Summary
אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.
Abstract
תרמוביה הביתית של האש היא מין אמטבולי וחסר כנפיים המתאים לחקר המנגנונים ההתפתחותיים של חרקים שהובילו לקרינה האבולוציונית המוצלחת שלהם על פני כדור הארץ. היישום של כלים גנטיים כגון עריכת גנום הוא המפתח להבנת שינויים גנטיים האחראים על מעברים אבולוציוניים בגישה Evo-Devo. במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול הנוכחי שלנו ליצירת ותחזוקה של זנים מוטנטים של T. domestica. אנו מדווחים על שיטת הזרקה יבשה, כחלופה לשיטת ההזרקה הרטובה המדווחת, המאפשרת לנו להשיג שיעורי הישרדות גבוהים ביציבות בעוברים מוזרקים. אנו מדווחים גם על הגדרת סביבה ממוטבת להזדווגות עם מבוגרים ולקבל את הדורות הבאים ביעילות גבוהה. השיטה שלנו מדגישה את החשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של כל מין ליישום מוצלח של שיטות עריכת גנום לאורגניזמים מודל לא מסורתיים. אנו צופים כי פרוטוקולי עריכת הגנום הללו יסייעו ביישום T. domestica כמודל מעבדה ולהאיץ עוד יותר את הפיתוח והיישום של כלים גנטיים שימושיים במין זה.
Introduction
Thermobia domestica שייך לאחד ממסדרי החרקים הבסיסיים ביותר, זיג נטומה, השומרת על מחזור חיים אמטבולי וחסר כנפיים של אבות קדמונים. תנוחה פילוגנטית בסיסית כזו ומאפייני אבות מגדירים מין זה כמודל אטרקטיבי לחקר המנגנונים שבבסיס ההצלחה של חרקים על פני כדור הארץ, המכסים מעל 70% ממיני בעלי החיים המתוארים1. T. domestica שימש זמן רב בעיקר כדי ללמוד מאפיינים אבות של פיזיולוגיה חרקים בגלל המאפיינים המתאימים שלה כמודל מעבדה, כגון מחזור חיים קצר יחסית (2.5-3.0 חודשים מעובר למבוגר הרבייה; איור 1A) ורבייה קלה. בשלושת העשורים האחרונים הורחב השימוש בו כדי לחקור מאפיינים של אבות קדמונים של תכונות שונות כגון תוכנית גוף, בידול עצבי ומקצבים צירקדיים2,3,4.
יישום כלים גנטיים מתקדמים ב- T. domestica יכול להאיץ עוד יותר תרומות כאלה בתחום מחקר רחב. הפרעה מוצלחת RNA (RNAi)-בתיווך נפילת גנים בעוברים, נימפות, ומבוגרים דווח ב T. domestica4,5,6. היעילות של RNAi המערכתי עדיין תלויה מאוד במינים - לדוגמה, הוא בדרך כלל גבוה בקולופטרה ואילו הוא נמוך בסדר הלפידופטרה7. היעילות ומשך ההפלה של RNAi ב- T. domestica טרם נבדקו. בנוסף ל- RNAi, דיווחנו בעבר על נוקאאוט גנים מוצלח של CRISPR/Cas9 בתיווך T. domestica8. מערכת CRISPR/Cas הוחלה באופן נרחב לעריכת גנום בחרקים במיוחד עבור נוקאאוט גנים ממוקדים. השימוש בו יכול להיות מורחב עבור יישומים אחרים כגון בדיקת כתב גנים, מעקב אחר שושלת התא, ומניפולציה של פעילות שעתוק על ידי דפיקות במבנים אקסוגני לאחר הקמת פרוטוקול להעברת רכיבים של מערכת CRISPR / Cas לתוך גרעינים9. בשילוב עם הרכבה הגנום שפורסם10, השימוש הרחב ופיתוח נוסף של עריכת הגנום מבוסס CRISPR / Cas ב T. domestica יקל על מחקרים המתמקדים במנגנונים האבולוציוניים שמאחורי ההצלחה המסתגלת יוצאת הדופן של חרקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור microinjection העובר עבור הזדווגות בוגר T. domestica כדי ליצור זן מוטציה באמצעות CRISPR / Cas9. בהתחשב בשיטה חדשנית זו, אנו דנים בחשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של מיני מודלים לא מסורתיים ליישומים מוצלחים של טכניקות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תחזוקת מושבות מעבדה
- לשמירה על אוכלוסיות של דגים מלאכותיים ומוטנטים, השתמשו במיכל פלסטיק גדול (460 מ"מ x 360 מ"מ x 170 מ"מ) עם מזון דגים מלאכותי רגיל, מים ב כוסות פלסטיק עם חור אוורור בחלקו העליון, נייר מקופל להסתרת החרקים וכותנה שכבתית להטלת ביצים (איור 2A). שמור את כל תרבויות T. domestica בתוך 37 °C (70 °F) חממות ולהגדיר את הלחות היחסית (RH) בתוך כל מיכל ל 60%-80%.
