Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

هندسة الجينوم للخلايا B البشرية الأولية باستخدام CRISPR/Cas9

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61855
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Pediatrics, University of Minnesota, 2Center for Genomic Engineering, University of Minnesota, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

Summary

هنا نقدم مفصلة، بروتوكول خطوة بخطوة لهندسة الجينوم CRISPR/Cas9 القائم على الخلايا B البشرية الأولية لضربة قاضية الجينات (KO) وضرب في (KI) لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات في الخلايا B وتطوير العلاجات B-الخلية.

Abstract

الخلايا البائية هي خلايا لمفاوية مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم وهي مكون رئيسي في الذراع الفكاهي للجهاز المناعي التكيفي. أنها تجعل المرشحين جذابة للعلاجات القائمة على الخلايا بسبب سهولة عزلها عن الدم المحيطي، وقدرتها على التوسع في المختبر، وطول عمرها في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام وظيفتها البيولوجية الطبيعية - لإنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة - للتعبير عن كميات كبيرة جدا من البروتين العلاجي ، مثل جسم مضاد مؤتلف لمكافحة العدوى ، أو إنزيم لعلاج أمراض الأنزيموباث. هنا، نقدم أساليب مفصلة لعزل الخلايا B البشرية الأولية من خلايا الدم الأحادية الطرفية (PBMCs) وتفعيل / توسيع الخلايا B المعزولة في المختبر. ثم نقوم بإظهار الخطوات التي ينطوي عليها استخدام نظام CRISPR/Cas9 ل KO الخاص بالموقع للجينات الذاتية في الخلايا B. هذه الطريقة تسمح لكو كفاءة الجينات المختلفة، والتي يمكن استخدامها لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات ذات الأهمية. ثم نقوم بإظهار خطوات استخدام نظام CRISPR/Cas9 جنبا إلى جنب مع ناقل فيروسي (rAAV) مرتبط بال أدينو للتكامل الفعال لكل موقع من كاسيت التعبير المتحول في الخلايا B. يوفر هذا البروتوكول معا منصة هندسية خطوة بخطوة يمكن استخدامها في الخلايا B البشرية الأولية لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات وكذلك لتطوير علاجات الخلايا B.

Introduction

الخلايا B هي مجموعة فرعية من سلالة الخلايا الليمفاوية المستمدة من الخلايا الجذعية الدموية. أنها تؤدي دورا حاسما في الجهاز المناعي الفكاهي التكيفية من خلال إنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة استجابة للتحديات المناعية1. الخلايا B هي أيضا سلائف خلايا الذاكرة B وخلايا البلازما المتمايزة بشكل نهائي وطويلة العمر ، وبالتالي توفير مناعة فكاهة دائمة2. خلايا البلازما، على وجه الخصوص، هي فريدة من نوعها بين الخلايا المناعية في قدرتها على إنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة محددة أثناء البقاء على قيد الحياة لسنوات أو عقود3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن سهولة العزلة عن الدم المحيطي تجعل نسب الخلية B مرشحا ممتازا للعلاجات الجديدة القائمة على الخلايا4.

في السابق ، تم استخدام طرق التكامل العشوائي ، مثل تلك التي تستخدم ناقلات العدسية أو جهاز الإرسال والاستقبال الجمال النائم ، لهندسة الخلايا B لتسليم المتحولين والتعبير5و6و7و8. ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير المحددة لهذه النهج تجعل من الصعب دراسة الوظائف البيولوجية لجين معين في الخلايا B وتحمل خطرا متأصلا من تكوين الغرز والتعبير المتحول المتغير و / أو إسكات في الإعداد العلاجي.

نظام CRISPR/Cas9 هو أداة قوية لهندسة الجينوم تسمح للباحثين بتحرير جينوم الخلايا المختلفة بدقة في العديد من الأنواع. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت مجموعتين، بما في ذلك منطقتنا، بنجاح أساليب لتوسيع الجسم الحي السابق وهندسة الجينوم المستهدفة من الخلايا B البشريةالأولية 9،10. سوف نصف عملية تنقية الخلايا B البشرية الأولية من عينة leukaphoresis. بعد ذلك، سنصف بروتوكولنا المحدث لتوسيع الخلية B وتنشيط الخلايا B المعزولة. سنقوم بعد ذلك بوصف عملية لضرب مجموعة من التمايز 19 (CD19) ، وهي مستقبلات خلية B محددة وسمة مميزة للخلايا B ، عن طريق الكهرومporation لإدخال CRISPR / Cas9 mRNA جنبا إلى جنب مع CD19 sgRNA في الخلايا B المنشطة.

يحصل على ترجمة Cas9 ميرنا ويربط إلى SgRNA CD19 لتشكيل مجمع CRISPR/Cas9-sgRNA ريبونوكليوبروتين (RNP). في وقت لاحق، SgRNA في المجمع يؤدي Cas9 لخلق كسر حبلا مزدوجة (DSB) في التسلسل المستهدف على exon 2 من الجين. ستقوم الخلايا بإصلاح DSB عن طريق "الانضمام إلى نهاية غير متجانسة" عن طريق إدخال أو حذف النيوكليوتيدات ، مما يؤدي إلى طفرة frameshift والتسبب في خروج الجين. سنقوم بعد ذلك بقياس فقدان CD19 عن طريق قياس التدفق الخلوي وتحليل تشكيل indel عن طريق تتبع indels عن طريق تحليل التحلل (TIDE).

