Summary
Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para a engenharia do genoma baseada em CRISPR/Cas9 das células B humanas primárias para nocaute genético (KO) e knock-in (KI) para estudar funções biológicas de genes em células B e o desenvolvimento de terapêuticas de células B.
Abstract
As células B são linfócitos derivados de células-tronco hematopoiéticas e são um componente-chave do braço humorístico do sistema imunológico adaptativo. Eles fazem candidatos atraentes para terapias baseadas em células devido à sua facilidade de isolamento do sangue periférico, sua capacidade de expandir in vitro e sua longevidade in vivo. Além disso, sua função biológica normal — para produzir grandes quantidades de anticorpos — pode ser utilizada para expressar quantidades muito grandes de uma proteína terapêutica, como um anticorpo recombinante para combater a infecção, ou uma enzima para o tratamento de enzimas. Aqui, fornecemos métodos detalhados para isolar células B humanas primárias de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) e ativar/expandir células B isoladas in vitro. Em seguida, demonstramos as etapas envolvidas no uso do sistema CRISPR/Cas9 para ko específico do local de genes endógenos em células B. Este método permite um KO eficiente de vários genes, que podem ser usados para estudar as funções biológicas dos genes de interesse. Em seguida, demonstramos os passos para o uso do sistema CRISPR/Cas9 juntamente com um vetor recombinante, associado a adeno, viral (rAAV) para uma integração eficiente específica do local de um de expressão transgênica em células B. Em conjunto, este protocolo fornece uma plataforma de engenharia passo a passo que pode ser usada em células B humanas primárias para estudar funções biológicas de genes, bem como para o desenvolvimento de terapêuticas de células B.
Introduction
As células B são um subgrupo da linhagem linfócito derivada de células-tronco hematopoiéticas. Eles desempenham um papel crítico no sistema imunológico humorálógico adaptativo, produzindo grandes quantidades de anticorpos em resposta aos desafios imunológicos1. As células B também são precursoras das células B da memória e das células plasmáticas de longa duração, com uma imunidade humoral duradoura2. As células plasmáticas, em particular, são únicas entre as células imunes em sua capacidade de produzir grandes quantidades de um anticorpo específico enquanto sobrevivem por anos ou décadas3. Além disso, a facilidade de isolamento do sangue periférico faz da linhagem de células B um excelente candidato para novas terapias baseadas em células4.
Anteriormente, métodos de integração aleatória, como aqueles que utilizam vetores lentivirais ou um transposon da Bela Adormecida, têm sido utilizados para projetar células B para entrega e expressão transgênicas5,6,7,8. No entanto, a natureza não específica dessas abordagens dificulta o estudo das funções biológicas de um gene específico nas células B e traz um risco inerente de mutagênese insercional e expressão transgênica variável e/ou silenciamento no cenário terapêutico.
O sistema CRISPR/Cas9 é uma poderosa ferramenta de engenharia de genomas que permite aos pesquisadores editar precisamente o genoma de várias células em inúmeras espécies. Recentemente, dois grupos, incluindo o nosso, desenvolveram com sucesso métodos de expansão ex vivo e engenharia de genomas direcionados das células B humanas primárias9,10. Descreveremos o processo de purificação das células B humanas primárias de uma amostra de leucemia. Depois disso, descreveremos nosso protocolo atualizado para expansão de células B e ativação de células B isoladas. Descreveremos então um processo para eliminar o cluster de diferenciação 19 (CD19), um receptor específico de células B e uma marca registrada das células B, por eletroporação para introduzir o CRISPR/Cas9 mRNA juntamente com o CD19 sgRNA em células B ativadas.
Cas9 mRNA é traduzido e se liga ao sgRNA CD19 para formar um complexo de ribonucleoproteína CRISPR/Cas9-sgRNA (RNP). Posteriormente, o sgRNA no complexo leva Cas9 a criar quebra de dois fios (DSB) na sequência de destino no exon 2 do gene. As células repararão o DSB por "junção final não homólogoa" introduzindo ou excluindo nucleotídeos, levando à mutação de mudança de quadro e fazendo com que o gene seja eliminado. Em seguida, mediremos a perda de CD19 por citometria de fluxo e analisaremos a formação indeléxica através do rastreamento de indelés por análise de decomposição (MARÉ).