הערה: מכיוון ש- T. domestica סופג אדי מים מהאטמוספירה11, אין צורך באספקת מים ישירה. RH המתאים נשמר בשל נוכחות של אדי מים מכוסות פלסטיק המכיל חור אוורור בחלק העליון או כוסות lidless בתוך כל מיכל. אין צורך לחות בתוך אינקובטור שלם המכיל תרבויות. משך הזמן המשוער של כל שלב התפתחותי בתנאי המתואר בפרוטוקול זה מוצג באיור 1. המהירות ההתפתחותית יכולה להיות מותאמת על ידי שינוי הטמפרטורה ו / או RH12. - מוסיפים אוכל מעת לעת. מוסיפים מים לפני שהם מתייבשים.
- להעביר את האוכלוסיות למיכל נקי חדש לפחות כל 3 חודשים בהתחשב בכך שמבוגרים מפסיקים להטיל ביצים בסביבה מלוכלכת ו / או אוכלוסייה צפופה (ראה דיון).
2. איסוף ביצים ומיקרו-יין
- עיצוב RNA מדריך (gRNA)
- תכנן רצף gRNA עבור כל מטרה נדרשת ופוצץ את רצפי gRNA נגד הרכבת הגנום כדי לבדוק אתרי זיהוי אפשריים מחוץ ליעד.
- לסנתז ולטהר את gRNAs על פי הוראות היצרן8.
הערה: כדוגמה, במקרה של מיקוד הגן הלבן טרנספורטר קלטת מחייב ATP, רצף יעד 20 bp תוכנן ושני אוליגונוקלאוטידים DNA מסונתז 5 '-TAATACGACTCACTACTTAGTAGTGTGGGAC-3' ו 5'-TTCTAGCTCTAAAAכתא-3' הוזמנו. תבנית הדנ"א הוכנה על ידי חישול שני אוליגונוקלאוטידים אלה ואחריו הגברה PCR ואת gRNA הוא אז במבחנה מתמלל מן התבנית עם פולימראז T7 RNA.
- הכנת מושבות איסוף ביצים
- העבירו כ-20 גברים ו-20 נשים מבוגרים למיכל בגודל בינוני (200 מ"מ x 150 מ"מ x 90 מ"מ) עם מזון, אספקת מים, נייר מקופל וחתיכת כותנה שכבתית קטנה להנחת ביצים (איור 2B).
- להקים מספר מושבות כדי לקבל מספר גדול של עוברים מבוימים בפרק זמן קצר כדי לשמש לעריכת גנום.
הערה: כ-20-40 ביצים צפויות להיאסף ממושבה לאחר 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. בדרך כלל לוקח כמה ימים למבוגרים שהועברו להתחיל להטיל ביצים, אולי בגלל הסתגלות לסביבה חדשה.