سنقوم بعد ذلك بوصف عملية استخدام CRISPR/Cas9 جنبا إلى جنب مع ناقل AAV6 المؤتلف (rAAV6 ، وهو قالب مانح للإصلاح الموجه بالهومولوجيا (HDR)) للتوسط في إدخال موقع محدد للبروتين الفلوري الأخضر المعزز(EGFP) في جين موقع تكامل الفيروسات المرتبط بال أدينو 1 (AAVS1). الجين AAVS1 هو مكان نشط دون وظائف بيولوجية معروفة وموقع التكامل الفيروسي AAV على الجينوم البشري. ولذلك، فإنه يعتبر "ملاذا آمنا" لهندسة الجينوم. هنا، ونحن التقرير أن التوسع وتنشيط الخلايا B يسمح للتوسع تصل إلى 44 أضعاف في 7 أيام من الثقافة (الشكل 1). وأظهر الكهرومporation من الخلايا B انخفاضا طفيفا في صحة الخلايا العامة (الشكل 2A) في 24 ساعة بعد العدوى. أظهر تحليل مخطط مبعثر لعلامة CD19 (الشكل 2B) انخفاضا يصل إلى 83٪ في الخلايا المحررة (الشكل 2C).

كشف تحليل TIDE للكروماتوغرافيات(الشكل 3A)أن النسبة المئوية لل indels كانت مشابهة لنسبة فقدان البروتين عن طريق قياس التدفق الخلوي(الشكل 3B). أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي لتجربة KI أن الخلايا التي تلقت متجه AAV(الشكل 4)، جنبا إلى جنب مع RNP ، عبرت عن ما يصل إلى 64٪ من الخلايا الإيجابية EGFP(الشكل 5A)وعرضت في وقت لاحق التكامل الناجح عن طريق تفاعل سلسلة البوليميراز التقاطعي (PCR) (الشكل 5B). وأظهرت تعدادات الخلايا أن جميع العينات سرعان ما تم استردادها في غضون 3 أيام بعد الهندسة(الشكل 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على عينات من المتبرعين الأصحاء من بنك دم محلي. تم تحديد جميع التجارب الموصوفة هنا لتكون معفاة للبحوث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) ووافقت عليها لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) في جامعة مينيسوتا.

ملاحظة: أجريت جميع التجارب امتثالا للاحتياطات العالمية لمسببات الأمراض المنقولة بالدم، باستخدام تقنيات معقمة/مطهرة ومعدات مناسبة للسلامة البيولوجية من المستوى 2.

1. إعداد ملاحق لB-الخلية توسيع المتوسطة

  1. إعادة تشكيل CpG oligonucleotide إلى تركيز 1 ملغ / مل.
  2. إعادة تشكيل CD40 ligand (CD40L) إلى تركيز 100 ميكروغرام / مل.
  3. إعادة تشكيل الإنسان المؤتلف IL-10 (rhIL-10) إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل.
  4. إعادة تشكيل الإنسان المؤتلف IL-15 (rhIL-15) إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: حافظ على كل ملحق في aliquots صغيرة في -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. إعداد المتوسط القاعدي

  1. الجمع بين المتوسط القاعدي B-الخلية مع 5٪ (v/v) ملحق وسائل الإعلام لتوسيع الخلايا المناعية في المختبر (على سبيل المثال، CTS الخلية المناعية SR) و 1٪ (v/v) البنسلين والستريبتوميسين.
  2. تصفية تعقيم الوسط القاعدي باستخدام محول مرشح 0.22 ميكرومتر في زجاجة معقمة.
  3. احتفظ بالوسط القاعدي عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

3. إعداد B-الخلية توسيع المتوسطة

  1. نقل الكمية المطلوبة من الوسط القاعدي إلى حاوية معقمة لثقافة الخلايا B في 5 × 105 خلايا / مل.
  2. تكملة المتوسط القاعدي مع 1 ميكروغرام / مل CpG، 100 نانوغرام / مل CD40L، 50 نانوغرام / مل rhIL-10، و 10 نانوغرام / مل rhIL-15.
  3. تصفية متوسط توسيع الخلية B باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
  4. موازنة متوسط توسع الخلية B في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 مع الرطوبة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    ملاحظة: إعداد جديدة B-الخلية توسيع المتوسطة للاستخدام ليوم واحد. لا تقم بإعداد متوسط توسيع الخلية B للاستخدام لعدة أيام. تشجع هذه الوصفة الإعلامية على انتشار خلايا الذاكرة B والخلايا B البشرية الأساسية المنشطة.

4. تنقية الخلايا B البشرية والتوسع

ملاحظة: إضافة الكحول isopropyl 99-100٪ إلى حاوية التجميد التي تسيطر عليها درجة الحرارة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وتبريد حاوية التجميد في 4 درجة مئوية قبل البدء الخطوة 4.1.