Descreveremos então o processo de utilização do CRISPR/Cas9 juntamente com um vetor AAV6 recombinante (rAAV6, um modelo de doador para reparo direcionado à homologia (HDR)) para mediar a inserção específica do local da proteína fluorescente verde aprimorada(EGFP) no gene de integração do local de integração do vírus associado a Adeno 1 (AAVS1). O gene AAVS1 é um lócus ativo sem funções biológicas conhecidas e um local de integração viral AAV no genoma humano; portanto, é considerado um "porto seguro" para a engenharia do genoma. Aqui, relatamos que a expansão e ativação de células B permitiu uma expansão de até 44 vezes em 7 dias de cultura(Figura 1). A eletroporação das células B apresentou ligeira redução da saúde celular global (Figura 2A) em 24 h após a transfecção. A análise da parcela de dispersão do marcador CD19 (Figura 2B) mostrou uma redução de até 83% nas células editadas(Figura 2C).
A análise da MARÉ dos cromatógrafos (Figura 3A) revelou que o % indels foi semelhante à % perda de proteína por citometria de fluxo(Figura 3B). A análise da citometria de fluxo do experimento KI mostrou que as células que receberam vetor AAV (Figura 4),juntamente com RNP, expressaram até 64% células positivas de EGFP(Figura 5A)e posteriormente apresentaram integração bem sucedida por reação de cadeia de polimerase de junção (PCR) (Figura 5B). A contagem de células mostrou que todas as amostras se recuperaram rapidamente em 3 dias após a engenharia (Figura 5C).
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Protocol
Amostras de leucemia de doadores saudáveis foram obtidas de um banco de sangue local. Todos os experimentos descritos aqui foram determinados a serem isentos para pesquisa pelo Institutional Review Board (IRB) e foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) da Universidade de Minnesota.
NOTA: Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a precaução universal para patógenos transmitidos pelo sangue, com técnicas estéreis/assépticas e equipamentos de biossegurança adequados nível 2.
1. Prepare os suplementos para o meio de expansão de células B
- Reconstituir oligonucleotídeo cpg a uma concentração de 1 mg/mL.
- Reconstituir o ligante CD40 (CD40L) a uma concentração de 100 μg/mL.
- Reconstituir il-10 humanos recombinantes (rhIL-10) a uma concentração de 50 μg/mL.
- Reconstituir il-15 humanos recombinantes (rhIL-15) a uma concentração de 10 μg/mL.
NOTA: Mantenha cada suplemento em alíquotas pequenas a -20 °C a -80 °C por até 6 meses.
2. Prepare o meio basal
- Combine meio basal de células B com suplemento de mídia de 5% (v/v) para expansão in vitro de células imunes (por exemplo, TCS Immune Cell SR) e penicilina de 1% (v/v) e estreptomicina.
- Esterilize o meio basal usando um adaptador de filtro de 0,22 μm em uma garrafa esterilizada.
- Mantenha o meio basal a 4 °C por até 1 mês.
3. Prepare o meio de expansão de células B
- Transfira a quantidade necessária do meio basal em um recipiente estéril para cultivar as células B em 5 × 105 células/mL.
- Suplemente o meio basal com 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 e 10 ng/mL rhIL-15.
- Filtre o meio de expansão da célula B usando um filtro de 0,22 μm.
- Equilibre o meio de expansão de células B na incubadora de cultura tecidual a 37 °C, 5% de CO2 com umidade por pelo menos 30 minutos antes do uso.
NOTA: Prepare o meio de expansão de células B fresco para usar por um dia. Não prepare o meio de expansão de células B para usar por vários dias. Esta receita de mídia incentiva a proliferação de células B de memória e células B humanas ativadas.
4. Purificação e expansão de células B humanas
NOTA: Adicione 99-100% de álcool isopropílico a um recipiente de congelamento controlado pela temperatura, seguindo as instruções do fabricante, e esfrie o recipiente de congelamento a 4 °C antes de iniciar o passo 4.1.
- Isole pbmcs de uma amostra de leucemia
- Transfira uma amostra de leucemia (aproximadamente 8-10 mL) para um tubo cônico estéril de 50 mL.
- Eleça o volume para 35 mL com soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).