- ביום ההזרקה, להחליף את הכותנה בתוך המיכלים עם חדשים.
- הנח סרט דו-צדדי בגודל 76 מ"מ x 5 מ"מ על שקופית זכוכית רגילה של 76 מ"מ x 26 מ"מ.
- שמונה שעות לאחר מכן, לאסוף את הביצים מן הכותנה שכבתית על ידי הפרדת השכבות באמצעות מלקחיים.
- מיישרים את הביצים על הסרט הדו-צדדי באמצעות מברשת צבע רטובה ושומרים על מרחק של 2 מ"מ בין הביצים. יש לכוון את כל הביצים כך שציר הביצה האורך יפונה לצד ההזרקה(איור 3A). לחץ בעדינות על הביצים עם מברשת צבע להחזקה מוצקה במהלך ההזרקה.
הערה: בפרוטוקול זה, הפטרייה גדלה במהירות בביצים מוזרקות פגומות במצב רטוב וחם. חשוב לשמור על המרחק בין הביצים כדי למנוע זיהום צולב והתרחבות הפטרייה. - מערבבים את חלבון gRNA ו- Cas9 לריכוז סופי של 100 ננוגרם/μL ו- 500 ng/μL, בהתאמה. השתמש במים מזוקקים לדילול. דגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקדם היווצרות מורכבת ריבונוקלאופרוטאין ולאחר מכן לשמור את התערובת על הקרח.
הערה: אדום ניטרלי בריכוז סופי של 1% ניתן להוסיף לפתרון ההזרקה כדי לפקח על הכמות מוזרקת. - טען 2 μL של פתרון gRNA / Cas9 נימי הזרקת זכוכית עם microloader. ודא שאין בועות אוויר בתמיסה לפני ההזרקה. במידת הצורך, הקש על המחט כדי להסיר את הבועות.
הערה: בניסוי זה, מחט מוכנה משמשת לקבלת קצה מחט עדין (איור 3B). מחט תוצרת בית עם צורה דומה יכול לשמש במקום. - לתקן את נימי הזרקת זכוכית, טעון בעבר עם הפתרון gRNA / Cas9, למחזיק מצויד מניפולטור ולחבר את המחזיק microinjector אלקטרונית.
- מטב את צורת קצה המחט על ידי שבירתו מעט במלקחיים כדי למנוע סתימה ועמידות טובה יותר לאורך סדרה של זריקות (דוגמה למחט מתאימה מוצגת באיור 3C).
הערה: מומלץ להחליף מחט כאשר היא סתומה. אפשר להמשיך להזריק עם אותה מחט אם הוא שבור שוב עם מלקחיים, אבל טיפ רחב יותר מוביל יותר נזק לביצה ומוריד את שיעור ההישרדות שלהם. כמו T. ביצים מקומיות הם רכים ושבירים, שמירה על קצה מחט בסדר הוא המפתח שיש שיעור הישרדות גבוה לאחר הזרקה. - הכנס את המחט לנקודת האמצע של ציר האורך של ביצה והזרק כמות קלה של הפתרון (ראה איור 3D-H לעיון בכמות ההזרקה). להתאים את התצורה של microinjector אלקטרונית במהלך ההזרקה, בהתאם לצורת קצה המחט.
הערה: מומלץ להפעיל לחץ מתמיד במהלך ההזרקה, אחרת תכולת ביצה דביקה יכולה בקלות לזרום לתוך מחט הזכוכית ועלולה לסתום אותו. הפתרון עשוי להיות גם להזריק עם דופק לחץ קצר או עם לחץ מתמיד, בהתאם לכמות הנוזל מוזרק. זכור שכאשר לקצה המחט יש פתח רחב, יותר מדי פתרון מוזרק לביצה, מה שגורם לקטלניות (איור 3F-H). במקרה זה, לשמור על זרימה נוזלית מתמדת על ידי לחץ מתמיד, ולאחר מכן להכניס את המחט לתוך ביצה ולמשוך אותו מיד. אם זה גורם יותר מדי גלישה או פרצי הביצה, לשנות את המחט. - שמור את הביצים המוזרקות במיכל עם הגודל המתאים למספר הביצים המוזרקות (<20 ביצים: צלחת קטנה; >20 ביצים: מיכל בגודל בינוני) עם 60%-80% RH ו 37 °C (67 °F).