  1. عزل PBMCs من عينة leukaphoresis
    1. نقل عينة leukaphoresis (حوالي 8-10 مل) إلى أنبوب مخروطي معقم 50 مل.
    2. رفع مستوى الصوت إلى 35 مل مع المحلول الملحي المعقم العازل بالفوسفات (PBS).
    3. طبقة بعناية عينة leukaphoresis 35 مل على 15 مل من متوسط الكثافة التدرج.
    4. الطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 25 دقيقة دون فرامل، وإزالة طبقة البلازما دون إزعاج معطف بافي (طبقة PBMC)، وجمع PBMCs من واجهة، ونقل إلى أنبوب مخروطي عقيم جديد 50 مل.
    5. طرح PBMCs إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني 1x.
    6. جهاز الطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 5 دقائق دون الفرامل. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه PBMC، والتي قد تبدو حمراء.
    7. إضافة 7 مل من العازلة تحلل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم، ماصة 3 مرات لخلط جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق.
    8. رفع مستوى الصوت إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني 1x.
    9. جهاز الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق مع الفرامل منخفضة المقاومة. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه. يجب أن تبدو بيليه وردي أو أبيض.
      ملاحظة: لمواصلة الثقافة الخلايا B المعزولة حديثا، قم بإعداد متوسط توسيع الخلية B قبل بدء عزل الخلية B (الخطوة 4.2).
  2. عزل الخلية B من PBMCs باستخدام مجموعة العزل السلبية للخلية B الأساسية البشرية
    1. إعادة إنفاق PBMCs في العازلة العزل إلى تركيز 5 × 107 خلايا / مل.
      ملاحظة: إذا كان العدد الإجمالي ل PBMCs أقل من 5 × 107 خلايا، خفض حجم المخزن المؤقت العزل للحفاظ على 5 × 107 خلايا/مل. الحد الأدنى والحد الأقصى لأحجام تعليق الخلية هي 0.25 مل و 8 مل، على التوالي.
    2. نقل ما يصل إلى 8 مل (5 × 107 خلايا / مل) إلى العقيمة، البولي بروبلين، أنبوب الجولة القاع مع غطاء.
    3. إضافة 50 ميكرولتر / مل من محسن كوكتيل إلى PBMCs.
    4. إضافة 50 ميكرولتر / مل من كوكتيل العزلة إلى PBMCs، سقف الأنبوب، وعكس 2-3 مرات لخلط.
    5. احتضان في RT لمدة 5 دقائق؛ فيالدقيقة 4 من الحضانة ، دوامة الميكروبات المغناطيسية لمدة 30 ق على الأقل.
    6. نقل 50 ميكرولتر من الميكروبات المغناطيسية لكل 1 مل من PBMCs، سقف الأنبوب، وعكس 2-3 مرات لخلط.
    7. أعلى ما يصل إلى 10 مل مع العزل العازلة وماصة بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
    8. ضع الأنبوب في محطة مغناطيسية واحتضنه في RT لمدة 3 دقائق.
    9. عقد المغناطيس وأنبوب معا، وفي حركة واحدة، عكس المغناطيس وأنبوب معا لصب تعليق الخلية في أنبوب جديد. تجاهل الأنبوب القديم.
    10. كرر الخطوة 4.2.8 (تقليل وقت الحضانة إلى 2 دقيقة) وصب تعليق الخلية B في أنبوب مخروطي نظيف.
    11. خلايا B المخصب جاهزة للاستخدام. إذا تم استخدام الخلايا على الفور، فاستمر في القسم 4.3 (توسيع الخلية B البشرية). تحقق من نقاء الخلايا B المعزولة عن طريق قياس التدفق الخلوي (اختياري). إذا كان سيتم تجميد الخلايا قبل الاستخدام، تابع الخطوة 4.2.12.
    12. لتجميد الخلايا B، والطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق، والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه.
    13. Resuspend الخلايا في تجميد المتوسطة في 107 خلايا / مل ، وaliquot 1 مل / cryovial.
    14. وضع cryovial في حاوية التجميد المبردة، وتخزينها في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها؛ ثم، نقل cryovial المجمدة إلى خزان النيتروجين السائل. الحفاظ على الخلايا المجمدة تصل إلى 1 سنة.
      ملاحظة: العائد المتوقع للخلايا B المعزولة هو 2٪-8٪ من إجمالي PBMCs، مع 95٪ -99٪ من الجدوى.
  3. توسيع الخلية B البشرية
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم خلايا B المعزولة حديثا، تخطي الخطوات 4.3.1-4.3.5. عد الخلايا ونقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم والاستمرار في الخطوة 4.3.6.
    1. مصل الأبقار الجنيني قبل الدفء (FBS) في حمام مائي قبل إذابة الخلايا B. إعداد 20 مل من متوسط توسيع الخلية B، ونقل إلى قارورة T25، وقبل equilibrate المتوسطة في حاضنة الأنسجة والثقافة (في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،مع الرطوبة) على الأقل 15 دقيقة قبل الاستخدام.
    2. تذوب الخلايا B في حمام مائي 37 درجة مئوية. أثناء الانتظار، نقل 2 مل من FBS قبل الحارة في أنبوب مخروطي معقم 15 مل.
    3. بعد إذابة الخلايا B تماما ، أضف على الفور 1 مل من FBS الدافئ مسبقا ، من الحكمة المنسدلة ، إلى العينة. احتضان في RT لمدة 1 دقيقة.
    4. ماصة بلطف لإعادة إنفاق العينة ونقل وحدة التخزين بأكملها، دروبوايز، في أنبوب مخروطي يحتوي على 2 مل من FBS الدافئة مسبقا.
    5. رفع مستوى الصوت إلى 15 مل مع عقيمة 1x برنامج تلفزيوني, غطاء, وعكس أنبوب بلطف 2-3 مرات.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
    7. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه الخلية، resuspend بيليه الخلية مع 1 مل من المتوسط توسيع الخلية B-متوازنة مسبقا، والعد الخلايا. يجب أن يكون إجمالي عدد الخلايا حوالي 107 خلايا.
    8. نقل الخلايا إلى قارورة تحتوي على 20 مل من المتوسط توسيع الخلية B-متساوية مسبقا. يجب أن يكون التركيز النهائي للخلايا حوالي 5 × 105 خلايا / مل.
    9. احتضان القارورة عموديا في حاضنة زراعة الأنسجة.
    10. قم بتحديث وسيط التوسعة بالكامل كل يومين عن طريق نقل الحجم الكامل للخلايا B إلى أنبوب مخروطي معقم وكرر الخطوات 4.3.6-4.3.9.
      ملاحظة: قارورة T25 يمكن أن تعقد 10-20 مل من المتوسط; قارورة T75 يمكن أن تعقد ما يصل إلى 20-60 مل من المتوسطة.