- Coloque cuidadosamente uma amostra de leucemia de 35 mL em 15 mL de média gradiente de densidade.
- Centrifugar a 500 × g por 25 minutos sem freio, remover a camada de plasma sem perturbar a camada de buffy (camada PBMC), coletar os PBMCs da interface e transferir para um novo tubo cônico estéril de 50 mL.
- Leve os PBMCs a 50 mL com 1x PBS.
- Centrífuga a 500 × g por 5 min sem freio. Remova o supernatante sem perturbar a pelota PBMC, que pode parecer vermelha.
- Adicione 7 mL de tampão de lise de amônio-cloreto-potássio, pipeta 3 vezes para misturar bem e incubar à temperatura ambiente (RT) por 3 minutos.
- Eleça o volume para 50 mL com 1x PBS.
- Centrífuga a 400 × g por 5 min com freio de baixa resistência. Remova o supernatante sem perturbar a pelota. A pelota deve parecer rosada ou branca.
NOTA: Para continuar a cultivar as células B recém-isoladas, prepare o meio de expansão de células B antes de iniciar o isolamento das células B (etapa 4.2).
- Isolamento de células B de PBMCs usando kit de isolamento negativo de células B primários humanos
- Resuspend PBMCs no tampão de isolamento para uma concentração de 5 × 107 células/mL.
NOTA: Se o número total de PBMCs for inferior a 5 × 107 células, reduza o volume de tampão de isolamento para manter 5 × 107 células/mL. Os volumes mínimos e máximos de suspensão celular são de 0,25 mL e 8 mL, respectivamente. - Transfira até 8 mL (5 × 107 células/mL) para um tubo estéril, polipropileno, fundo redondo com tampa.
- Adicione 50 μL/mL de Melhorador de Coquetéis aos PBMCs.
- Adicione 50 μL/mL de Coquetel de Isolamento aos PBMCs, tampa o tubo e inverta 2-3 vezes para misturar.
- Incubar na RT por 5 min; no4º minuto de incubação, microesferas magnéticas de vórtice por pelo menos 30 s.
- Transfira 50 μL de microesferas magnéticas por 1 mL de PBMCs, tampa o tubo e inverta 2-3 vezes para misturar.
- Cubra até 10 mL com tampão de isolamento e pipeta suavemente para cima e para baixo 2-3 vezes.
- Coloque o tubo em uma estação magnética e incubar em RT por 3 minutos.
- Segure o ímã e o tubo juntos, e em um movimento, inverta o ímã e o tubo juntos para despejar a suspensão celular no novo tubo. Descarte o tubo velho.
- Repita o passo 4.2.8 (reduza o tempo de incubação para 2 min) e despeje a suspensão da célula B em um tubo cônico limpo.
- As células B enriquecidas estão prontas para uso. Se as células forem usadas imediatamente, continue a seção 4.3 (expansão de células B humanas). Verifique a pureza das células B isoladas por citometria de fluxo (opcional). Se as células forem congeladas antes do uso, continue a etapa 4.2.12.
- Para congelar as células B, centrífuga a 400 × g por 5 min, e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
- Resuspenque as células em meio de congelamento a 107 células/mL, e aliquot 1 mL/criovial.
- Coloque o criovial no recipiente de congelamento refrigerado e armazene a -80 °C durante a noite; em seguida, transfira o criovial congelado para um tanque de nitrogênio líquido; manter células congeladas até 1 ano.
NOTA: O rendimento esperado das células B isoladas é de 2%a 8% do total de PBMCs, com viabilidade de 95%-99%.
- Resuspend PBMCs no tampão de isolamento para uma concentração de 5 × 107 células/mL.
- Expansão de células B humanas
NOTA: Se usar células B recém-isoladas, pule as etapas 4.3.1-4.3.5. Conte as células e transfira o número necessário de células para um tubo cônico estéril e continue com a etapa 4.3.6.- Soro bovino fetal pré-quente (FBS) em um banho de água antes de descongelar as células B. Prepare 20 mL de meio de expansão de células B, transfira para um frasco T25 e pré-equilibre o meio em uma incubadora de cultura tecidual (a 37 °C, 5% CO2, com umidade) pelo menos 15 minutos antes do uso.