3. הזדווגות
- בדקו את הביצים המוזרקות מעת לעת והשליכו ביצים פגומות במלקחיים כדי למנוע צמיחה פטרייתית(איור 3I,J). במקרה יותר מדי פטרייה גדל על ביצה, לנקות את פני השטח של הביצה עם 70% EtOH.
- לפני הבקיעה (כ 10 ימים ב 37 מעלות צלזיוס לאחר הטלת ביצה), לטבול את שקופית הזכוכית עם הביצים מוזרק לתוך אבקת טלק כדי לצפות את פני השטח של הסרט דו צדדי. זה ימנע את הערימה של נימפות בקעו. מעבירים את מגלשות הזכוכית מצופות האבקה למיכל בגודל בינוני עם מזון, מים ונייר מקופל להסתרת החרקים.
- הסר את מגלשות הזכוכית לאחר שהנימפות בקעו. מעת לעת לספק מזון עד שהם מגיעים לבגרות.
הערה: לוקח בערך חודשיים וחצי עד שאנשים מגיעים לבגרות אחרי שהם בוקעים (איור 1A). הבמה הבוגרת נשפטת על סמך אוביפוסטור מפותח אצל נקבות (איור 1B). - כדי להזדווג עם הפרטים, להעביר כמה שיותר מבוגרים נקבות בר הדרושים ממושבת מעבדה למיכל בגודל בינוני ולהדגיר אותם לפחות 14 ימים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לוודא שהם בתולים.
הערה: אין צורך לאסוף נקבות בתולה ממושבת מעבדה כי למבוגרים T. domestica יש מחזור חוזר ונשנה של הזדווגות והזדווגות שנקרא "מחזור הרבייה וההזדווגות", שבמהלכו הנקבות זורקות זרע עם כל molt ומזדווגות שוב במחזור ההפריה הבא13. - העבירו זכר או נקבה בוגר G0 שהתפתח מביצה מוזרקת ומבוגרים מסוג פראי לצלחת פלסטיק קטנה (100 מ"מ x 40 מ"מ) עם אוכל, נייר מקופל וחתיכת כותנה קטנה להטלת ביצי G1(איור 2C'; צלחת הזדווגות). שמור את מנות ההזדווגות במיכל גדול יותר עם 60%-80% RH(איור 2C).
הערה: ניתן לכלול בצלחת מספר מבוגרים מסוג פראי כדי להגדיל את הסיכוי להזדווגות מוצלחת, אם כי שיעורי הצלחה גבוהים הושגו עם זיווג אחד לאחד.
4. גנוטיפינג
- עיצוב זוגות פריימר PCR עבור כל gRNA כדי להגביר מוצר 100-200 bp הכולל את האתר ממוקד על ידי gRNA. BLAST כל רצף פריימר מול מכלול הגנום כדי לבדוק את הספציפיות שלו (דוגמה מוצגת למיקוד הגן הלבן באיור 4A).
- בדוק את טרנספורמציית הנבט של מבוגרי G0.
- חמישה ימים לאחר הטלת הביצים, אוספים ביצי G1 בודדות מכל זוג בוגרים G0 לצינורות 0.2 מ"ל (ביצה אחת לכל צינור; חנות אספה דגימות ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך). להפריד את שכבות כותנה כדי לאסוף את הביצים.