5. هندسة الخلية B البشرية الأولية

  1. مهندس الخلايا B في 48 ± 2 ساعة بعد التوسع / التنشيط للحصول على أفضل النتائج. إعداد المتوسطة توسيع الخلية B، aliquot 1 مل من المتوسطة في لوحة 48 جيدا الأنسجة والثقافة، وقبل equilibrate في حاضنة الأنسجة والثقافة على الأقل 15 دقيقة قبل الاستخدام.
    ملاحظة: عند تصميم SgRNA CRISPR/Cas9 لجين الفائدة اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    - تصميم sgRNAs باستخدام أداة على الانترنت11.
    - تصميم sgRNAs على exon التي هي مشتركة بين جميع isoforms من البروتين.
    - طلب sgRNA المعدلة كيميائيا من الشركات ذات السمعة الطيبة.
    - sgRNA عادة ما يأتي في شكل lyophilized. إعادة تشكيل SgRNA في العقيمة DNase / RNase خالية من تريس EDTA (TE) العازلة إلى تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
  2. إعداد CRISPR/Cas9 transfecting الركيزة عن طريق خلط 1 ميكرولتر (1 ميكروغرام / ميكرولتر) من sgRNA المعدلة كيميائيا مع 1.5 ميكرولتر (1 ميكروغرام / ميكرولتر) من المكورات العقدية المعدلة كيميائيا pyogenes كاس 9 (S.p. Cas9) النيوكليز لكل تفاعل العدوى. للتحكم، استخدم 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE بدلا من sgRNA.
    ملاحظة: عندما يتم استخدام CD19 sgRNA لتجربة KO الجينات، راجع الشكل 2 للحصول على النتائج. عندما يتم استخدام AAVS1 sgRNA لتجربة KI الجينات، راجع الشكل 5 للحصول على النتائج.
    • الحفاظ على جميع المكونات على الجليد.
  3. مزيج بلطف ونقل 2.5 ميكرولتر من CRISPR/Cas9 الركيزة التغوط لكل رد فعل في أنبوب من 0.2 مل 8 أنبوب الشريط; جانبا في RT.
  4. تشغيل النوى (كهربائي)، وإعداد الكواشف transfection كما هو مبين في الجدول 1.
    ملاحظة: هذه خطوة جيدة للتوقف، إذا لزم الأمر، عن طريق وضع جميع الكواشف على الجليد. إزالة جميع الكواشف من الجليد عندما تكون جاهزة لاستئناف التجربة. عند استخدام بروتين S.p. Cas9 ، يجب على المحقق ما قبل معقدة CRISPR / Cas9 - sgRNA ribonucleoprotein عن طريق خلط 1 ميكروغرام sgRNA مع 5 ميكروغرام من بروتين S.p. Cas9 ، وتجنب أي فقاعات ، واحتضان الخليط في RT لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام للحصول على أفضل النتائج.
  5. عد ونقل 106 خلايا B لكل تفاعل العدوى في أنبوب مخروطي معقم.
  6. رفع مستوى الصوت إلى 15 مل مع برنامج تلفزيوني 1x معقمة، والطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق. أثناء الانتظار، قم بإعداد كاشف نقل الخلايا الأساسي(الجدول 2)ووضعها جانبا في RT.
  7. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه الخلية.
  8. Resuspend بيليه الخلية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1x عقيمة والطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
  9. تجاهل supernatant تماما دون إزعاج بيليه الخلية.
  10. نقل 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي GFP المعدل كيميائيا (كمراسل transfection) لكل 106 خلايا B إلى بيليه الخلية (اختياري).
  11. إعادة إنفاق بيليه الخلية مع 20 ميكرولتر من كاشف نقل الخلايا الأولية لكل 106 خلايا B; مزيج بلطف عن طريق الأنابيب 5-6 مرات. نقل 20.5 ميكرولتر لكل تفاعل مع العدوى في أنبوب 0.2 مل من الشريط 8 أنبوب يحتوي على 2.5 ميكرولتر من ركيزة انتقال CRISPR/Cas9.
  12. ماصة صعودا وهبوطا مرة واحدة لخلط ونقل وحدة التخزين بأكملها (23 ميكرولتر) في cuvette transfection. كاب واضغط على cuvette على مقاعد البدلاء بلطف لضمان أن السائل يغطي الجزء السفلي من cuvette.
  13. استخدام بروتوكول الخلية B الأساسية البشرية على النوى لtransfection.
    ملاحظة: يمكن وضع النوى (الكهربائي) واستخدامها خارج غطاء محرك السيارة الأنسجة والثقافة. قم بوضع غطاء للكوفيت لضمان العقم.
  14. بقية الخلايا الكهربائية في cuvette في RT لمدة 15 دقيقة.
  15. نقل 80 ميكرولتر من وسيط توسعة الخلية B قبل الموازى من لوحة زراعة الأنسجة إلى تفاعل العدوى في الكوفيت. ضع الكوفيت في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة.
  16. ماصة بلطف بضع مرات لخلط ونقل الحجم الكامل للعينة من cuvette إلى بئر مناسبة من لوحة 48 جيدا الأنسجة والثقافة التي تحتوي على 1 مل من المتوسط توسيع الخلية B. يجب أن يكون التركيز النهائي للخلايا 106 خلايا / مل.
