов за один раз, а затем окунуть микроинъекции кончик в и из галоуглеродного масла для просмотра скорости образования для новых капель после корректировки. - Используйте микроманипулятор, чтобы распоставить иглу в центре поля зрения, затем поднимите иглу с помощью микроманипулятора и удалите стеклянную горку из-под нее. Игла теперь откалибровывается для инъекций.
- Загрузите микроинъекции иглы с 2 йл инъекционных с помощью расширенной нагрузки отзыв. Требуется только одна микроинъекция иглы, но это хорошо, чтобы иметь запасные загруженные иглы рядом так подготовить 2 или 3 иглы.
Рисунок 3: Диаграмма камеры дестикации. (A)Это диаграмма камеры высыхания. Камера состоит из слоя кремнеземного геля 1:1 над слоем дририта. Для выполнения высыхания эмбрионы помещались поверх одной крышки пластины. Камера высыхания была закрыта 7 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Микроинъектные эмбрионы
- Поместите эмбрионы на стадию стереомикроскопа под микроинъекцию иглы, но не опустите иглу.
- Сосредоточьтесь на эмбрионах при увеличении в 50 раз.
- Опустите иглу, пока она не попадает в ту же плоскость фокусировки, что и эмбрионы. Перемещая слайд одной рукой и оперив микроинжектором с другой, вводите один ряд эмбрионов.
- Поднимите иглу и поверните слайд на 180 градусов, чтобы подвергнуть второй ряд эмбрионов микроинъекции иглы. Опустите иглу и ввись второй ряд эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Попробуйте сделать это менее чем за 10 минут. Оставьте некоторые не-инъекционные эмбрионы, которые будут использоваться в качестве элементов управления.
Рисунок 4: Microinjection иглы подготовки. (A) На этойиллюстрации, интенсивность пурпурный в игле является репрезентативным для давления воздуха. Загруженная игла была установлена на микроинжектор и поршень был расширен на 50% для повышения давления воздуха внутри иглы. Убедитесь, что поршень максимально убран до монтажа. (B)кончик иглы был сокращен под давлением и поршень был убран, чтобы уменьшить давление воздуха и скорость потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
5. Изображение на анализаторе высокого содержания
- Перед запуском этого анализа создайте карту пластин для адаптера слайдов. Используйте редактор держателя пластины, найденный в меню Plate Map Manager, чтобы войти в измерение для пользовательского адаптера пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для коммерчески доступного адаптера пластины была создана пользовательская карта пластин (см. таблицу материалов). Карта пластин содержит следующие настройки; Толщина слайда: 1000 мкм, нижняя высота: 1,607 мм, изменчивость нижней высоты: 100 мкм, субстрат материал: стекло, толщина крышки: 150 мкм, положение крышки: нижние - ряды: 1 - расстояние: 56,987 мм, колонны: 4 - расстояние 28,391, размер и форма: прямоугольник, ширина 23,00 мм, высота: 73,00 мм, смещение до А1 21,29 мм - 42,74 мм) - Загрузите адаптер слайда на микроскоп и используйте функцию предварительного просмотра, чтобы плитка яркое поле 10x изображение обложки.
- Выберите эмбрион из верхней или нижней части строки, затем выберите Objective и переключитесь на 60x (NA 0.95). Определите соответствующую экспозицию для желаемого канала флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание интенсивности лазера под 25% для изображения живых клеток. - На главной приборной панели используйте функцию Preview для плитки флуоресцентного 60x изображения, содержащего оба ряда эмбрионов.
- На главной панели мониторинга выберите меню Binning drop down menu и установите биннинг до 1 x 1 для оптимального разрешения.
- Используйте вкладку z Stack Setup для определения параметров стеков z.
- Во вкладке z Stack Setup используйте стрелки Up and Down, чтобы найти верхние и нижние лимиты стеков. После того, как верхние и нижние пределы определены, выберите значок Зеленый карандаш, чтобы сохранить позицию стека z. Обратите внимание на позицию стека z, поскольку она будет использоваться в шаге 5.6.5.
- Во вкладке z Stack Setup используйте поле ввода z Step, определяя расстояние между ломтиками z.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество срезов определяется путем модуляции шага 5.6.1 и 5.6.2. - На главной приборной панели, право нажмите на флуоресцентный канал и использовать режим изображения падение вниз меню, чтобы установить режим изображения на 3D.