הערה: מומלץ לגנוטיפ לפחות 12 נימפות G1 מכל זוג הזדווגות כדי להעריך את ההצלחה של העברת הנבט (ראה תוצאות מייצגות). - הוסף 15 μL של 0.25 מ"ג / מ"ל Proteinase K פתרון (מומס במאגר Tris-EDTA) לכל צינור, בקצרה הומוגניזציה דגימות עם קיסמים, ואת הדגירה ב 55 °C (70 °F) עבור 3 עד 16 שעות.
- להשבית את Proteinase K על ידי הצבת הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- מוסיפים 90 μL של מים מזוקקים לכל צינור ומערבבים היטב. השתמש 2 μL של supernatant בתמהיל תגובת PCR μL 10 μL המכיל את פריימרים תוכנן בשלב 4.1.
הערה: מומלץ להשתמש בפולימראז DNA המותאם לתבניות גולמיות כדי להגיע למספיק הגברה של PCR. - כדי לנתח את מוצרי PCR, בצע בדיקת ניידות הטרודופלקס (HMA) עם מערכת אלקטרופורזה של שבב זעיר (איור 3B; ראה Ohde et al., 2018)8.
הערה: מוטציות ניתן להעריך עם שתי שיטות חלופיות: (1) HMA עם פולימרים ג'ל סטנדרטי, כגון 8% polyacrylamide14; (2) עיכול של מוצרי PCR עם אנדונוקלאאז T7 ואחריו אלקטרופורזה ג'ל agarose15. - שמור רק את נימפות G1 הנובעות מבוגרים G0 המכילים מוטציות בנבט שלהם להשליך את האחרים.
- חמישה ימים לאחר הטלת הביצים, אוספים ביצי G1 בודדות מכל זוג בוגרים G0 לצינורות 0.2 מ"ל (ביצה אחת לכל צינור; חנות אספה דגימות ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך). להפריד את שכבות כותנה כדי לאסוף את הביצים.
- גנוטיפינג אישי של נימפות G1 / מבוגרים
- בודדו את נימפות G1 ללוחות של 24 בארות עם שאיפה או מברשת צבע. הנח את לוחות 24 הבאר במיכל גדול יותר (למשל, המיכל הבינוני המשמש בפרוטוקול זה) עם אספקת מים כמתואר לעיל כדי לשמור על RH של 60%-80%(איור 1D). שמרו על אספקת מזון דגים מלאכותי רגיל(איור 1D).
הערה: למרות שלב זה יכול להתבצע בכל נקודה של שלבי נימפה ומבוגרים, מומלץ לבצע אותו לאחר שהגיע לבגרות ורגע לפני הזיווג (>2.5 חודשים לאחר ההזרקה; איור 1B) כי קל יותר לתחזק כבאיות במיכל גדול. גידול אישי נדרש כדי לעקוב אחר הגנוטיפ של כל נימפה G1 על השלבים הבאים. נימפות G1 מאותו מבוגר G0 יכול להיות מוטציות שונות. - צבוט ומשוך cerci ואת חוט caudal מנימפה / מבוגר באמצעות מלקחיים ולאסוף אותם לתוך צינור 0.2 מ"ל המכיל 50 μL EtOH (לאחסן את הדגימות שנאספו ב -20 °C (70 °F) עבור אחסון לטווח ארוך).
הערה: דגימות רקמה נאספות ב- EtOH מכיוון שהיא מונעת אובדן של דגימות קטנות אלה עקב חשמל סטטי. אם אדם צריך לעצור את התנועה של חרקים, המרדים נימפה / מבוגר על קרח בעת לקיחת דגימות רקמה. כי T. domestica לא יכול לשרוד לאחר קירור לטווח ארוך על קרח, לא להרדים אותם במשך יותר מדקה ומיד להעביר אותם בחזרה לטמפרטורת החדר. אבלציה של cerci ואת חוטי caudal גורם ללא עלייה בתמותה. - מניחים צינורות מדגם עם העפעפיים פתוחים על בלוק תרמי במשך 15 דקות ב 70 מעלות צלזיוס כדי לאדות את EtOH.