  17. في حالة إجراء تجربة KI الجينات، نقل ناقلات rAAV6 في 500،000 تعدد العدوى في البئر المناسبة التي تحتوي على الخلايا الكهربائية (حوالي 45 دقيقة بعد الكهرومغناطيسية). انظر المثال rAAV6 ناقلات بناء في الشكل 4A.
    ملاحظة: على سبيل المثال: سيتم إجراء اختبار كهربي لعينة تحكم بدون CRISPR/Cas9 أو متجه rAAV6. سيتم كهربية عينة متجه فقط بدون CRISPR/Cas9 ومن ثم يتم تحويلها مع متجه rAAV6. سيتم تزويد عينة KI بالكهرباء باستخدام CRISPR/Cas9 ثم يتم تحويلها باستخدام ناقل rAAV6. يجب أن يحتوي rAAV6 على أذرع homology صعودا وهبوطا لموقع DSB المستهدف لتقرير التنمية البشرية.
  18. ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2 مع الرطوبة.
  19. عد الخلايا وسجل قابلية البقاء في اليوم 1 ما بعد الهندسة.
  20. قم بتحديث وسيط توسعة الخلية B كل يومين عن طريق عد الخلايا ثم نقل الحجم الكامل للخلايا إلى أنبوب طرد دقيق نظيف سعة 1.5 مل. الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق، والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه. Resuspend الخلايا مع 100 ميكروغرام من الطازجة B-الخلية توسيع المتوسطة، ونقلها إلى بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا. طرح حجم المتوسطة لتحقيق تركيز الخلية النهائية في 5 × 105 خلايا / مل.
    ملاحظة: لوحة 48 جيدا يمكن أن تعقد ما يصل إلى 1 مل المتوسطة / جيدا; لوحة 24 جيدا يمكن أن تعقد ما يصل إلى 2 مل المتوسطة / جيدا; لوحة 12 جيدا يمكن أن تعقد ما يصل إلى 4 مل المتوسطة / جيدا، ولوحة 6-جيدا يمكن أن تعقد ما يصل إلى 8 مل المتوسطة / جيدا.
  21. السماح للخلايا المهندسة بالتوسع لمدة 5 أيام على الأقل قبل إجراء تحليلات المصب مثل تحليل قياس التدفق الخلوي وتحليل المد والجزر وتقاطع PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مكن بروتوكول التوسع والتنشيط المحدث من التوسع السريع للخلايا B حتى 44 ضعفا في 7 أيام(الشكل 1؛ n = 3 الجهات المانحة). في تجربة KO، أظهر عدد الخلايا B باستخدام تلطيخ تريبان الأزرق أكثر من 80٪ خلايا قابلة للحياة مع انخفاض طفيف في استعادة الخلايا في كل من التحكم وعينات CD19 KO عند 24 ساعة بعد الكهرومporation(الشكل 2A؛ p ≥ 0.05، n = 3 المتبرعين). تشير هذه النتيجة إلى أن الكهرومporation أثر بشكل طفيف على صحة الخلية B بشكل عام. تم جمع الخلايا B في اليوم 5 بعد العدوى لقياس التدفق الخلوي وتحليلات TIDE. وأظهرت المؤامرات مبعثر ممثل للسيطرة وعينة KO 14٪ و 95٪ خلايا CD19 سلبية، على التوالي(الشكل 2B). أظهرت كمية قطع التدفق انخفاضا كبيرا في تعبير CD19 في عينات KO بالمقارنة مع عنصر التحكم(الشكل 2B؛ p ≤ 0.0001 ، n = 3 مانحين). وأظهرت مخططات كروماتوغرامية للتسلسل الجينومي (انظر تسلسلات الأعداد الأولية في الجدول 3)وجود قمم مزدوجة في خلايا CD19 KO B، مما يشير إلى إدراج/حذف النيوكليوتيدات بعد CRISPR/Cas9 بوساطة DSB، في حين لوحظت قمم واحدة في عنصر التحكم، مما يشير إلى عدم حدوث أي DSB في هذه العينة(الشكل 3A). أظهر تحليل Indel للكروماتوغرافات (باستخدام أداة تحليل TIDE مجانية عبر الإنترنت) لعينات KO نسبة عالية من تكوين indel (>90٪) في الموضع CD19، والذي يتسق مع ٪ CD19 فقدان البروتين الكشف عن طريق قياس التدفق الخلوي(الشكل 3B؛ ص ≥ 0.05، ن = 3 الجهات المانحة). تشير هذه النتائج إلى أن CRISPR/Cas9 قام بإنشاء CD19 KO بكفاءة في خلايا B. تم جمع خلايا B من تجربة KI في اليوم 12 بعد الهندسة لقياس التدفق الخلوي وتحليلات PCR التقاطع(الجدول 4). وأظهرت المؤامرات مبعثر 64٪ من الخلايا الإيجابية EGFP في العينة التي تلقت ناقلات rAAV6(الشكل 4)جنبا إلى جنب مع RNP، في حين لم يلاحظ أي خلية إيجابية EGFP في السيطرة؛ لوحظ الحد الأدنى من الإيجابية EGFP في العينة التي تلقت ناقلات AAV فقط (الشكل 5A). وأظهر تضخيم ثنائي الفينيل متعدد الكلور (انظر التسلسلات التمهيدية في الجدول 3)1.5 كيلوبت في الثانية في عينة KI(الشكل 5B)،في حين لم يلاحظ أي منتج PCR في عينة التحكم أو المتجه فقط. وأظهرت تعدادات الخلايا أن العملية الهندسية تؤثر على استعادة الخلية في عينة KI أكثر من عنصر التحكم أو عينات المتجهات فقط(الشكل 5B). ومع ذلك، انتعشت جميع العينات بسرعة في غضون 3 أيام بعد الهندسة (الشكل 5B). وتشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن الاندماج الناجح ل EGFP في موقع AAVS1 يؤدي إلى التعبير المستقر عن EGFP بعد 12 يوما على الأقل من الهندسة.