- Descongele as células B em um banho de água de 37 °C. Enquanto estiver esperando, transfira 2 mL de FBS pré-aquecidos em um tubo cônico estéril de 15 mL.
- Depois que as células B forem completamente descongeladas, adicione imediatamente 1 mL de FBS pré-aquecido, em termos de gota, na amostra. Incubar na RT por 1 min.
- Pipeta suavemente para resuspengar a amostra e transferir todo o volume, dropwise, em um tubo cônico contendo 2 mL de FBS pré-aquecidos.
- Elete o volume até 15 mL com 1x PBS estéril, tampa e inverta o tubo suavemente 2-3 vezes.
- Centrífuga a 400 × g por 5 min.
- Descarte o supernasce sem perturbar a pelota celular, resuspenque a pelota celular com 1 mL de meio de expansão pré-equilibrada de células B e conte as células. O número total de células deve ser de aproximadamente 107 células.
- Transfira as células para um frasco contendo 20 mL do meio de expansão pré-equilibrado da célula B. A concentração final das células deve ser de aproximadamente 5 x 105 células/mL.
- Incubar o frasco verticalmente em uma incubadora de cultura tecidual.
- Atualize completamente o meio de expansão a cada 2 dias, transferindo todo o volume de células B para um tubo cônico estéril e repetindo etapas 4.3.6-4.3.9.
NOTA: O frasco T25 pode conter de 10 a 20 mL de médio; O frasco T75 pode conter até 20-60 mL de médio.
5. Engenharia primária de células B humanas
- Células B do engenheiro a 48 ± 2 h após a expansão/ativação para obter resultados ideais. Prepare o meio de expansão de células B, alíquota de 1 mL do meio em uma placa de cultura tecidual de 48 poços e pré-equilíbrio em uma incubadora de cultura tecidual pelo menos 15 minutos antes do uso.
NOTA: Ao projetar um sgRNA CRISPR/Cas9 para um gene de interesse, siga os passos descritos abaixo.
- Projetar sgRNAs usando uma ferramenta online11.
- Projetar sgRNAs em um exon que é comum a todos os isoforms da proteína.
- Encomendar sgRNA quimicamente modificado de empresas respeitáveis.
- sgRNA geralmente vem em forma liofilizada; sgRNA reconstituído no tampão Tris-EDTA (TE) livre de estéril DNase/RNase a uma concentração de 1 μg/μL. - Prepare o substrato transfetante CRISPR/Cas9 misturando 1 μL (1 μg/μL) de sgRNA quimicamente modificado com 1,5 μL (1 μg/μL) de nuclease streptococcus pyogenes cas 9 (S.p. Cas9) quimicamente modificada por reação de transfecção. Para controle, use 1 μL de tampão TE em vez de sgRNA.
NOTA: Quando o sgRNA CD19 for usado para um experimento ko genético, consulte a Figura 2 para obter resultados. Quando o SgRNA AAVS1 é usado para um experimento de GENE KI, consulte a Figura 5 para obter resultados.- Mantenha todos os componentes no gelo.
- Misture suavemente e transfira 2,5 μL de substrato transfectante CRISPR/Cas9 por reação em um tubo de uma tira de 0,2 mL de 8 tubos; reservado em RT.
- Ligue um nucleofector (eletroporador) e prepare reagentes de transfecção, conforme mostrado na Tabela 1.
NOTA: Este é um bom passo para uma pausa, se necessário, colocando todos os reagentes no gelo. Remova todos os reagentes do gelo quando estiver pronto para retomar o experimento. Ao usar a proteína S.p. Cas9, o pesquisador deve pré-complexo CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein misturando 1 μg sgRNA com 5 μg de proteína S.p. Cas9, evitando quaisquer bolhas, e incubando a mistura no RT por pelo menos 20 minutos antes de usar para resultados ideais. - Conte e transfira 106 células B por reação de transfecção em um tubo cônico estéril.
- Eleça o volume até 15 mL com 1x PBS estéril e centrífuga a 400 × g por 5 min. Enquanto estiver esperando, prepare o reagente de transfecção celular primária(Tabela 2) e reserve no RT.
- Descarte o supernatante sem perturbar a pelota celular.
- Resuspenque a pelota celular com 10 mL de PBS estéril 1x e centrífuga a 400 × g por 5 min.
- Descarte o supernatante completamente sem perturbar a pelota celular.