- חזור על שלבים 4.2.2–4.2.5 עבור genotyping.
- שלח את מוצרי ה- PCR שבהם תבנית רצועת מוטנטים נצפתה לשירות רצף סנגר סטנדרטי.
- שמרו על הנימפות/מבוגרים של G1 עם המוטציות הרצויות והשליכו את האחרים (ראו איור 4C לקבלת תוצאת רצף מייצגת).
- בודדו את נימפות G1 ללוחות של 24 בארות עם שאיפה או מברשת צבע. הנח את לוחות 24 הבאר במיכל גדול יותר (למשל, המיכל הבינוני המשמש בפרוטוקול זה) עם אספקת מים כמתואר לעיל כדי לשמור על RH של 60%-80%(איור 1D). שמרו על אספקת מזון דגים מלאכותי רגיל(איור 1D).
- חוצים את המבוגרים המכילים את המוטציות הרצויות בצלחת הזדווגות ומשיגים את הדורות הבאים כדי ליצור זן מוטנט הומוזיגי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידינו, כ -100 ביצים ניתן להזריק היטב עם נימי הזרקה אחת כאשר יש לו את הקצה המתאים(איור 3C). הזרקה של gRNA / Cas9 ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בעוברים בתוך 8 h הראשון לאחר הטלת ביצה תוצאות indels באתר ממוקד gRNA. זה גורם מוטציות biallelic בתאים מסוימים של הדור מוזרק (G0) ולכן פנוטיפים פסיפס מוטציה מתקבלים בדרך כלל G0. לדוגמה, כאשר פרוטוקול זה שימש להזרקת gRNA שנועד למקד את הגן הלבן, 32.6% מנימפות G0 מציגות אובדן חלקי של פיגמנטציה בעיניהן המורכבות ובאזורי הגב שלהן (איור 5)8.
בשיטת ההזרקה היבשה המתוארת כיום, כאשר מוזרקים 80-120 ביצים שיעור ההישרדות של העוברים המוזרקים הוא גבוה ככל 40%-60%. זאת בניגוד לשיטת ההזרקה הרטובה הקודמת, שבה ביצים מוזרקות ומתוחזקות על צלחת אגרוז, ולעיתים מביאות לשיעור הישרדות של פחות מ-10%.
הערכה של טרנספורמציה נבט של מבוגרים G0 ואנשים מוטציה G1 נעשה על ידי PCR גנומי ואחריו HMA. ב- HMA, טיפוס פראי ואללים מוטנטים anneal בכל שילוב אפשרי, אשר בדרך כלל תוצאות ארבע להקות נפרדות על אלקטרופורזה ג'ל (שני homoduplexes ושני הטרודופלקסים)14. בדגימות G1 ניתן להבחין בבירור בין תבניות פס דיפרנציאליות בין דגימות סוג בר לדגימות שעברו מוטציה (איור 4B). טרנספורמציה נבט נמצא 39.1% של מבוגרים G0 כאשר אנו ממוקדים הגן הלבן 8. מניסיוננו, אחוז האנשים שעברו מוטציה בנימפות G1 מזוג G0 יחיד נע בין 25% ל -100%.
כדי להעריך את ההשפעה של סביבת ההזדווגות שלנו על הצלחת ההזדווגות, חצינו מבוגרים פראיים בצלחת הזדווגות והשגנו שיעור הצלחה של 95.8% (23/24 זוגות).
