Summary
Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9 delle cellule B umane primarie per knockout genico (KO) e knock-in (KI) per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle cellule B e lo sviluppo di terapie a cellule B.
Abstract
Le cellule B sono linfociti derivati da cellule staminali ematopoietiche e sono una componente chiave del braccio umoristico del sistema immunitario adattivo. Fanno candidati attraenti per le terapie a base cellulare a causa della loro facilità di isolamento dal sangue periferico, della loro capacità di espandersi in vitro e della loro longevità in vivo. Inoltre, la loro normale funzione biologica - per produrre grandi quantità di anticorpi - può essere utilizzata per esprimere grandi quantità di una proteina terapeutica, come un anticorpo ricombinante per combattere l'infezione, o un enzima per il trattamento delle ezimopatie. Qui, forniamo metodi dettagliati per isolare le cellule B umane primarie dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBBC) e attivare / espandere cellule B isolate in vitro. Dimostriamo quindi i passaggi necessari per l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 per ko site-specific di geni endogeni nelle cellule B. Questo metodo consente un KO efficiente di vari geni, che può essere utilizzato per studiare le funzioni biologiche dei geni di interesse. Vengono quindi dimostrati i passaggi per l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 insieme a un vettore ricombinante, adeno-associato, virale (rAAV) per un'efficiente integrazione site-specific di una cassetta di espressione transgena nelle celle B. Insieme, questo protocollo fornisce una piattaforma ingegneristica passo-passo che può essere utilizzata nelle cellule B umane primarie per studiare le funzioni biologiche dei geni e per lo sviluppo di terapie a cellule B.
Introduction
Le cellule B sono un sottogruppo del linfocita derivato dalle cellule staminali ematopoietiche. Svolgono un ruolo fondamentale nel sistema immunitario umoristico adattivo producendo grandi quantità di anticorpi in risposta alle sfide immunitarie1. Le cellule B sono anche precursori delle cellule B della memoria e delle cellule plasmatiche di lunga durata differenziate e terminali, fornendo così un'immunità umorale duratura2. Le cellule plasmatiche, in particolare, sono uniche tra le cellule immunitarie nella loro capacità di produrre grandi quantità di un anticorpo specifico mentre sopravvivono per anni odecenni 3. Inoltre, la facilità di isolamento dal sangue periferico rende il lignaggio delle cellule B un ottimo candidato per nuove terapie a base cellulare4.
In precedenza, metodi di integrazione casuali, come quelli che utilizzano vettori lentivirali o un transposone della Bella Addormentata, sono stati utilizzati per progettare cellule B per la consegna transgena el'espressione 5,6,7,8. Tuttavia, la natura non specifica di questi approcci rende difficile studiare le funzioni biologiche di un gene specifico nelle cellule B e comporta un rischio intrinseco di mutagenesi inserimento ed espressione transgena variabile e/o silenziamento nell'ambiente terapeutico.
Il sistema CRISPR/Cas9 è un potente strumento di ingegneria genomica che consente ai ricercatori di modificare con precisione il genoma di varie cellule in numerose specie. Recentemente, due gruppi, tra cui il nostro, hanno sviluppato con successo metodi per l'espansione ex vivo e l'ingegneria genomica mirata delle cellule Bumane primarie 9,10. Descriveremo il processo di purificazione delle cellule B umane primarie da un campione di leucforesi. Successivamente, descriveremo il nostro protocollo aggiornato per l'espansione delle celle B e l'attivazione di celle B isolate. Descriveremo quindi un processo per eliminare il cluster di differenziazione 19 (CD19), uno specifico recettore delle cellule B e un segno distintivo delle cellule B, per elettroporazione per introdurre l'mRNA CRISPR /Cas9 insieme allo sgRNA CD19 nelle cellule B attivate.
Cas9 mRNA viene tradotto e si lega allo sgRNA CD19 per formare un complesso crispr/cas9-sgRNA ribonucleoproteina (RNP). Successivamente, lo sgRNA nel complesso porta Cas9 a creare una rottura a doppio filamento (DSB) alla sequenza bersaglio sull'esone 2 del gene. Le cellule ripareranno il DSB "unendo fine non omologha" introducendo o eliminando i nucleotidi, portando a mutazioni frameshift e causando l'eliminazione del gene. Misureremo quindi la perdita di CD19 per citometria del flusso e analizzeremo la formazione di indelenze tracciando le indeli mediante analisi di decomposizione (TIDE).
Descriveremo quindi il processo di utilizzo di CRISPR/Cas9 insieme a un vettore AAV6 ricombinante (rAAV6, un modello donatore per la riparazione diretta dall'omologia (HDR)) per mediare l'inserimento specifico del sito di proteine fluorescenti verdi avanzate(EGFP) nel gene 1 (AAVS1) adeno-associato al virus. Il gene AAVS1 è un locus attivo senza funzioni biologiche note e un sito di integrazione virale AAV sul genoma umano; pertanto, è considerato un "porto sicuro" per l'ingegneria del genoma. Qui, segnalamo che l'espansione e l'attivazione delle cellule B hanno permesso un'espansione fino a 44 volte in 7 giorni di coltura (Figura 1). L'elettroporazione delle cellule B ha mostrato una leggera riduzione della salute generale delle cellule(figura 2A)a 24 ore dopo la trasfezione. L'analisi del grafico a dispersione del marcatore CD19 (Figura 2B) ha mostrato una riduzione fino all'83% delle celle modificate (Figura 2C).
L'analisi TIDE dei cromatografi(figura 3A)ha rivelato che la % delle indeli era simile alla perdita di proteine % per citometria del flusso(figura 3B). L'analisi della citometria del flusso dell'esperimento KI ha mostrato che le cellule che hanno ricevuto vettore AAV (Figura 4), insieme all'RNP, hanno espresso fino al 64% di cellule positive all'EGFP (Figura 5A) e in seguito hanno mostrato un'integrazione riuscita mediante reazione a catena della polimerasi di giunzione (PCR)(Figura 5B). Il conteggio delle celle ha mostrato che tutti i campioni sono stati rapidamente recuperati entro 3 giorni dopo l'ingegneria (Figura 5C).
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Protocol
Campioni di leucferesi da donatori sani sono stati ottenuti da una banca del sangue locale. Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati determinati come esenti per la ricerca dall'Institutional Review Board (IRB) e sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Committee (IBC) dell'Università del Minnesota.
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nel rispetto della precauzione universale per gli agenti patogeni ematici, con tecniche sterili / asettiche e adeguate apparecchiature di livello-2 di biosicurezza.
1. Preparare integratori per il mezzo di espansione delle cellule B
- Ricostituire l'oligonucleotide CpG ad una concentrazione di 1 mg/mL.
- Ricostituire il ligando CD40 (CD40L) ad una concentrazione di 100 μg/mL.
- Ricostituire l'IL-10 umano ricombinante (rhIL-10) ad una concentrazione di 50 μg/mL.
- Ricostituire l'IL-15 umano ricombinante (rhIL-15) ad una concentrazione di 10 μg/mL.
NOTA: Mantenere ogni integratore in piccole aliquote a -20 °C a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
2. Preparare il mezzo basale
- Combinare il mezzo basale a cellule B con il 5% (v/v) integratore multimediale per l'espansione delle cellule immunitarie in vitro (ad esempio, CTS Immune Cell SR) e l'1% (v/v) penicillina e streptomicina.
- Sterilizzare il mezzo basale utilizzando un adattatore filtrante da 0,22 μm in una bottiglia sterilizzata.
- Mantenere il mezzo basale a 4 °C per un massimo di 1 mese.
3. Preparare il mezzo di espansione delle celle B
- Trasferire la quantità richiesta del mezzo basale in un contenitore sterile per coltura delle cellule B a 5 × 105 cellule/mL.
- Integrare il mezzo basale con 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 e 10 ng/mL rhIL-15.
- Filtrare il mezzo di espansione della cella B utilizzando un filtro da 0,22 μm.
- Equilibrare il mezzo di espansione delle cellule B nell'incubatore di coltura tissutale a 37 °C, 5% CO2 con umidità per almeno 30 minuti prima dell'uso.
NOTA: Preparare un nuovo mezzo di espansione b-cell da utilizzare per un giorno. Non preparare il mezzo di espansione della cella B da utilizzare per più giorni. Questa ricetta multimediale incoraggia la proliferazione delle cellule B della memoria e delle cellule B umane primarie attivate.
4. Purificazione ed espansione delle cellule B umane
NOTA: Aggiungere il 99-100% di alcol isopropile a un contenitore di congelamento a temperatura controllata, seguendo le istruzioni del produttore, e raffreddare il contenitore di congelamento a 4 °C prima di iniziare il passaggio 4.1.
- Isolare i PBBC da un campione di leucforesi
- Trasferire un campione di leucforesi (circa 8-10 ml) in un tubo conico sterile da 50 ml.
- Portare il volume a 35 mL con 1x soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS).
- Sovrapporre con cura un campione di leucforesi da 35 mL su 15 mL di mezzo gradiente di densità.
- Centrifugare a 500 × g per 25 minuti senza freno, rimuovere lo strato plasmatico senza disturbare il cappotto buffy (strato PBMC), raccogliere i PBMC dall'interfaccia e trasferirli in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml.
- Portare i PBBC a 50 mL con 1 PBS.
- Centrifuga a 500 × g per 5 minuti senza freno. Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet PBMC, che può apparire rosso.
- Aggiungere 7 mL di tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio, pipettare 3 volte per mescolare bene e incubare a temperatura ambiente (RT) per 3 minuti.
- Portare il volume a 50 mL con 1x PBS.
- Centrifuga a 400 × g per 5 min con freno a bassa resistenza. Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Il pellet dovrebbe apparire rosato o bianco.
NOTA: Per continuare a colturare le cellule B appena isolate, preparare il mezzo di espansione della cella B prima di iniziare l'isolamento delle cellule B (passaggio 4.2).
- Isolamento delle cellule B dai PBBC utilizzando il kit di isolamento negativo delle cellule B primarie umane
- Resuspend PBBC nel tampone di isolamento a una concentrazione di 5 × 107 celle/mL.
NOTA: se il numero totale di PBBC è inferiore a 5 × 107 celle, ridimensionare il volume del buffer di isolamento per mantenere 5 × 107 celle/mL. I volumi minimi e massimi di sospensione cellulare sono rispettivamente di 0,25 mL e 8 mL. - Trasferire fino a 8 mL (5 × 107 celle/ml) in un tubo sterile, polipropilene, fondo rotondo con tappo.
- Aggiungere 50 μL/mL di Cocktail Enhancer ai PBPC.
- Aggiungere 50 μL/mL di Isolation Cocktail ai PBPC, limitare il tubo e invertire 2-3 volte per mescolare.
- Incubare a RT per 5 min; al4° minuto di incubazione, microperline magnetiche a vortice per almeno 30 s.
- Trasferire 50 μL di microperline magnetiche per 1 ml di PBBC, limitare il tubo e invertire 2-3 volte per mescolare.
- Ricaricare fino a 10 mL con tampone di isolamento e pipettare delicatamente su e giù 2-3 volte.
- Posizionare il tubo in una stazione magnetica e incubare a RT per 3 minuti.
- Tenere insieme il magnete e il tubo e, in un unico movimento, invertire il magnete e il tubo insieme per versare la sospensione cellulare nel nuovo tubo. Scartare il vecchio tubo.
- Ripetere il passaggio 4.2.8 (ridurre il tempo di incubazione a 2 minuti) e versare la sospensione b-cell in un tubo conico pulito.
- Le cellule B arricchite sono pronte all'uso. Se le cellule verranno utilizzate immediatamente, continuare alla sezione 4.3 (Espansione delle cellule B umane). Controllare la purezza delle cellule B isolate per citometria a flusso (opzionale). Se le cellule devono essere congelate prima dell'uso, continuare al passaggio 4.2.12.
- Per congelare le cellule B, centrifugare a 400 × g per 5 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
- Rimospend le cellule in mezzo congelante a 107 cellule/mL e aliquota 1 mL/crioviale.
- Posizionare il crioviale nel contenitore di congelamento refrigerato e conservare a -80 °C durante la notte; quindi, trasferire il criooviale congelato in un serbatoio di azoto liquido; mantenere le cellule congelate fino a 1 anno.
NOTA: la resa prevista delle cellule B isolate è del 2%-8% dei PBBC totali, con una vitalità del 95%-99%.
- Resuspend PBBC nel tampone di isolamento a una concentrazione di 5 × 107 celle/mL.
- Espansione delle cellule B umane
NOTA: se si utilizzano celle B appena isolate, ignorare i passaggi da 4.3.1 a 4.3.5. Contare le cellule e trasferire il numero richiesto di cellule in un tubo conico sterile e continuare con il passaggio 4.3.6.- Siero bovino fetale pre-caldo (FBS) in un bagno d'acqua prima di scongelare le cellule B. Preparare 20 ml di mezzo di espansione delle cellule B, trasferire in un pallone T25 e pre-equilibrare il mezzo in un incubatore di coltura tissutale (a 37 °C, 5% DI CO2, con umidità) almeno 15 minuti prima dell'uso.
- Scongelare le cellule B in un bagno d'acqua a 37 °C. Durante l'attesa, trasferire 2 ml di FBS pre-riscaldato in un tubo conico sterile da 15 ml.
- Dopo che le cellule B sono state completamente scongelate, aggiungere immediatamente 1 mL di FBS pre-riscaldato, per quanto riguarda la goccia, nel campione. Incubare a RT per 1 min.
- Pipettare delicatamente per rimospendare il campione e trasferire l'intero volume, a goccia, in un tubo conico contenente 2 ml di FBS prerifatti.
- Portare il volume a 15 ml con PBS sterile 1x, cappuccio e invertire delicatamente il tubo 2-3 volte.
- Centrifuga a 400 × g per 5 min.
- Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare, rimescolare il pellet cellulare con 1 mL di mezzo di espansione della cella B pre-equilibrato e contare le cellule. Il numero totale di cellule deve essere di circa 107 celle.
- Trasferire le cellule in un pallone contenente 20 ml del mezzo di espansione delle cellule B pre-equilibrate. La concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere di circa 5 x 105 cellule/mL.
- Incubare il pallone verticalmente in un'incubatrice di coltura tissutale.
- Aggiornare completamente il mezzo di espansione ogni 2 giorni trasferendo l'intero volume di cellule B in un tubo conico sterile e ripetere i passaggi 4.3.6-4.3.9.
NOTA: Il pallone T25 può contenere 10-20 ml di mezzo; Il pallone T75 può contenere fino a 20-60 ml di mezzo.
5. Ingegneria primaria delle cellule B umane
- Progettare celle B a 48 ± 2 ore dopo l'espansione/attivazione per risultati ottimali. Preparare il mezzo di espansione delle cellule B, aliquota 1 mL del mezzo in una piastra di coltura tissutale a 48 pozze e pre-equilibrare in un incubatore di coltura tissutale almeno 15 minuti prima dell'uso.
NOTA: Quando si progetta uno sgRNA CRISPR/Cas9 per un gene di interesse, seguire i passaggi descritti di seguito.
- Progettare sgRNA utilizzando uno strumento online11.
- Progettare sgRNA su un esone comune a tutte le isoforme della proteina.
- Ordina sgRNA modificato chimicamente da aziende rispettabili.
- lo sgRNA di solito si presenta in forma lëfilizzata; ricostituire lo sgRNA in tampone Tris-EDTA (TE) sterile privo di DNasi/RNasi ad una concentrazione di 1 μg/μL. - Preparare il substrato transfetto CRISPR/Cas9 mescolando 1 μL (1 μg/μL) di sgRNA modificato chimicamente con 1,5 μL (1 μg/μL) di Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) di reazione di nucleasi per transfezione modificata chimicamente. Per il controllo, utilizzare 1 μL di TE buffer anziché sgRNA.
NOTA: Quando lo sgRNA CD19 viene utilizzato per un esperimento gene KO, vedere la figura 2 per i risultati. Quando lo sgRNA AAVS1 viene utilizzato per un esperimento KI genico, vedere la figura 5 per i risultati.- Tieni tutti i componenti sul ghiaccio.
- Mescolare delicatamente e trasferire 2,5 μL di substrato transfetto CRISPR/Cas9 per reazione in un tubo di un nastro a 8 tubi da 0,2 ml; accantonato a RT.
- Accendere un nucleofector (elettroporatore) e preparare i reagenti di trasfezione, come mostrato nella tabella 1.
NOTA: Questo è un buon passo per una pausa, se necessario, mettendo tutti i reagenti sul ghiaccio. Rimuovere tutti i reagenti dal ghiaccio quando sono pronti a riprendere l'esperimento. Quando si utilizza la proteina S.p. Cas9, lo sperimentatore DEVE pre-complesso CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteina mescolando 1 μg di sgRNA con 5 μg di proteina S.p. Cas9, evitando eventuali bolle e incubando la miscela a RT per almeno 20 minuti prima dell'uso per risultati ottimali. - Contare e trasferire 106 cellule B per reazione di trasfezione in un tubo conico sterile.
- Portare il volume a 15 mL con PBS sterile 1x e centrifugare a 400 × g per 5 min. Durante l'attesa, preparare il reagente di trasfezione della cella primaria (tabella 2) e accantonare a RT.
- Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Rimossare il pellet cellulare con 10 mL di PBS sterile 1x e centrifuga a 400 × g per 5 min.
- Scartare completamente il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Trasferire 0,5 μg di mRNA GFP modificato chimicamente (come reporter di trasfezione) per 106 cellule B al pellet cellulare (opzionale).
- Resopend il pellet cellulare con reagente di trasfezione a cellule primarie da 20 μL per 106 cellule B; mescolare delicatamente pipettando 5-6 volte. Trasferire 20,5 μL per reazione di trasfezione nel tubo da 0,2 ml della striscia a 8 tubi contenente 2,5 μL del substrato di trasfezione CRISPR/Cas9.
- Pipetta su e giù una volta per mescolare e trasferire l'intero volume (23 μL) in una cuvetta di trasfezione. Cappuccio e toccare delicatamente la cuvetta sulla panca per assicurarsi che il liquido copra il fondo della cuvetta.
- Utilizzare il protocollo b-cell primario umano sul nucleofector per la trasfezione.
NOTA: Il nucleofector (elettroporatore) può essere posizionato ed essere utilizzato al di fuori della cappa di coltura tissutale. Limitare la cuvetta per garantire la sterilità. - Riposare le celle elettroporate nella cuvetta a RT per 15 minuti.
- Trasferire 80 μL del mezzo di espansione pre-equilibrato della cellula B dalla piastra di coltura tissutale nella reazione di trasfezione nella cuvetta. Posizionare la cuvetta nell'incubatore di coltura tissutale per 30 minuti.
- Pipettare delicatamente un paio di volte per mescolare e trasferire l'intero volume del campione dalla cuvetta ad un pozzo appropriato di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzi contenente 1 mL del mezzo di espansione della cellula B. La concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere di 106 cellule/mL.
- Se si esegue un esperimento KI genico, trasferire il vettore rAAV6 a 500.000 molteplicità di infezione nelle cellule elettroporate appropriate contenenti bene (circa 45 minuti dopo l'elettroporazione). Vedere esempio di costrutto vettoriale rAAV6 nella figura 4A.
NOTA: Ad esempio: un campione di controllo verrà elettroporato senza CRISPR/Cas9 o il vettore rAAV6. Un campione solo vettoriale sarà elettroporato senza CRISPR/Cas9 e quindi trasdotto con il vettore rAAV6. Un campione KI verrà elettroporato con CRISPR/Cas9 e quindi trasdotto con il vettore rAAV6. rAAV6 deve contenere bracci di omologia verso l'alto e a valle del sito DSB mirato per HDR. - Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C e al 5% di CO2 con umidità.
- Conta le celle e registra la vitalità al primo giorno dopo l'ingegneria.
- Aggiornare il mezzo di espansione della cella B ogni 2 giorni contando le celle e quindi trasferendo l'intero volume delle celle in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 ml. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Rimostrare le cellule con 100 μL di mezzo di espansione fresco delle cellule B e trasferirli in un pozzo di una piastra di coltura tissutale di 24 po '. Portare il volume medio per ottenere una concentrazione cellulare finale a 5 × 105 cellule/mL.
NOTA: Una piastra da 48 porsi può contenere fino a 1 mL medio/bene; una piastra da 24 po' può contenere fino a 2 mL medio/bene; una piastra da 12 po' può contenere fino a 4 mL medio/bene e una piastra da 6 po po' può contenere fino a 8 mL medio/bene. - Consentire alle celle ingegnerizzate di espandersi per almeno 5 giorni prima di eseguire analisi a valle, ad esempio per l'analisi della citometria del flusso, l'analisi TIDE e la PCR di giunzione.
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Representative Results
Il protocollo aggiornato di espansione e attivazione ha permesso la rapida espansione delle cellule B fino a 44 volte in 7 giorni(figura 1;n =3 donatori). Nell'esperimento KO, il conteggio delle cellule B utilizzando la colorazione blu di Trypan ha mostrato più dell'80% di cellule vitali con una leggera riduzione del recupero cellulare sia nel controllo che nei campioni CD19 KO a 24 ore dopo l'elettroporazione(figura 2A; p ≥ 0,05, n = 3 donatori). Questo risultato indica che l'elettroporazione ha leggermente influenzato la salute complessiva delle cellule B. Le cellule B sono state raccolte il giorno 5 dopo la trasfezione per la citometria del flusso e le analisi TIDE. I grafici a dispersione rappresentativi del campione di controllo e KO hanno mostrato rispettivamente il 14% e il 95% di cellule CD19 negative (figura 2B). La quantificazione dei grafici di flusso ha mostrato una significativa riduzione dell'espressione cd19 nei campioni ko rispetto al controllo(figura 2B;p ≤ 0,0001, n = 3 donatori). I cromatogrammi del sequenziamento genomico (cfr. sequenze primer nella tabella 3) hanno mostrato doppi picchi nelle cellule CD19 KO B, indicando inserimenti/eliminazioni di nucleotidi DSB post-CRISPR/Cas9-mediati, mentre singoli picchi sono stati osservati nel controllo, indicando che non si è verificato alcun DSB in questo campione (Figura 3A). L'analisi indelebile dei cromatografi (utilizzando uno strumento di analisi TIDE online gratuito) dei campioni ko ha mostrato un'alta percentuale di formazione di indelenze (>90%) al locus CD19, che è coerente con la perdita di proteine % CD19 rilevata dalla citometria del flusso (Figura 3B; p ≥ 0,05, n = 3 donatori). Questi risultati indicano che CRISPR/Cas9 ha generato in modo efficiente un CD19 KO nelle celle B. Le cellule B dell'esperimento KI sono state raccolte il giorno 12 dopo l'ingegneria per la citometria a flusso e le analisi PCR digiunzione (tabella 4). I grafici a dispersione hanno mostrato il 64% delle cellule positive all'EGFP nel campione che ha ricevuto il vettore rAAV6 (Figura 4) insieme all'RNP, mentre nel controllo non è stata osservata alcuna cellula positiva all'EGFP; nel campione che ha ricevuto solo vettore AAV (figura 5A) è stata osservata una positività minimadell'EGFP. Un'amplificazione PCR di giunzione (cfr. sequenze di primer nella tabella 3) ha mostrato ampliconi da 1,5 Kbps nel campione KI (Figura 5B), mentre nel campione di controllo o solo vettoriale non è stato osservato alcun prodotto PCR. Il conteggio delle celle ha mostrato che il processo di progettazione influisce sul recupero delle celle nel campione KI più del controllo o dei campioni solo vettoriali (Figura 5B). Tuttavia, tutti i campioni sono rimbalzati rapidamente entro 3 giorni dall'ingegneria (Figura 5B). Insieme, questi risultati indicano che una riuscita integrazione di EGFP nel luogo AAVS1 porta a un'espressione stabile dell'EGFP almeno 12 giorni dopo l'ingegneria.
Figura 1: Espansione delle cellule B in vitro. Le cellule B sono state sementi a 1 ×10 6 cellule il giorno 0 (zero) ad una densità di 5 × 105 per mL e espanse di 44 volte in 7 giorni (n=3 donatori indipendenti). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2A: Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2B: Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2C: Knockout CD19 mediato DA CRISPR/Cas9 (KO) nelle celle B. ( A ) Il graficoabarre mostra >70% il recupero cellulare (pannello sinistro) e >80% la vitalità (pannello destro) delle cellule dopo la trasfezione sono stati osservati sia nel controllo che nei campioni KO CD19 a 24 ore dopo l'elettroporazione. (B) I grafici rappresentativi del flusso di CD19 di cellule vive mostrano rispettivamente l'84,3% e il 3,43% di cellule positive cd19 nel campione di controllo e nel campione CD19 KO. (C) Il grafico a barre mostra una significativa riduzione del CD19 nel gruppo CD19 KO mediato da CRISPR/Cas9 (p ≤ 0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3A: Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3B: Perdita di proteine CD19 vs formazione di indele. (A) I cromatogrammi raffigurano picchi di sequenziamento del campione di controllo e CD19 knockout (KO). La casella grigia sui picchi di controllo evidenzia la sequenza di destinazione del gRNA CD19 con il sito di taglio previsto indicato da una freccia. CD19 KO ha mostrato il sequenziamento dei "doppi picchi" intorno al sito di taglio previsto, indicando l'inserimento / eliminazione dei nucleotidi dopo la rottura a doppio filamento. (B) Grafico a barre che mostra risultati coerenti tra % perdita di proteine CD19 e % formazione di indelebili nel locus CD19 (p ≥ 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: costrutto vettoriale MND-GFP rAAV6 AAVS1. Expression cassette contiene una forte sequenza di promotore sintetico (MND), immediatamente seguita da una sequenza di codifica EGFP (Green Fluorescence Protein) potenziata e sequenza di poli adenilazione (Poly A). I bracci di omologia AAVS1 fiancheggiano a monte del promotore MND e a valle delle sequenze poli A. L'EGFP sarà espressa ai sensi del regolamento del promotore MND. Le lunghezze di sequenza sono indicate sopra ogni componente del costrutto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5A: Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5B: Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5C: Integrazione site-specific mediata da CRISPR/Cas9 e rAAV6 della cassetta reporter EGFP nelle celle B al giorno 12 dopo l'ingegneria. (A) Il diagramma di flusso rappresentativo non mostra cellule B positive all'EGFP né nel controllo né nel campione solo vettoriale contro il 64,4% delle cellule B positive all'EGFP del campione di knockin (KI). (B) La reazione a catena della polimerasi di giunzione del campione KI mostra la banda prevista di 1,5 Kbps; non è stata trovata alcuna banda nel campione di controllo o solo vettoriale. L'acqua è stata utilizzata per garantire che non vi siano contaminazioni durante il processo PCR. (C) Il grafico a barre descrive la crescita cellulare del controllo, solo vettoriale, e i campioni EGFP-KI per un periodo di 3 giorni dopo l'ingegneria. La linea interrotta indica l'input di 1 × 106 celle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| nome | sequenza gRNA |
| Cd19 Cd | 5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3' |
| AAVS1 | 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3' |
Tabella 1: sequenze di gRNA.
| Reagenti | Volume per reazione 1 |
| Soluzione di cellule primarie P3 | 16,4 mL |
| Supplemento 1 | 3,6 mL |
| totale | 20 mL |
Tabella 2: Preparazione della miscela di reagenti nucleofection.
| descrizione | sequenza | scopo |
| Primer di inoltro CD19 | 5'-AAATTCAGGAAAGGGTTGGAAG-3' | Amplifica il locus CD19 per l'analisi di Indel |
| CD19 Primer inverso | 5'-GCGGACCTCTTCTGTCCATG-3' | Amplifica il locus CD19 per l'analisi di Indel |
| Primer forward PCR di giunzione | 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' | Giunzione PCR |
| Primer inverso PCR di giunzione | 5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3 | Giunzione PCR |
Tabella 3: Primer utilizzati.
| descrizione | Fluorofo | clone |
| CD19 anti-umano | PerCP | HIB19 |
| Colorante di vitalità | eFlour 780 | - |
Tabella 4: Anticorpo della citometria a flusso e colorante di vitalità.
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Discussion
L'ingegneria del genoma precisa nelle cellule B umane primarie è stata impegnativa fino apoco tempo fa 9,10. In precedenza avevamo pubblicato protocolli che utilizzavano CRISPR/Cas9 per progettare cellule B umane primarie9. Qui, delineamo protocolli migliorati per l'isolamento, l'espansione e l'ingegneria delle celle B per consentire un KO efficiente del CD19 o per l'eGFPknocking-in .
Qui dimostriamo che il nostro protocollo di espansione consente la rapida espansione delle cellule B in coltura per un'espansione fino a 44 volte in 7 giorni(Figura 1). Questo protocollo ha mostrato un tasso diespansione più rapido di quelli riportati da Johnson et al×.
La Corte ha inoltre riscontrato che il nostro protocollo migliorato per il trasfetto del sistema CRISPR/Cas9 per CD19 KO ha comportato un'elevata efficienza del CD19 KO(figura 2 e figura 3). Analogamente a uno studio precedente9, abbiamo osservato una leggera riduzione del recupero cellulare e della vitalità dopo l'elettroporazione a 24 ore. Ciò indica che l'elettroporazione influisce sulla salute generale delle cellule B primarie; tuttavia, le celle alla fine rimbalzano entro 48 ore (dati non mostrati).
Il vantaggio dell'uso di questo protocollo elettroporatore è che possiamo elettroporate i campioni ad una velocità molto più veloce (16 reazioni in meno di 1 min), mentre i protocolliprecedenti 9,10 prendono circa 10-12 min per 16 reazioni. Inoltre, questo sistema di trasfezione elimina il potenziale arco elettrico dell'elettroporatore osservato negli studiprecedenti 9,10. Inoltre, questo metodo ingegneristico può essere scalato per un numero maggiore di celle B utilizzando cumvette più grandi e disponibili in commercio (dati non mostrati).
Alcuni passaggi critici per garantire una salute complessiva ottimale delle cellule e l'efficienza ko: in primo luogo, assicurarsi che il mezzo di espansione delle cellule B sia preparato e pre-equilibrato per almeno 15 minuti prima dell'uso. In secondo luogo, il volume totale del substrato di trasfezione non deve superare il 20% (v/v) del reagente di nucleofezione. In terzo luogo, le celle devono essere espanse/attivate per 48 ± 2 ore per risultati ottimali. In quarto luogo, toccare delicatamente la cuvetta di elettroporazione prima di posizionare nell'elettroporatore per assicurarsi che la soluzione di reazione di trasfezione copra il fondo della cuvetta. Quinto, assicurarsi di riposare le celle elettroporate nella cuvetta per soli 15 minuti a RT; lasciare le cellule nel reagente della nucleofezione dopo l'elettroporazione per troppo tempo può danneggiare la sopravvivenza complessiva delle cellule. Sesto, assicurati di incubare le cellule con mezzi nella cuvetta per non più di 30 minuti. Settimo, posizionare 106 cellule elettroporate in 1 mL per le prime 48 ore tende ad aiutare le cellule a riprendersi più rapidamente rispetto alla loro recupero a densità inferiore (dati non mostrati). Infine, l'utilizzo della proteina Cas9 mRNA o Cas9 comporterà efficienze di modifica simili (dati non mostrati); tuttavia, abbiamo usato Cas9 mRNA per comodità e costi.
Due problemi principali quando si utilizza CRISPR/Cas9 sono gli effetti fuori bersaglio e le traslocazioni cromosomiche. Gli effetti off-target causati da coppie di basi non corrispondenti di sgRNA alla sequenza bersaglio, portano a numerosi possibili siti di legame sul genoma e creano più KO genici indesiderati. Pertanto, il punteggio off-target previsto dovrebbe essere preso in considerazione insieme al punteggio di destinazione per ridurre al minimo questo problema. La traslocazione cromosomica può verificarsi a causa di effetti fuori bersaglio o quando si eliminano più geni. Ciò può causare eventi catastrofici in modo sperimentale e clinico. Gli editori di base12 alterano un singolo nucleotide (due classi: editor di base citosina ed editor di base di adenina) per interrompere l'elemento di giunzione, per creare un codone di arresto prematuro o per creare una mutazione puntile, portando al gene bersaglio KO senza DSB (ampiamente esaminato altrove12). Pertanto, l'approccio di editing di base può essere utilizzato per ko a geni singoli o multipli per aggirare le traslocazioni cromosomiche.
Dimostriamo inoltre che CRISPR/Cas9, insieme a rAAV6, può essere utilizzato per mediare in modo efficiente ki site-specific ed espressione di EGFP presso il locus AAVS1. Abbiamo osservato l'espressione EGFP per almeno 12 giorni dopo l'ingegneria. Abbiamo anche osservato due popolazioni positive all'EGFP: un'espressione ad alta e media EGFP nel campione KI il giorno 12 (Figura 5A), mentre il campione solo vettoriale ha mostrato una percentuale minima di cellule con espressione EGFP intermedia. Ipotizzamo che questo fenomeno delle "popolazioni alte e intermedie" sia dovuto all'integrazione biallelica del vettore. Ulteriori indagini che utilizzano la PCR13 delle celle intermedie e ad alto EGFP possono essere fatte per confermare questa ipotesi. Due avvertimenti sull'uso dell'AAV come vettore: in primo luogo, i vettori AAV hanno una piccola capacità di carico, fino a 4,7 kilobase, causando problemi quando bussano a un gene di grandi dimensioni. La riduzione delle dimensioni dei bracci di omologia consentirà l'accomodamento di un gene più grande, che a sua volta ridurrà l'efficienza del KI (dati non mostrati). In alternativa, è possibile utilizzare l'integrazione simultanea o sequenziale di più vettori di caricamento genico14,15. Gli studi hanno riportato una risposta immunitaria e una clearance delle cellule trasdotta dall'AAV nei modelli animali immunocompetenti16,17. In alternativa, è possibile esplorare un modello HDR donatore non virale per aggirare questo problema.
In sintesi, abbiamo dimostrato processi completi e passo-passo di isolamento, espansione e ingegneria delle cellule B che hanno portato ad elevate efficienze di modifica genica. Questo metodo ingegneristico può essere utilizzato per il gene KO e per studiare le funzioni dei geni nelle cellule B. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per progettare cellule B per esprimere un anticorpo ricombinante per combattere l'infezione. Infine, questo metodo può essere applicato all'ingegnere cellule B per esprimere e secernore enzimi terapeutici che possono essere utilizzati come terapia autologa a base cellulare per trattare le ezimopatie.
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Disclosures
È stato depositato un brevetto sui metodi di produzione e utilizzo di cellule B modificate dal genoma con M.J.J, K.L., e B.S.M. come inventori. Immusoft Inc.M ha sponsorizzato la ricerca nel laboratorio di B.S.M.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Children's Cancer Research Fund (CCRF) e dal NIH R01 AI146009 al B.S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
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