Figure 1
الشكل 1: B توسيع الخلية في المختبر. تم زرع الخلايا B في 1 × 106 خلايا في اليوم 0 (صفر) بكثافة 5 × 105 لكل مل وتوسعت 44 مرة في 7 أيام (ن = 3 متبرعين مستقلين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2A
الشكل 2A: الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2B
الشكل 2B: الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2C
الشكل 2C: CRISPR/Cas9 بوساطة CD19 بالضربة القاضية (KO) في الخلايا B. (أ)يظهر الرسم البياني شريط > 70٪ استعادة الخلية (اللوحة اليسرى) و > 80٪ البقاء (اللوحة اليمنى) من الخلايا بعد العدوى لوحظت في كل من التحكم وعينات KO CD19 في 24 ساعة بعد الكهربية. (ب)تظهر مؤامرات التدفق التمثيلي ل CD19 gating للخلايا الحية 84.3٪ و 3.43٪ خلايا إيجابية CD19 في عينة التحكم وعينة KO CD19، على التوالي. (C) يظهر الرسم البياني الشريطي انخفاضا كبيرا في CD19 في مجموعة CD19 KO بوساطة CRISPR/Cas9 (p ≤ 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3A
الشكل 3A: الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3B
الشكل 3B: CD19 فقدان البروتين مقابل تشكيل indel. (أ)تصور مخططات الكروماتوجرامات قمم تسلسل عنصر التحكم وعينة خروج المغلوب CD19 (KO). يبرز المربع الرمادي الموجود على قمم التحكم التسلسل المستهدف ل CD19 gRNA مع موقع القطع المتوقع المشار إليه بسهم. وأظهرت CD19 KO تسلسل "القمم المزدوجة" حول موقع القطع المتوقع ، مما يشير إلى إدراج / حذف النيوكليوتيدات بعد الاستراحة المزدوجة التي تقطعت بها السبل. (B) شريط الرسم البياني تظهر نتائج متسقة بين ٪ CD19 فقدان البروتين وتشكيل indel ٪ في مكان CD19 (ع ≥ 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP ناقلات البناء. يحتوي كاسيت التعبير على تسلسل قوي للمروج الاصطناعي (MND) ، يليه مباشرة تسلسل ترميز بروتين مضان أخضر معزز (EGFP) وتسلسل متعدد الأدينيل (Poly A). AAVS1 الأسلحة homology الجناح المنبع من المروج MND والمصب من تسلسل بولي A. سيتم التعبير عن EGFP بموجب تنظيم مروج MND. يتم الإشارة إلى أطوال التسلسل فوق كل مكون من مكونات البناء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5A
الشكل 5A: الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5B
الشكل 5B: الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5C
الشكل 5C: CRISPR/Cas9- وrAAV6 بوساطة التكامل الموقع محددة من كاسيت مراسل EGFP في الخلايا B في اليوم 12 ما بعد الهندسة. (أ)لا تظهر مؤامرة التدفق التمثيلي أي خلايا B إيجابية EGFP في إما التحكم أو العينة المتجهة فقط مقابل 64.4٪ من الخلايا B الإيجابية ل EGFP من عينة knockin (KI). (ب)تقاطع البوليميراز سلسلة من عينة KI يظهر الفرقة المتوقعة 1.5 كيلوبت في الثانية; لم يتم العثور على أي نطاق في عينة التحكم أو المتجه فقط. واستخدمت المياه لضمان عدم حدوث تلوث أثناء عملية ال PCR. (ج)يصور الرسم البياني الشريطي نمو الخلية للتحكم، والنواقل فقط، وعينات EGFP-KI على مدى فترة 3 أيام بعد الهندسة. يشير الخط المكسور إلى إدخال الخلية 1 ×10 6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم تسلسل gRNA
CD19 5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3'
AAVS1 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3'

الجدول 1: تسلسلات الحمض النووي الريبي.

الكواشف الحجم لكل رد فعل واحد
P3 حل الخلية الأساسية 16.4 مل
الملحق 1 3.6 مل
مجموع 20 مل

الجدول 2: إعداد مزيج كاشف الكواشف النووية.