- Transfira 0,5 μg de MRNA GFP quimicamente modificado (como repórter de transfecção) por 106 células B para a pelota celular (opcional).
- Resuspend a pelota celular com reagente de transfecção celular primária de 20 μL por 106 células B; misture suavemente por pipetar 5-6 vezes. Transfira 20,5 μL por reação de transfecção para o tubo de 0,2 mL da tira de 8 tubos contendo 2,5 μL do substrato de transfecção CRISPR/Cas9.
- Pipeta para cima e para baixo uma vez para misturar e transferir todo o volume (23 μL) em uma cuvette de transfecção. Cape e toque o cuvette no banco suavemente para garantir que o líquido cubra a parte inferior da cuvette.
- Use o protocolo de células B primárias humanas no nucleofector para transfecção.
NOTA: O nucleofector (eletroporador) pode ser colocado e ser usado fora da capa da cultura tecidual. Tampe a cuvette para garantir a esterilidade. - Descanse as células eletroporadas na cuvette em RT por 15 minutos.
- Transfira 80 μL do meio de expansão pré-equilibrada da célula B da placa de cultura tecidual para a reação de transfecção no cuvette. Coloque a cuvette na incubadora de cultura tecidual por 30 minutos.
- Pipeta suavemente algumas vezes para misturar e transferir todo o volume da amostra da cuvette para um poço apropriado de uma placa de cultura tecidual de 48 poços contendo 1 mL do meio de expansão de células B. A concentração final das células deve ser de 106 células/mL.
- Se realizar um experimento de GENE KI, transfira o vetor rAAV6 a 500.000 multiplicidade de infecção para o poço adequado contendo células eletroporadas (aproximadamente 45 min pós-eletroporação). Veja o exemplo rAAV6 vetor construto na Figura 4A.
NOTA: Por exemplo: Uma amostra de controle será eletroporada sem o vetor CRISPR/Cas9 ou o vetor rAAV6. Uma amostra somente vetorial será eletroporada sem CRISPR/Cas9 e, em seguida, será transduzida com o vetor rAAV6. Uma amostra KI será eletroporada com CRISPR/Cas9 e, em seguida, será transduzida com o vetor rAAV6. rAAV6 deve conter braços de emologia para cima e para baixo do site DSB direcionado para HDR. - Coloque a placa em uma incubadora de cultura tecidual a 37 °C e 5% de CO2 com umidade.
- Conte as células e regise viabilidade no primeiro dia pós-engenharia.
- Atualize o meio de expansão de células B a cada 2 dias contando as células e, em seguida, transferindo todo o volume das células para um tubo de microcentrifuge limpo de 1,5 mL. Centrifugar a 400 × g por 5 min, e descartar o supernasce sem perturbar a pelota. Resuspenque as células com 100 μL de meio de expansão de células B frescos, e transfira para um poço de uma placa de cultura tecidual de 24 poços. Levante o volume médio para alcançar uma concentração celular final em 5 × 105 células/mL.
NOTA: Uma placa de 48 poços pode conter até 1 mL médio/bem; uma placa de 24 poços pode conter até 2 mL médio/bem; uma placa de 12 poços pode conter até 4 mL médio/bem, e uma placa de 6 poços pode conter até 8 mL médio/bem. - Permita que as células projetadas se expandam por pelo menos 5 dias antes de realizar análises a jusante, como para análise de citometria de fluxo, análise de MARÉ e PCR de junção.
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Representative Results
O protocolo atualizado de expansão e ativação possibilitou a rápida expansão das células B em até 44 vezes em 7 dias(Figura 1; n =3 doadores). No experimento ko, a contagem de células B usando coloração azul Trypan mostrou mais de 80% de células viáveis com uma ligeira redução na recuperação celular tanto no controle quanto nas amostras de KO CD19 a 24 h pós-eletroporação(Figura 2A; p ≥ 0,05, n = 3 doadores). Este resultado indica que a eletroporação afetou ligeiramente a saúde geral das células B. As células B foram coletadas no dia 5 pós-transfecção para citometria de fluxo e análises da MARÉ. Os gráficos de dispersão representativos da amostra de controle e KO mostraram células CD19-negativas de 14% e 95%, respectivamente (Figura 2B). A quantitação das parcelas de fluxo apresentou redução significativa na expressão CD19 nas amostras ko quando comparada ao controle (Figura 2B; p ≤ 0,0001, n = 3 doadores). Os cromatógramas de sequenciamento genômico (ver sequências de primer na Tabela 3) apresentaram picos duplos nas células CD19 KO B, indicando inserções/exclusões de nucleotídeos pós-CRISPR/Cas9 mediado DSB, enquanto picos únicos foram observados no controle, indicando que não ocorreu DSB nesta amostra(Figura 3A). A análise indel dos cromatógrafos (utilizando uma ferramenta gratuita de análise de MARÉ on-line) das amostras de KO mostrou alta % de formação indeléda (>90%) no lócus CD19, que é consistente com % perda de proteína CD19 detectada por citometria de fluxo (Figura 3B; p ≥ 0,05, n = 3 doadores). Esses resultados indicam que o CRISPR/Cas9 gerou eficientemente um CD19 KO em células B. As células B do experimento KI foram coletadas no dia 12 pós-engenharia para análises de citometria de fluxo e junção(Tabela 4). As parcelas de dispersão apresentaram 64% das células EGFP-positivas na amostra que receberam o vetor rAAV6 (Figura 4) juntamente com a RNP, enquanto nenhuma célula EGFP positiva foi observada no controle; mínimo de positividade EGFP foi observada na amostra que recebeu apenas vetor AAV(Figura 5A). Uma amplificação de PCR de junção (ver sequências de primer na Tabela 3) mostrou 1,5 Kbps amplicons na amostra KI(Figura 5B),enquanto nenhum produto PCR foi observado na amostra de controle ou somente vetorial. A contagem celular mostrou que o processo de engenharia afeta a recuperação celular na amostra KI mais do que o controle ou as amostras somente vetoriais(Figura 5B). No entanto, todas as amostras rapidamente se recuperaram dentro de 3 dias após a engenharia (Figura 5B). Juntos, esses resultados indicam que a integração bem-sucedida do EGFP no lócus AAVS1 leva à expressão estável do EGFP pelo menos 12 dias após a engenharia.
Figura 1: Expansão de células B in vitro. As células B foram semeadas a 1 × 106 células no dia 0 (zero) a uma densidade de 5 × 105 por mL e expandidas 44 vezes em 7 dias (n=3 doadores independentes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2A: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2B: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2C: Nocaute CD19 mediado por CRISPR/Cas9 (KO) em células B. ( A )Ográfico da barra mostra >70% de recuperação celular (painel esquerdo) e >80% viabilidade (painel direito) de células pós transfecção foram observados tanto no controle quanto nas amostras de KO CD19 em 24 horas após a eletroporação. (B) As parcelas de fluxo representativas de células vivas CD19 mostram 84,3% e 3,43% células CD19 positivas na amostra de controle e na amostra CD19 KO, respectivamente. (C) Gráfico de barras mostra redução significativa do CD19 no grupo KO CD19 mediado por CRISPR/Cas9 (p ≤ 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3A: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3B: Perda de proteína CD19 vs formação indeléda. (A) Os cromatógrafos retratam picos de sequenciamento da amostra de controle e cd19 knockout (KO). A caixa cinza nos picos de controle destaca a sequência de destino do GRNA CD19 com o local de corte previsto indicado por uma seta. CD19 KO mostrou "picos duplos" sequenciamento em torno do local de corte previsto, indicando inserção/exclusões de nucleotídeos após a quebra dupla encalhada. (B) Gráfico de barras mostrando resultados consistentes entre % perda de proteína CD19 e formação % indel no lócus CD19 (p ≥ 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP vetorial construto. O de expressão contém uma forte sequência de promotor sintético (MND), imediatamente seguida por uma sequência de codificação de proteína de fluorescência verde aumentada (EGFP) e sequência de poli-adenylação (Poly A). Braços de enélogia AAVS1 flanqueiam a montante do promotor do MND e a jusante das sequências poli A. A EGFP será expressa sob a regulamentação do promotor do MND. Os comprimentos de sequência são indicados acima de cada componente da construção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5A: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5B: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5C: Integração específica do site mediada por CRISPR/Cas9 e rAAV6 do repórter EGFP em células B no dia 12 pós-engenharia. (A) A parcela de fluxo representativa não mostra células B positivas de EGFP no controle ou na amostra somente vetorial versus 64,4% das células B positivas do EGFP da amostra knockin (KI). (B) A reação em cadeia de polimerase de junção da amostra KI mostra a banda prevista de 1,5 Kbps; nenhuma banda foi encontrada no controle ou amostra somente de vetores. A água foi usada para garantir que não houvesse contaminação durante o processo de PCR. (C) O gráfico da barra retrata o crescimento celular do controle, apenas do vetor e das amostras EGFP-KI durante um período de 3 dias após a engenharia. A linha quebrada indica a entrada de 1 × 106 células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| nome | sequência de gRNA |
| CD19 | 5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3' |
| AAVS1 | 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3' |
Tabela 1: sequências de gRNA.
| Reagentes | Volume por reação 1 |
| Solução P3 Primary Cell | 16,4 mL |
| Suplemento 1 | 3,6 mL |
| total | 20 mL |
Tabela 2: Preparação da mistura de reagentes de nucleofecção.
| descrição | seqüenciar | propósito |
| Primers dianteiros CD19 | 5'-AAATTCAGGAAAGGGTTGGAAG-3' | Amplie o lócus CD19 para análise de Indel |
| Primer reverso CD19 | 5'-GCGGACCTCTTCTGTCCATG-3' | Amplie o lócus CD19 para análise de Indel |
| Primer para frente do PCR de junção | 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' | PCR de junção |
| Primer reverso pcr de junção | 5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3 | PCR de junção |
Tabela 3: Primers utilizados.
| descrição | Fluoróforo | clone |
| CD19 anti-humano | PerCP | HIB19 |
| Corante de viabilidade | eFlour 780 | - |
Tabela 4: Anticorpo de citometria de fluxo e corante de viabilidade.
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Discussion
A engenharia precisa do genoma em células B humanas primárias tem sido desafiadora até recentemente9,10. Já havia publicado protocolos usando o CRISPR/Cas9 para projetar células B humanas primárias9. Aqui, delineamos protocolos aprimorados para isolamento, expansão e engenharia de células B para permitir ko eficiente de CD19 ou para bater-in EGFP.
Aqui demonstramos que nosso protocolo de expansão permite a rápida expansão das células B na cultura para expansão de até 44 vezes em 7 dias(Figura 1). Este protocolo mostrou uma taxa de expansão mais rápida do que as relatadas por Johnson et al.9 e Hung et al.10 As medidas críticas para garantir a expansão saudável e rápida das células B primárias estão reabastecendo o meio com novos fatores de ativação a cada dois dias e garantindo que o número total de células B na cultura não exceda 2 × 106 células/mL.
Também descobrimos que nosso protocolo aprimorado para transfetar o sistema CRISPR/Cas9 para CD19 KO resultou em alta eficiência ko CD19(Figura 2 e Figura 3). Semelhante a um estudo anterior9,observamos uma ligeira redução na recuperação celular e viabilidade pós-eletroporação em 24 h. Isso indica que a eletroporação afeta a saúde celular global das células B primárias; no entanto, as células eventualmente se recuperam dentro de 48 h (dados não mostrados).
O benefício do uso deste protocolo eletroporador é que podemos eletroporar amostras a uma taxa muito mais rápida (16 reações em menos de 1 min), enquanto os protocolos anteriores9,10 levam aproximadamente 10-12 min para 16 reações. Além disso, este sistema de transfecção elimina o potencial arco elétrico do eletroporador observado em estudos anteriores9,10. Além disso, este método de engenharia pode ser ampliado para um número maior de células B usando cuvettes maiores e comercialmente disponíveis (dados não mostrados).
Algumas etapas críticas para garantir a saúde geral ideal das células e eficiências de KO: Primeiro, garantir que o meio de expansão de células B esteja preparado e pré-equilibrado por pelo menos 15 minutos antes do uso. Em segundo lugar, o volume total de substrato de transfecção não deve exceder 20% (v/v) do reagente de nucleofecção. Em terceiro lugar, as células devem ser expandidas/ativadas por 48 ± 2h para obter resultados ótimos. Em quarto lugar, toque a cuvette de eletroporação suavemente antes de colocar no eletroporador para garantir que a solução de reação de transfecção cubra a parte inferior do cuvette. Em quinto lugar, certifique-se de descansar as células eletroporadas na cuvette por apenas 15 minutos no RT; Deixar células no reagente nucleofection após eletroporação por muito tempo pode prejudicar a sobrevivência geral das células. Em sexto lugar, certifique-se de incubar as células com mídia no cuvette por não mais do que 30 min. Em sétimo lugar, colocar 106 células eletroporadas em 1 mL para os primeiros 48 h tende a ajudar as células a se recuperarem mais rapidamente do que a culhá-las em menor densidade (dados não mostrados). Por fim, o uso da proteína Cas9 mRNA ou Cas9 resultará em eficiências de edição semelhantes (dados não mostrados); no entanto, usamos Cas9 mRNA para conveniência e custo.
Duas grandes preocupações ao usar o CRISPR/Cas9 são efeitos fora do alvo e translocações cromossômicas. Efeitos fora do alvo causados por pares de base incompatíveis de sgRNA à sequência de destino, levam a numerosos possíveis locais de ligação no genoma e criam KOs de genes múltiplos e indesejados. Portanto, o escore fora do alvo previsto deve ser levado em consideração, juntamente com o escore no alvo para minimizar esse problema. A translocação cromossômica pode ocorrer devido a efeitos fora do alvo ou ao eliminar múltiplos genes. Isso pode causar eventos catastróficos experimental e clinicamente. Os editores base12 alteram um único nucleotídeo (duas classes: editor base de citosina e editor base de adenina) para interromper o elemento de emenda, para criar um codon de parada prematuro, ou para criar uma mutação de ponto, levando ao gene-alvo KO sem DSB (revisado extensivamente em outros lugares12). Assim, a abordagem de edição de base pode ser usada para KOs de um único ou múltiplo gene para contornar translocações cromossômicas.
Também demonstramos que o CRISPR/Cas9, juntamente com o rAAV6, pode ser usado para mediar eficientemente ki específico do site e expressão de EGFP no lócus AAVS1. Observamos a expressão EGFP por pelo menos 12 dias após a engenharia. Observou-se também duas populações positivas de EGFP: uma expressão de alto e um EGFP intermediário na amostra KI no dia 12 (Figura 5A), enquanto a amostra somente vetorial mostrou uma porcentagem mínima de células com expressão EGFP intermediária. Especulamos que esse fenômeno "populações altas e intermediárias" se deve à integração bialálica do vetor. Uma investigação mais aprofundada utilizando a PCR13 das células intermediária e alta EGFP pode ser feita para confirmar essa hipótese. Duas ressalvas sobre o uso do AAV como vetor: Primeiro, os vetores AAV têm uma pequena capacidade de carga, até 4,7 quilobases, causando problemas ao bater em um gene grande. Reduzir o tamanho dos braços de escoologia permitirá a acomodação de um gene maior, o que, por sua vez, reduzirá a eficiência do KI (dados não mostrados). Alternativamente, a integração simultânea ou sequencial de múltiplos vetores de carregamento genético pode ser usada14,15. Estudos relataram uma resposta imune e uma liberação de células transduzidas por AAV em modelos animais imunocompetuntes16,17. Alternativamente, um modelo HDR de doador não-viral pode ser explorado para contornar esse problema.
Em resumo, demonstramos processos abrangentes, passo a passo de isolamento, expansão e engenharia de células B que resultaram em altas eficiências de modificação genética. Este método de engenharia pode ser usado para ko genético e para estudar as funções de genes em células B. Além disso, este método pode ser usado para projetar células B para expressar um anticorpo recombinante para combater a infecção. Por fim, este método pode ser aplicado ao engenheiro de células B para expressar e segregar enzimas terapêuticas que podem ser usadas como uma terapia autóloga baseada em células para tratar enzimas.
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Disclosures
Uma patente foi registrada sobre os métodos de fabricação e uso de células B editadas por genoma com M.J.J, K.L., e B.S.M. como inventores. B.S.M é consultor e possui ações da Immusoft Inc. A Immusoft Inc. patrocinou pesquisas no laboratório da B.S.M.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Pesquisa do Câncer Infantil (CCRF) e pelo NIH R01 AI146009 para a B.S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