איור 1: מחזור החיים של ט. מקומיקה. (א)משך משוער של כל שלב התפתחותי ב- T. domestica. (B)מבט גב של נקבה בוגרת. ראש חץ מציין אוביפוסטור מפותח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סביבות מלאכותיות המשמשות בפרוטוקול זה. (A)מיכל גדול למושבת מעבדה,(B)מיכל בגודל בינוני לאיסוף ביצים,(ג)מנות הזדווגות עם אספקת מים במיכל גדול,(C') צלחת הזדווגות,(D)צלחת 24 באר עם אספקת מים במיכל בגודל בינוני. אזור ארוז מוגדל ב- (D ') כדי להציג אדם T. domestica. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הזרקה יבשה של ביצי T. domestica. (A) ביצים מיושרות על שקופית זכוכית. חץ שחור מציין את הנקודה שבה מחט מוכנסת. (B)צורה של קצה מחט זכוכית המשמש להזרקה. (ג)אותה מחט זכוכית לפני (למעלה) ואחרי (למטה) שבירת הקצה. מחטים היו מלאות באדום ניטרלי 1%. ראש החץ מציין את קצה המחט. סרגל קנה המידה הוא 1 מ"מ.(D)ביצה לא משויינת. (ה)דוגמה טובה לזריקה. חץ מציין את נקודת ההזרקה. (F-H) הפתרון עולה על גדותיו מהאתר המוזרק (F) או מהצד הנגדי (G) של הביצה המוזרקת; נפח הזרקה רב מדי גרם לפרץ(H). ראש חץ מציין תוכן ביצה על גדותיו. (I)בדרך כלל פיתח עובר מאוחר. ראש החץ מציין את העין המורכבת הצבעונית. (J)ביצה פגומה מצומקת 3 ימים לאחר ההזרקה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: גנוטיפינג של אנשי G1. (A)פריימרים PCR נועדו להגביר אזור גנומי 120 bp הכולל את אתר היעד gRNA. (B)להקות מרובות של DNAs הומודופלקס והטרודופלקס מזוהות בדגימות שעברו מוטציה בעוד להקות בודדות מופיעות בדגימות שלא עברו מוטציה. L: סולם DNA, U: דגימות לא מוטציה, M: דגימות מוטציה. (C)תוצאה מייצגת של רצף ישיר של מוצרי PCR מדגימות מוטנטים פראיים והטרוזיגוטיים. רצפים של סוג פראי ומוטנטים 
() אלל מוצגים למעלה. פריימר קדימה המוצג ב(A) שימש פריימר רצף. הרצף של מוטציה הטרוזיגית (למטה) מסומן על ידי שני רצפים חופפים מאתר המחשוף החזוי (חץ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אובדן פסיפס של פיגמנטציות בעיניים מורכבות ובאזור הגב לאחר מיקוד הגן הלבן עם הזרקת חלבון gRNA/Cas9. (A)Wildtype ו- (B) gRNA לבן / Cas9 חלבון מוזרק הראשון נימפות instar. אובדן חלקי של פיגמנטציות שחורות וורודות בעיניים (ראש חץ) ובאזור הגב (חץ) מסומנים. סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבור הדור המוצלח של מוטציית T. domestica הרצויה עם CRISPR/Cas9, חשוב תחילה לאסוף מספר מספיק של עוברים מבוימים להזרקה. עבור אוסף קבוע של מספר מספיק של ביצי T. domestica, המפתח הוא לבחור גודל מתאים של המיכל יש צפיפות אוכלוסין נמוכה יותר כי זה יעזור להשלים בהצלחה סדרה של התנהגויות הזדווגות מורכבות, אשר חוזר על עצמו לאחר כל molt מבוגר13. זכר T. domestica מבוגר מעביר את הזרע שלה בעקיפין לנקבה באמצעות זרע. Sweetman (1938) דיווח כי זה לוקח מבוגרים גברים 20 עד 35 דקות מן החניכה של התנהגות ההזדווגות למיקום שלזרעון 12. סביר להניח כי הפרעה של האינטראקציה בין זוג הזדווגות על ידי אנשים אחרים מונע הפריה מוצלחת, אשר יכול לקרות בתדירות גבוהה יותר בסביבה צפופה.
למרות ביצים נאספים 8 שעות לאחר החלפת הכותנה בתוך מיכל כדי לאסוף מספיק ביצים בפרוטוקול שלנו, היעילות הגבוהה יותר של עריכת הגנום עשוי להיות מושגת על ידי איסוף ביצים והזרקת אותם בתוך זמן קצר יותר (למשל, 4 שעות לאחר הטלת ביצה) כאשר חומרים מוזרקים יש סיכוי גדול יותר להימסר לחלק הגדול של גרעינים. הזרקה למספר מספיק של ביצים בתוך זמן קצר יותר יכול להיעשות על ידי (1) הגדלת מספר או גודל של מיכלים אם החלל מאפשר, או (2) חוזר על אותו הליך כדי לקבל מספר מספיק של ביצים מוזרקות.
אתר ההזרקה נחשב בדרך כלל להיות חשוב עבור טרנספורמציה נבט מוצלח חרקים. T. ביצים ביתיות הן בדרך כלל אליפסואידיות בצורתן ומכילות רצועת נבט בקוטב אחד של ציר האורך שלהן. מומלץ להזריק את תערובת gRNA /Cas9 בנקודת האמצע של ציר האורך ביצה כי קשה לזהות את הקוטב שבו להקת נבט נוצר בעוברים מוקדמים בשל הצורה המשתנה של ביצה T. domestica. למרות פתרון gRNA /Cas9 אינו מוזרק ישירות לאתר של היווצרות רצועת הנבט, השגנו טרנספורמציה נבט גבוה ככל 39.1% של מבוגרים G08.
במהלך microinjection של ביצים, חשוב להשתמש קצה מחט בסדר כדי להשיג שיעור הישרדות גבוה, כפי שקורה עבור מודלים אחרים של בעלי חיים. השגנו שיעור הישרדות גבוה יותר לאחר הזרקה עם מחטים מוכנות מאשר בעת שימוש במחטי זכוכית תוצרת בית בביצי T. domestica. עם זאת, שיעור הישרדות גבוה דומה יכול להיות מושגת על ידי שכפול צורת המחט העדינה עם מחטים תוצרת בית (כפי שמוצג באיור 3B,C). על פי הניסיון שלנו, שיטת ההזרקה היבשה גורמת לשיעור הישרדות גבוה יותר משיטת ההזרקה הרטובה שדווחה בעבר8. מצאנו כי דגירה ביצה בסביבה יבשה היא המפתח לשיפור זה, תוך ניצול העובדה כי ביצי T. domestica ונימפות מוקדמות עמידים בפני התייבשות. זאת בהתאם לדיווחים קודמים המצביעים על כך שמינים אלה מעדיפים סביבה יבשה במיוחד בשלבים התפתחותיים מוקדמים וכי סביבה רטובה יכולה אפילו להזיק16. במקום צלחת פלסטיק, ג'ל agarose יכול לשמש ליישור מהיר של הביצים; עם זאת, העברת הביצים המוזרקות למשטח יבש מובילה לשיעור הישרדות גבוה יותר.
לסיכום, השיטה שלנו מדגישה את החשיבות של לקיחת הביולוגיה הייחודית של T. domestica בחשבון לעריכת גנום מוצלחת: שמירה על סביבה דלילה לאיסוף מספר מספיק של ביצים וסביבה יבשה לשיעור הישרדות גבוה יותר של עוברים מוזרקים. הפרוטוקולים הבסיסיים להזרקה, הזדווגות ותחזוקת תרבות המדווחים כאן משמשים לא רק ליצירת זנים מוטנטים עם עריכת גנום, אלא גם ליישומים של כלים גנטיים אחרים כגון RNAi וטרנסגנזה ויסייעו להבין את המנגנונים שבבסיס האבולוציה המוקדמת של חרקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
TO ו- TD נתמכו על ידי JSPS KAKENHI מענק מספרים 19H02970 ו 20H02999, בהתאמה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. Insect Hormones. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