- На главной приборной панели выберите Laser Autofocus Box, чтобы отключить автофокус.
- На главной панели мониторинга определите начальный фокус с позицией z-stack из шага 5.6.1, а затем выберите начальный фокус-бокс, чтобы отключить функцию «Переориентацияв каждой точкевремени».
- Во вкладке Поля используйте меню «Поле» для включения пользовательских точек,а затем используйте Стрелки для выбора точек для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал времени между приобретениями (шаг 5.8) будет определять, сколько пользовательских точек могут быть изображены одновременно. - Во вкладке Time Series выберите поле Серии времени Acquire, чтобы включить функцию серии времени, а затем определите общее количество очков времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: 6 пользовательских точек х 5 z ломтиками х 80 стеков и 2400 изображений, 2400 изображений х 8,2 МБ на изображение и 19,68 ГБ дискового пространства. - На главной панели мониторинга используйте поле ввода имен, чтобы назвать параметры приобретения, а затем выберите Файл и Сохранить, чтобы сохранить настройки приобретения.
- На главной панели мониторинга выберите кнопку Scan для запуска приобретения.
6. Обработка изображений по почте
- Перетащите и уронить файл xdce на Фиджи, чтобы открыть серию изображений в качестве многомерного гиперстаха.
- Сохраните гиперстах в качестве файла tif.
- Создавайте проекции максимальной интенсивности и сохраните их в качестве тиф-файлов.
- Соберите библиотеку проекций максимальной интенсивности и постройте конвейер для извлечения и анализа данных.
Representative Results
Подход, представленный в этом протоколе, был использован для изучения роли микротрубочек в эндоплазмической ретикулуме (ER) реорганизации во время митоза в эмбрионе Дрозофилы 15. Во время митоза, структура ER показывает драматическую реорганизацию, однако, силы, которые управляют этими изменениями плохо понимаются. Недавно было показано, что семейство белков ER, формирующих белки, способствует образованию трубочек ER25,26,27,28,которые известны своей близостью с микротрубочками28. Для изучения рулона микротрубочек по морфологии ER, методы, представленные в протоколе, были использованы для генерации данных для количественного сравнения влияния нескольких микроинъекций медикаментозного лечения на реорганизацию ER во время митоза. Колхицин, который предотвращает новую полимеризацию микротрубочек, было установлено, резко уменьшить реорганизацию ER во время митоза, как показано на рисунке 5 и рисунок 6. Кроме того, описанный здесь подход позволил изготовить данные визуализации кругов времени для 32 эмбрионов. Измерения среднего и максимальной интенсивности были произведены из 12 800 регионов, представляющих интерес, с использованием пользовательского сценария MATLAB, который также генерировал описательную и выводную статистику, жизненно важную для сопоставления лекарственных препаратов. Благодаря наличию молекулярных зондов и простоте микроинъекций описанные здесь методы легко адаптируются для изучения различных биологических процессов с помощью количественной оценки интенсивности флуоресценции.
Рисунок 5: Репрезентативные изображения Rtnl1-GFP и обогащения ReepB-GFP на шпиндельных полюсах во время митоза. (A) 60x поле зрения ReepB-GFP во время митоза в клеточном цикле 10. Синий квадрат представляет поле зрения, используемое для панелей B-E. Панель А обрабатывается пороговым бинарным фильтром. Этот фильтр не был применен к панелям B-E, поскольку он исключает данные из пикселей ниже установленного порога. (B,D) ReepB-GFP под контролем, и в колхицине. (C,E) Rtnl1-GFP под контролем, и в колхицине. Эта цифра была изменена с Diaz et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Количественная оценка обогащения Rtnl1-GFP и ReepB-GFP на шпиндельных полюсах во время митоза. 20 шпинделей и 20 цитоплазмы ROIs через 10 кадров были проанализированы для 32 эмбрионов в следующих условиях. (A) 10% DMSO контрольные инъекции для Rtnl1-GFP. Контроль эмбрионов показали 0,1-кратное увеличение обогащения (p'lt;0.001 для всех образцов на T210) по сравнению с неинжесированы образцов (p lt; 0.001 для всех образцов на T210). (B) ReepB-GFP эмбрионов вводили с 10% DMSO в качестве контроля. Контрольные эмбрионы показали 0,1-кратное увеличение обогащения (p'lt;0.001 для всех образцов на T210) по сравнению с не введенными образцами(рисунок 1E; p lt; 0.001 для всех образцов на T210). (C)Эмбрионы Rtnl1-GFP, вводимые с 5 КМ Колхицином. Здесь мы измерили уменьшение обогащения Rtnl1-GFP до шпинделей (p lt; 0.001 для всех образцов на T210) по сравнению с контрольами (A) (p lt; 0.001 для всех образцов на T210). (D)ReepB-GFP эмбрионов вводили с 5 МКМ Колхицин. Мы измерили снижение обогащения ReepB-GFP до шпинделей (p'lt;0.001 для всех образцов на T210) по сравнению с контрольами (B) (p'lt;0.001 для всех образцов на T210). Эта цифра была изменена с Diaz et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| 1. Дрожжевая паста21 | 2. Виноградные тарелки21 | 3. Гептановыйклей 24 |
| 1.1 Добавить 7 граммов активных сухих дрожжей в 50 мл конического. Добавьте 9 миллилитров воды DI и смешайте даже постоянства с металлическим шпателем. | 2.1 Сделать решение: Добавить 6 граммов агара до 140 мл воды DI в 250 мл колбы и автоклав его. | 3.1 Заполните стеклянный сцинтилляционный флакон с 50 дюймами двухсторонней ленты. |
| 1.1 Добавить 7 граммов активных сухих дрожжей в 50 мл конического. Добавьте 9 миллилитров воды DI и смешайте даже постоянства с металлическим шпателем. | 2.2 Сделать раствор b: Смешайте 0,1 грамма метилового парабена в 2 мл этанола, затем добавьте этот раствор в 60 мл концентрата грейпфрутового сока. | 3.2 Добавьте 20 мл гептана и уплотнительного стеклянного сцинтилляционного флакона с парафильмом. Поверните на ночь при комнатной температуре. |
| 2.3 Сразу после автоклавного раствора a, смешайте в растворе b и вылейте смесь в 10 x 35mm perti блюда. (делает 35 виноградных тарелок) | 3.3 Удалите пластиковый ленточный мусор, переведя клей в 2 15 мл конических трубок и центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 минут. | |
| 2.4 Разрешить виноградные тарелки установить при комнатной температуре на ночь с крышками пластины. Обложка пластины с крышками и хранить в 4C "после того, как они устанавливают. | 3.4 Передача клея супернатанта в 1,5 мл микроцентрифуг трубки для хранения. |
Таблица 1: Рецепты средств массовой информации и решений.
Discussion
Описанный здесь протокол является весьма универсальным и легко адаптируемым для изучения биологических событий на различных стадиях эмбрионального развития Дрозофилы. Этот протокол хорошо подходит для изучения биологических процессов, которые происходят в течение длительных периодов времени. Например, исследования клетчатой29,30 или формирование гетерохроматина доменов в Drosophila31,32может извлечь выгоду из использованияметодов,описанных в этом протоколе, поскольку эти процессы происходят в течение длительного периода времени. Кроме того, размер выборки может быть увеличен за счет уменьшения увеличения для изучения вопросов, которые требуют меньше оптического разрешения, таких как время между синцитиальнымиподразделениями 33 или продолжительностьгастрипуляции 34. Аналогичным образом, цель 20x позволяет двум эмбрионам быть изображены в одной плоскости изображения. Методы, используемые в этом протоколе, обеспечивают динамичную платформу для задавать биологические вопросы, используя эмбриональное развитие в качестве образцовой системы количественного анализа.
В этом протоколе есть три важных шага. После декорионации в 50% отбеливатель крайне важно, чтобы эмбрионы промыть и высушить энергично 5 раз (2.3.4). Этот шаг удаляет оставшиеся мелкие кусочки хориона. Оставшийся хорион будет препятствовать поле зрения при визуализации эмбриона. При монтаже эмбрионов на стеклянную крышку (3,5) важно прижимать эмбрионы к клею с равномерного давления. Это поместит эмбрионы на той же плоскости z. При резке открыть микроинъекции иглы, важно, чтобы втягивать поршень немедленно регулировать скорость потока иглы или вы потеряете все ваши инъекционные.
Наше исследование было ограничено двумя факторами. Первым фактором было не наличие автоматизированного процесса сегментации. Однако мы разработали сценарий ручной сегментации с помощью MATLAB; с генетически закодированным маркером шпинделя этот процесс может быть автоматизирован. В будущем мы хотели бы производить CNN-RFP21, Rtln1-GFP и CNN-RFP; Трансгенные линии ReepB-GFP для автоматической сегментации шпинделя. Для получения дополнительной информации о нашем скрипте и анализе трубопровода MATLAB, обратитесь к дополнительным материалам Diaz et al.15. Во-вторых, мы также были ограничены нашим интервалом приобретения 35 с, что позволило нам только изображение 6 эмбрионов одновременно. Более длительный интервал приобретения позволит нам изображение больше эмбрионов одновременно. Хотя пропускная способность доставки лекарств может быть увеличена за счет замены микроинъекции шагом пронизывания, мы обнаружили, что это было ненужным, так как наш размер выборки уже был ограничен интервалом приобретения.
В то время как этот протокол был использован для изображения эмбрионального развития Drosophila, общий подход адаптируется для изучения эмбрионального развития в других многоклеточных модельных системах, таких как C. elegans,Sea Urchins и Xenopus. Эмбрионы чрезвычайно полезны для количественного анализа, так как они легко синхронизируются путем сбора или оплодотворения. Кроме того, эмбрионы не двигаются и не уплывает из поля зрения, что позволяет использовать простое многоапунктное программное обеспечение, способное создавать видео замедленного действия для количественного анализа. Хотя мы использовали анализатор высокого содержания в нашем исследовании, любая перевернутая микроскоповая система, способная к многотойной приобретению, может быть в паре с методами, упомянутыми в настоящем.
Аналогичные результаты можно получить с помощью многоточенного приобретения, способного перевернутого конфокального микроскопа; однако преимущества анализатора высокого содержания возникают по мере увеличения размера выборки для изучения вопросов, требующих меньшего разрешения во времени. Очевидным преимуществом использования анализатора высокого содержания является возможность изображения 4 отдельных слайдов одновременно по сравнению с 1 слайдом на традиционных системах. С полным набором из 4 слайдов и 40 эмбрионов на каждом слайде, 160 эмбрионов могут быть изображены в течение нескольких часов, до тех пор, как интервал приобретения, по крайней мере 15 мин между кадрами. Другим важным преимуществом использования анализатора высокого содержания является то, что образцы полностью закрыты от любых внешних источников света, что необходимо для измерений на основе интенсивности флуоресценции. Наконец, анализатор высокого содержания, используемый в нашем исследовании, имеет 5,5-мегапиксельную камеру CMOS, которая обеспечивает щедрое поле зрения 221,87 мкм при увеличении в 60 раз. Это большее поле зрения позволило нам изображение половины эмбриона на приобретение точки.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
UD, WFM и BR поддерживаются Центром клеточного строительства, Национальным научным фондом (NSF) Научно-технический центр, в соответствии с грантовое соглашение DBI-1548297. BR также поддерживается через NSF CAREER награду, 1553695.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
| 100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
| 250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
| 3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
| 4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
| ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
| Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
| Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
| Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
| Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
| DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
| Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
| Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
| Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
| Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
| Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
| Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
| Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
| Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
| W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
| Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| EQUIPMENT | |||
| Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
| Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
| Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
| GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
| Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
| Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |
References
- Zanella, F., Lorens, J., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).
- Jennings, B. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).
- Bickle, M. The beautiful cell: high-content screening in drug discovery. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy based high content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).
- Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Letsou, A., Bohmann, D. Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).
- Sullivan, W., Theurkauf, W. The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo. Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).
- Schejter, E., Wieschaus, E. Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo. Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).
- Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos. Development. 103 (4), 675-686 (1988).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development. Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).
- Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).
- Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis. PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).
- Shibata, Y., et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).
- Bergman, Z., et al. Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo. PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).
- Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells. The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer Science & Business Media. eBook ISBN 978-3-662-22489-2 (2013).
- Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-087969827-0 (2000).
- Bainbridge, S., Bownes, M.
- Bate, M., et al. Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. Chapter 3. ISBN 978-087969899-7 (1993).
- Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, Academic Press. 113-123 (2001).
- Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules. Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).
- Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).
- Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network. The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).
- Loncar, D., Singer, S. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Mazumdar, A., Mazumdar, M. How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster. Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).
- Yuan, K., O'Farrell, P. TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos. Genes & Development. 30 (5), 579-593 (2016).
- Walther, M., et al. Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis. Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).
- McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos. Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).
- Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos. Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).