وصف تسلسل قصد
التمهيديات الأمامية CD19 5'-AAATTCAGGAAAGGGGGAAG-3' تضخيم موقع CD19 لتحليل Indel
التمهيدي العكسي CD19 5'-GCGGACCTCTTCTGTCCATG-3' تضخيم موقع CD19 لتحليل Indel
تقاطع PCR التمهيدي إلى الأمام 5'-غاغاغكتغاتاغاك-3' تقاطع PCR
تقاطع PCR عكس التمهيدي 5'-غاغاغاغاكاكاكاتكاتك-3 تقاطع PCR

الجدول 3: التهيئة المستخدمة.

وصف فلوروفور استنساخ
CD19 المضادة للإنسان برنامج المقارنات الدولية HIB19
صبغة الجدوى eFlour 780 -

الجدول 4: تدفق الأجسام المضادة لقياس الخلايا وصبغة الجدوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تم هندسة الجينوم دقيقة في الخلايا B البشرية الأولية تحديا حتى وقت قريب9،10. كنا قد نشرت سابقا بروتوكولات باستخدام CRISPR / Cas9 لهندسة الخلايا B البشريةالأولية 9. هنا ، نوضح البروتوكولات المحسنة لعزل الخلايا B ، والتوسع ، والهندسة للسماح بكفاءة KO من CD19 أو لضرب في EGFP.

هنا نحن نثبت أن لدينا بروتوكول التوسع يسمح التوسع السريع للخلايا B في الثقافة لمدة تصل إلى 44 أضعاف التوسع في 7 أيام(الشكل 1). أظهر هذا البروتوكول معدل توسع أسرع من تلك التي أبلغ عنها جونسون وآخرون9 و Hung et al.10 الخطوات الحاسمة لضمان التوسع الصحي والسريع للخلايا B الأولية هي تجديد الوسط بعوامل تنشيط جديدة كل يومين وضمان عدم تجاوز عدد إجمالي الخلايا B في الثقافة 2 × 106 خلية / مل.

وجدنا أيضا أن لدينا تحسين بروتوكول لtransfecting نظام CRISPR / Cas9 لCD19 KO أدى إلى كفاءة CD19 KO عالية (الشكل 2 والشكل 3). على غرار دراسة سابقة9، لاحظنا انخفاضا طفيفا في استعادة الخلية وقابلية البقاء بعد الكهربية في 24 ساعة. وهذا يشير إلى أن الكهرومporation يؤثر على صحة الخلايا الكلية للخلايا B الأولية; ومع ذلك ، فإن الخلايا في نهاية المطاف انتعاش في غضون 48 ساعة (البيانات غير مبين).

الفائدة من استخدام هذا البروتوكول electroporator هو أننا يمكن أن العينات electroporate بمعدل أسرع بكثير (16 ردود الفعل في أقل من 1 دقيقة)، في حين أن البروتوكولات السابقة9،10 تأخذ ما يقرب من 10-12 دقيقة ل16 ردود الفعل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام transfection يلغي القوس الكهربائي المحتملة من الكهربائي لوحظ في الدراسات السابقة9،10. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع نطاق هذه الطريقة الهندسية لأعداد أكبر من الخلايا B باستخدام أكبر، cuvettes المتاحة تجاريا (البيانات غير مبين).

بعض الخطوات الحاسمة لضمان صحة الخلايا الشاملة المثلى وكفاءة KO: أولا، تأكد من إعداد وسيط توسيع الخلية B وتوازنه مسبقا لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. ثانيا، لا ينبغي أن يتجاوز الحجم الإجمالي لركيزة العدوى 20٪ (v/v) من الكاشف النووي. ثالثا، يجب توسيع/تنشيط الخلايا لمدة 48 ± 2 ساعة للحصول على أفضل النتائج. رابعا، اضغط على cuvette الكهربائي بلطف قبل وضعه في المصفح الكهربائي لضمان أن حل تفاعل العدوى يغطي الجزء السفلي من الكوفيت. خامسا، تأكد من بقية الخلايا الكهربائية في cuvette لمدة 15 دقيقة فقط في RT. ترك الخلايا في كاشف النوى بعد الكهرومporation لفترة طويلة جدا يمكن أن تضر بقاء الخلية الشاملة. سادسا، تأكد من احتضان الخلايا مع وسائل الإعلام في cuvette لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة. سابعا، إن وضع 106 خلايا كهربائية في 1 مل لأول 48 ساعة يميل إلى مساعدة الخلايا على التعافي بسرعة أكبر من زراعة الخلايا بكثافة أقل (البيانات غير مبينة). وأخيرا، فإن استخدام بروتين Cas9 mRNA أو Cas9 سيؤدي إلى كفاءة تحرير مماثلة (البيانات غير مبينة)؛ ومع ذلك، استخدمنا Cas9 مرنا للراحة والتكلفة.

هناك شاغلان رئيسيان عند استخدام CRISPR/Cas9 هما الآثار غير المستهدفة ونقل الكروموسومات. الآثار خارج الهدف الناجمة عن أزواج قاعدة غير متطابقة من sgRNA إلى التسلسل المستهدف، ويؤدي إلى العديد من المواقع ملزمة ممكن على الجينوم وخلق متعددة، غير المرغوب فيها KOs الجينات. ولذلك، ينبغي أن تؤخذ النتيجة المتوقعة خارج الهدف في الاعتبار جنبا إلى جنب مع النتيجة على الهدف لتقليل هذه المسألة. يمكن أن يحدث نقل الكروموسومات بسبب آثار خارج الهدف أو عند ضرب جينات متعددة. وهذا يمكن أن يسبب أحداثا كارثية تجريبيا وسريريا. المحررينقاعدة 12 تغيير النيوكليوتيد واحد (فئتين: محرر قاعدة السيتوسين ومحرر قاعدة أدينين) لتعطيل عنصر الربط، لإنشاء كودون وقف سابق لأوانه، أو لخلق طفرة نقطة، مما يؤدي إلى استهداف الجين KO دون DSB (استعرضت على نطاق واسع في مكان آخر12). وبالتالي، يمكن استخدام نهج التحرير الأساسي لمنظمات KOs أحادية أو متعددة الجينات للتحايل على عمليات النقل الكروموسومية.

كما أننا نثبت أن CRISPR/Cas9 ، جنبا إلى جنب مع rAAV6 ، يمكن استخدامها للتوسط بكفاءة KI الخاصة بالموقع والتعبير عن EGFP في موقع AAVS1. لاحظنا التعبير EGFP لمدة 12 يوما على الأقل بعد الهندسة. لاحظنا أيضا اثنين من السكان إيجابية EGFP: تعبير عالية ومتوسطة EGFP في عينة KI في اليوم 12(الشكل 5A)،في حين أظهرت عينة ناقلات فقط نسبة ضئيلة من الخلايا مع التعبير EGFP المتوسطة. ونحن نتكهن بأن هذه الظاهرة "السكان عالية ومتوسطة" يرجع إلى التكامل biallelic من ناقلات. ويمكن إجراء مزيد من التحقيق باستخدام PCRتمتد 13 من الخلايا متوسطة وعالية EGFP لتأكيد هذه الفرضية. تحذيرين على استخدام AAV كناقل: أولا، ناقلات AAV لديها قدرة شحن صغيرة، تصل إلى 4.7 كيلوbases، مما تسبب في مشاكل عند طرق في جين كبير. إن تقليل حجم أذرع التماثل التماثلي سيسمح بإيواء جين أكبر ، مما سيؤدي بدوره إلى تقليل كفاءة KI (البيانات غير المعروضة). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام التكامل المتزامن أو التسلسلي لمتجهات تحميل الجينات المتعددة14،15. وأفادت الدراسات استجابة مناعية وإزالة الخلايا التي يسببها AAV في نماذج الحيواناتالمناعية 16,17. وبدلا من ذلك، يمكن استكشاف نموذج تقرير التنمية البشرية المانح غير الفيروسي للتحايل على هذه المسألة.

باختصار، لقد أظهرنا عمليات شاملة خطوة بخطوة لعزل الخلايا B وتوسيعها وهندستها مما أدى إلى كفاءة عالية في تعديل الجينات. يمكن استخدام هذه الطريقة الهندسية للجين KO ولدراسة وظائف الجينات في الخلايا B. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لهندسة الخلايا B للتعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة لمكافحة العدوى. وأخيرا، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الخلايا B مهندس للتعبير عن وإفراز الإنزيمات العلاجية التي يمكن استخدامها كعلاج الخلايا الذاتية القائمة على لعلاج الانزيمات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تم إيداع براءة اختراع حول طرق صنع واستخدام خلايا B المحررة من الجينوم مع M.J.J. و K.L. و B.S.M كمخترعين. B.S.M هو مستشار ويملك الأسهم في شركة Immusoft شركة Immusoft رعت البحوث في مختبر B.S.M.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق أبحاث سرطان الأطفال (CCRF) والمعاهد الوطنية للصحة R01 AI146009 إلى B.S.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug IDT 1081059 smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza V4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer Quality Biological 118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA Trilink Biotechnology L-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg Invivogen TLRL-2006-5 different sizes available
Cryostor CS10, 100 mL STEMCELL Technology 7930
CTS Immune Cell SR Thermo Fisher Scientific A2596101
EasySep human B cells isolation kit STEMCELL Technology 17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780 eBiosciences 65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-free R&D Systems CCM031 B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube Corning 352059
Fetal Bovine Serum (FBS) R&D Systems S11550 For thawing B cells only
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps BioExpress T-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS GE lifesciences SH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unit Lonza AAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unit Lonza AAF-1002X
Mega CD40 Ligand Enzo Life Sciences ALX-522-110-C010
Mr. Frosty Sigma-Aldrich C1562-1EA For freezing cells
Pen/Strep 100X Sigma-Aldrich TMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19 biolegend 302228 smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) Vigene Biosciences N/A large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ug R&D Systems 217-IL-250 different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ug R&D Systems 247-ILB-025 different sizes available
The Big Easy EasySep Magnet STEMCELL Technology 18001 different sizes available
Tris-EDTA (TE) buffer Fisher Scientific BP2476100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
  3. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
  4. Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
  5. Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
  6. Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
  7. Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
  8. Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
  9. Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
  10. Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
  11. Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
  12. Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
  13. Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
  14. Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
  15. Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
  16. Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
  17. Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 165، CRISPR/Cas9، هندسة الجينوم، AAV المؤتلف، تحرير الجينات، الخلايا B البشرية الأساسية
هندسة الجينوم للخلايا B البشرية الأولية باستخدام CRISPR/Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laoharawee, K., Johnson, M. J.,… More

Laoharawee, K., Johnson, M. J., Lahr, W. S., Peterson, J. J., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (165), e61855, doi:10.3791/61855 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter