Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Derivatization af Protein Krystaller med I3C ved hjælp af Random Microseed Matrix Screening

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61894
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1
1School of Biological Sciences, The University of Adelaide, 2Institute of Photonics and Advanced Sensing (IPAS), School of Biological Sciences, The University of Adelaide
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel præsenterer en metode til at generere protein krystaller derivatized med I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syre) ved hjælp af mikroseeding at generere nye krystallisering betingelser i sparsomme matrix skærme. Bakkerne kan sættes op ved hjælp af flydende dispenserrobotter eller i hånden.

Abstract

Protein struktur belysning ved hjælp af røntgenkrystallografi kræver både høj kvalitet diffracting krystaller og beregningsmæssige løsning af diffraktion fase problem. Nye strukturer, der mangler en passende homologi model er ofte derivatized med tunge atomer til at give eksperimentelle fase oplysninger. Den præsenterede protokol genererer effektivt derivatized protein krystaller ved at kombinere tilfældige microseeding matrix screening med derivatization med en tung atom molekyle I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syre). Ved at indarbejde I3C i krystalgitteret kan diffraktionsfaseproblemet løses effektivt ved hjælp af en enkelt bølgelængdesynomenspredning (SAD) udfasning. Den ligesidede trekant arrangement af jodatomer i I3C giver mulighed for hurtig validering af en korrekt unormal underkonstruktion. Denne protokol vil være nyttig for strukturelle biologer, der løser makromolekylære strukturer ved hjælp af krystallografi-baserede teknikker med interesse i eksperimentel udfasning.

Introduction

Inden for strukturel biologi betragtes røntgenkrystallografi som guldstandardteknikken til bestemmelse af makromolekylers atomare opløsningsstrukturer. Det er blevet udnyttet i udstrakt grad at forstå det molekylære grundlag af sygdomme, guide rationelmedicin design projekter og belyse den katalytiske mekanisme af enzymer1,2. Selv om strukturelle data giver et væld af viden, processen med proteinudtryk og rensning, krystallisering og struktur bestemmelse kan være yderst besværligt. Der opstår ofte flere flaskehalse, som hindrer disse projekters fremskridt, og dette skal rettes for effektivt at strømline rørledningen til bestemmelse af krystalstrukturen.

Efter rekombinant udtryk og rensning, indledende betingelser, der er befordrende for krystallisering skal identificeres, som ofte er en vanskelig og tidskrævende aspekt af røntgenkrystallografi. Kommercielle sparsomme matrixskærme , der konsoliderer kendte og offentliggjorte betingelser , er blevet udviklet for at afhjælpe denneflaskehals 3,4. Men, Det er almindeligt at generere få hits fra disse indledende skærme på trods af at bruge meget ren og koncentreret protein prøver. Observation af klare dråber indikerer, at proteinet ikke kan nå de niveauer af overmætning, der kræves for at kerne en krystal. For at fremme krystalkernering og vækst kan frø fremstillet af allerede eksisterende krystaller tilsættes til betingelserne, og dette giver mulighed for øget prøveudtagning af krystalliseringsrummet. Ireton og Stoddard introducerede først mikroseed matrixscreeningsmetoden5. Krystaller af dårlig kvalitet blev knust for at lave en frøbestand og tilsættes derefter systematisk til krystalliseringsforhold, der indeholdt forskellige salte, for at generere nye krystaller af diffraktionskvalitet, som ellers ikke ville have dannet. Denne teknik blev yderligere forbedret af D'Arcy et al. der udviklede tilfældige mikroseed matrix screening (rMMS), hvor frø blev indført i en ekstra matrix krystallisering skærm6,7. Dette forbedrede kvaliteten af krystaller og øgede antallet af krystallisering hits i gennemsnit med en faktor på 7.

Efter krystaller er produceret med succes, og en X-ray diffraktion mønster er opnået, en anden flaskehals i form af at løse 'fase problem' er stødt på. Under dataindsamlingsprocessen registreres diffraktionsintensiteten (proportional med amplitudens kvadrat), men faseoplysningerne går tabt, hvilket giver anledning til det faseproblem, der standser bestemmelsen om øjeblikkeligstruktur 8. Hvis målproteinet deler høj sekvensidentitet med et protein med en tidligere bestemt struktur, kan molekylær udskiftning bruges til at anslåfaseinformationen 9,10,11,12. Selvom denne metode er hurtig og billig, er modelstrukturerne muligvis ikke tilgængelige eller egnede. Succesen med homologi model-baserede molekylære udskiftning metode falder betydeligt som sekvens identitet falder til under 35%13. I mangel af en passende homologi model, ab initio metoder, såsom ARCIMBOLDO14,15 og RIGELIG16, kan testes. Disse metoder bruger beregningsmæssigt forudsagte modeller eller fragmenter som udgangspunkt for molekylær udskiftning. RIGELIG, som bruger forudsagt lokkedue modeller som udgangspunkt, kæmper for at løse strukturer af store (> 100 rester) proteiner og proteiner, der indeholder overvejende β-ark. ARCIMBOLDO, som forsøger at montere små fragmenter til at udvide til en større struktur, er begrænset til data med høj opløsning (≤2 Å) og af algoritmernes evne til at udvide fragmenterne til en fuld struktur.

Hvis molekylær udskiftningsmetoder mislykkes, skal der anvendes direkte metoder som isomorf udskiftning17,18 og unormal spredning ved en enkelt bølgelængde (SAD19) eller flere bølgelængder (MAD20). Dette er ofte tilfældet for virkelig nye strukturer, hvor krystal skal dannes eller derivatized med en tung atom. Dette kan opnås ved iblødsætning eller co-krystalliserende med en tung atomforbindelse, kemisk modifikation (såsom 5-bromouracil inkorporering i RNA) eller mærket protein udtryk (såsom indarbejde selenomethionin eller selenocystein aminosyrer i den primære struktur)21,22. Dette komplicerer krystalliseringsprocessen yderligere og kræver yderligere screening og optimering.

En ny klasse af udfasning forbindelser, herunder I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syre) og B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic syre), tilbyder spændende fordele i forhold til allerede eksisterende udfasning forbindelser23,24,25. Både I3C og B3C har et aromatisk ringstillads med et vekslende arrangement af unormale scatters, der kræves til direkte udfasningsmetoder og amino- eller carboxylate funktionelle grupper, der interagerer specifikt med proteinet og giver bindende stedspec specificitet. Det efterfølgende ligesidede trekantede arrangement af tungmetalgrupper giver mulighed for en forenklet validering af den indfasningsmæssige underkonstruktion. I skrivende stund er der 26 I3C-bundne strukturer i Protein Data Bank (FBF), hvoraf 20 blev løst ved hjælp af SAD-udfasning26.

Denne protokol forbedrer effektiviteten af strukturen bestemmelse rørledningen ved at kombinere metoderne til tungmetal derivatization og rMMS screening til samtidig at øge antallet af krystallisering hits og forenkle krystal derivatisering proces. Vi viste denne metode var yderst effektiv med høne æggehvide lysozym og et domæne af en roman lysin protein fra bakteriofage P6827. Struktur løsning ved hjælp af den højt automatiserede Auto-Rickshaw struktur bestemmelse pipeline er beskrevet, specielt skræddersyet til I3C udfasning sammensatte. Der findes andre automatiserede rørledninger , der kan bruges , såsom AutoSol28, ELVES29 og CRANK230. Ikke-fuldautomatiske pakker som SHELXC/D/E kan også bruges31,32,33. Denne metode er især til gavn for forskere, der studerer proteiner mangler homologe modeller i FBF, ved at reducere antallet af screening og optimering trin. En forudsætning for denne metode er proteinkrystaller eller et krystallinsk bundfald af målproteinet, fremstillet af tidligere krystalliseringsforsøg.

Protocol

1. Eksperimentel planlægning og overvejelser

  1. Brug allerede eksisterende krystaller af protein af interesse, helst genereret gennem dampdiffusion krystallisering. For en generaliseret protokol for dampdiffusion krystallisering, se Benvenuti og Mangani34. Andre metoder til krystallisering såsom mikrobatch under olie og fri grænseflade diffusion vil kræve høst krystallerne før knusning til at generere mikroseeder.
  2. Ved udarbejdelsen af en frø bestand, bruge den højeste kvalitet krystaller, der kan ofres. Krystallen af højeste kvalitet kan bedømmes visuelt ud fra morfologi, eller den bedste diffractingkrystal kan vælges, hvis sådanne data er tilgængelige. Det er meget sandsynligt, at endnu bedre kvalitet krystaller opnås efter optimering gennem såning. I tilfælde, hvor der ikke findes krystaller, kan der anvendes krystallinsk bundfald såsom sfærer og nåle.
  3. Identificer saltkrystaller. Saltkrystaller kan vokse i krystalliseringsskærme og kan ligne proteinkrystaller. Brug af saltkrystaller i rMMS vil ikke give nogen fordel og vil spilde kostbar prøve, så det er vigtigt at fjerne salt falske positiver.
    1. Saltkrystaller er højt, når de knuses. Krystaller skal knuses for at generere en frøbestand, så denne strategi er særlig relevant. Hvis der høres en hørbar revnelyd, når krystallerne knuses, vil krystallen sandsynligvis være salt.
    2. Hvis proteinet indeholder tryptofan og tyrosinrester, skal du bruge ultraviolet fluorescensmikroskopi til at identificere proteinkrystaller, der fluorescerer under disse lysforhold.
    3. Brug Izit farvestof (methylenblåt) til at plette protein krystaller til at differentiere dem til salt krystaller, som forbliver relativt uindgroet. Men denne procedure er mere destruktiv og anbefales kun, hvis man har krystaller til overs fra replikater af samme dråbe.
      BEMÆRK: Selv om de førnævnte test kan give lovende resultater, kan saltkrystaller stadig forveksles med proteinkrystaller. I dette tilfælde kan diffraktionsforsøg bruges til definitivt at skelne mellem et protein og saltkrystal.

2. Forberedelse af lithium I3C lager

  1. 120 mg I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syre) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. I 200 μL lithiumhydroxid opløses i 200 μL lithiumhydroxid. Opløsningen kan opvarmes forsigtigt ved hjælp af en varmeblok ved 40-60 °C for at fremme opløsning. Den resulterende lithium I3C-opløsning skal være brun og har en koncentration på 1 M.
    FORSIGTIG: Lithiumhydroxid er ætsende. Sikkerhedsbriller, handsker og en laboratoriekittel skal bæres.
  3. Opløsningens pH-pH måles. Om nødvendigt tilsættes små mængder 1 M saltsyre eller 2 M lithiumhydroxid for at justere pH-koncentrationen til mellem 7 og 8. Tilsæt milliQ vand for at gøre den endelige opløsning volumen til 400 μL. Koncentrationen af I3C-lageropløsningen er 0,5 M.
    BEMÆRK: Trin 2.3 er valgfrit. Opløsningens pH-pH skal være mellem pH 7-8, før der foretages pH-justering. Dette trin bør udføres, hvis det protein af interesse er stærkt påvirket af pH. Protokollen kan sættes på pause her. Lithium I3C kan opbevares i mørke ved 4 °C i mindst to uger35.

3. Tilsætning af I3C til proteinlageret

  1. Metode 1
    1. Der tilsættes litium I3C til en 150 μL aliquot af målproteinet. Den endelige koncentration skal være mellem 5-40 mM lithium I3C.
  2. Metode 2 (mere skånsomme metode)
    1. Forbered en proteinfortyndingsbuffer, der matcher bufferen for målproteinet. Til denne fortynding buffer, tilføje lager lithium I3C at give en koncentration af lithium I3C mellem 10-80 mM.
    2. Proteinet fortyndes 1:1 med proteinfortyndingsbuffer for at give en endelig koncentration af lithium I3C mellem 5-40 mM.
      BEMÆRK: Nogle proteiner vil udfælde sig, når de kommer i kontakt med høje koncentrationer af lithium I3C i metode 1, mens andre proteiner kan tåle det. Metode 2 reducerer sandsynligheden for udfældning. Men denne metode halverer proteinkoncentrationen. For proteiner, der ikke har en etableret krystalliseringsprotokol, anbefales en proteinkoncentration på 10 mg/ml generelt til indledende krystalliseringsscreening. En indledende kindtand forhold mellem I3C til protein på 8 anbefales. Proteinkoncentration og kindtandforhold mellem I3C og protein kan optimeres efter den første skærm.

4. At gøre en frøbestand

  1. Lav en afrundet sonde til knusning af krystaller.
    1. Med en Bunsen brænder på den blå flamme, varme en Pasteur pipette mod midten. Brug en pincet, trække enden af Pasteur pipetten at trække det ud i en tynd diameter på mindre end 0,3 mm.
    2. Når midtersektionen er tynd nok, skal du holde segmentet i flammen for at adskille pipetten på dette punkt og rundt om enden af pipetten for at afslutte glassonden.
      BEMÆRK: Afrundede sonde krystal knusere sælges af tredjeparts leverandører. Disse er et alternativ til at lave afrundede sonder.
  2. Placer fem 1,5 ml mikrocentrifuge rør på is.
  3. Under et let mikroskop skal du undersøge krystalliseringsbakken for at få en passende tilstand til at generere mikrokrystaller. Ideelt set er god morfologi store krystaller valgt. Men denne teknik virker også med dårlig morfologi krystaller, nåle, plader, mikrokrystaller og sfærer.
  4. Åbn krystalliseringsbakken godt. For 96 godt krystallisering bakker forseglet med plast, skal du bruge en skalpel til at skære plast forsegling brønden. Til hængende dråbebakker forseglet med fedt kan dækslæbet fjernes med en pincet og vendes mod en jævn overflade.
  5. Reservoiropløsningen overføres til et mikrocentrifugerør, og detkuler det på is. Til de andre mikrocentrifugerør tilsættes 90 μL reservoiropløsning og tilbage til isen for at køle.
    BEMÆRK: Hvis beholderen ikke har nok volumen eller ikke findes (i tilfælde af mikrobatch under olie), skal der oprettes krystalliseringsbeholder ved at blande de relevante reagenser.
  6. Ryst krystallen i dråben ved hjælp af krystalsonden for grundigt at knuse den. Krystallen skal knuses fuldstændigt, hvilket kan overvåges under mikroskopet.
  7. Fjern al væsken fra dråben og overfør den til mikrocentrifugerøret med reservoiropløsningen. Bland og derefter tage 2 μL af blandingen fra mikrocentrifuge røret og tilsæt det tilbage til brønden. Skyl brønden med opløsningen og overfør den til mikrocentrifugerøret. Gentag dette skylletrin igen. Fra dette punkt skal mikrocentrifugerøret være koldt for at undgå at smelte mikrorørene i blandingen.
  8. Vortex røret ved maksimal hastighed ved 4 °C i 3 min. og stopper regelmæssigt for at køle røret på is for at undgå overophedning.
    BEMÆRK: Nogle mikroseedingsprotokoller tilføjer en polytetrafluorethylenfrøperle til mikrocentrifugerøret for at hjælpe krystalknusering7,36. Vi har anvendt teknikken uden brug af en frøperle med succes, men ser ingen problemer med at udnytte en frøperle til at knuse krystaller.
  9. Der foretages en 1 ud af 10 seriel fortynding af frøbestanden ved sekventielt at overføre 10 μL mellem de kølede reservoiropløsninger.
  10. Opbevar frølagre, der ikke umiddelbart anvendes ved -80 °C.

5. Opsætning af en rMMS-skærm

  1. Opsætning af en 96 brøndscreeningsplade ved hjælp af en flydende dispenserrobot. I mangel af en robot kan der også anvendes en multikanalpipette.
    1. Overfør 75 μL fra en dyb brøndblok til en 96 brøndkrysstiseringsbakke. Der tilsættes 1 μL til krystalliseringsdråben og 74 μL til beholderen.
    2. Overfør 1 μL protein suppleret med lithium I3C, fremstillet i trin 2, til krystalliseringsfaldet.
    3. Overfør 0,1 μL frøbestand til krystalliseringsfaldet.
    4. Forsegl pladen med klar tætningstape og inkuber pladen ved en konstant temperatur for at tillade krystalvækst.
  2. Opsætning af hængende rulleskærme
    1. Smør kanterne af de hængende dråbe brønde (hængende dråbe krystallisering bakker kan findes i 24 og 48 brøndformater).
    2. 500 μL krystalliseringsopløsning overføres til reservoiret.
    3. Nær midten af et glasdæksel dias, placere en 1 μL dråbe protein suppleret med lithium I3C, lavet i trin 2.
    4. Der tilsættes 1 μL krystalliseringsopløsning til dråben.
    5. Overfør 0,1 μL frøbestand til krystalliseringsfaldet.
    6. Inverter dækslet, og luk krystalliseringen godt ved at skubbe dækslet ind i fedtet.
    7. Inkuber pladen ved en konstant temperatur for at tillade krystalvækst.
      BEMÆRK: Med nye og uprøvede frø bestande, anbefales det at bruge de mest koncentrerede frø bestand for at maksimere chancerne for at få krystallisering hits. Efterfølgende betingelser kan sættes op med reduceret frøkoncentration for at optimere antallet af krystaller.
  3. Undersøg krystalbakker under et mikroskop regelmæssigt for krystalvækst. Hvis krystaller er af tilstrækkelig kvalitet, kan de høstes til dataindsamling. Krystaller kan også bruges til at generere nye frø lagre og nye rMMS skærme for at give mulighed for iterativ optimering.

6. Dataindsamling

  1. Høst krystaller ved hjælp af kryofjerne, kryobeskytte krystallerne og flash afkøle dem i flydende nitrogen. For yderligere oplysninger om flash køling krystaller, henvises til Teng37 og Garman og Mitchell38.
    1. Under kryobeskyttelsesfasen, hvis krystallen passerer gennem en ny vandig opløsning, kan I3C gå tabt fra krystallen på grund af den leeching ind i kryobeskyttelsesopløsningen. Brug lithium I3C i kryobeskyttelsesopløsningen i en koncentration, der matcher krystalliseringstilstanden for at afbøde dette.
    2. Krystaller dyrket ved hjælp af denne protokol er med succes blevet kryobeskyttet ved hjælp af Parabar 10312 oliebaseret kryobeskyttelsesmiddel (Hampton Research).
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, mens krystaller opbevares i flydende nitrogen.
      FORSIGTIG: Flydende nitrogen kan forårsage kolde forbrændinger. Flydende nitrogen kan også forårsage kvælning, hvis det anvendes i lukkede rum.
  2. Monter krystallen på røntgenkilden goniometer og indsamle diffraktion data ved hjælp af protokollen er specifikke for x-ray kilde.
  3. Denne teknik er afhængig af unormal signal fra jodatomer i I3C. Vælg således x-ray's energi for at maksimere dette signal.
    1. Indstil synkrotron røntgenkilder med tunable energier så lavt som muligt. For mange makromolekylære krystallografi bjælkelinjer, den laveste konfigurerbare energi er 8000 til 8500 eV.
    2. Roterende anode røntgenkilder kan ikke indstilles. Almindeligt anvendte anodekilder med kobber har Kα-kanten ved 8046 eV, hvilket giver et godt unormalt signal for jod (f" = 6,9 e). Anodekilder med krom har en Kα-kant ved 5415 eV, hvilket giver et stort unormalt signal for jod (f" = 12,6 e).
  4. Strålingsskader er et betydeligt problem under dataindsamlingen, da det vil forringe det unormale signal39. Vælg eksponeringstiden og dæmpningen af strålen for at opnå den bedste diffraktion, samtidig med at strålingsdosis minimeres.
    BEMÆRK: I en lignende udfasningsblanding med jodatomer erstattet med bromatomer har strålingsskader vist sig at forårsage radiolyse af carbon brombindingen og en reduktion i bromatomernesbelægning 24.
    1. Brug omvendt stråle SAD dataindsamling som en indsamling strategi. Dataene indsamles i kiler, med modsatte kiler indsamlet efter hinanden. Dette gør det muligt friedel par, der skal indsamles med en tilsvarende dosis, hvilket resulterer i en forbedret måling af unormale signal mindre påvirket af strålingsskader. F.eks. en otte kile strategi for at indsamle 360 ° ville indebære indsamling af data i den rækkefølge, kile 1 (0 ° -45 °), kile 2 (180 ° -225 °), kile 3 (46 ° -90 °), kile 4 (225° -270°), kile 5 (90°-135°), kile 6 (270°-315°), kile 7 (135°-180°) og kile 8 (315°-360°).
      BEMÆRK: Kontinuerlig rotation er en alternativ indsamlingsstrategi end den omvendte stråle dataindsamling. For en nylig sammenligning af indsamling strategier, se Garcie-Bonte & Katona40.

7. Databehandling og strukturløsning

  1. Udfør datareduktion på diffraktionsdata ved hjælp af XDS41med det formål at maksimere det unormale signal. Datareduktionsinputparametre er specifikke for datasættet og kan kræve nogle trial and error. Her er nogle anbefalinger til at starte.
    1. Indstil FRIEDEL's LAW=FALSE. Udfør KORREKT to gange, STRICT_ABSORPTION_CORRECT = SAND STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSK. Det ene løb kan have et højere etmalersignal end det andet. Sammenlign de unormale signaler mellem kørslerne ved hjælp af disciplinerne 'Anomal Corr' og 'SigAno' i outputtet. Dette giver en indikator for datakvaliteten.
    2. Kør SHELXC på XDS_ASCII. HKL-fil for en mere præcis indikation af et unormalt signal. Ranom-disciplinen vil give et fingerpeg om det unormale signal ved forskellige beslutninger.
  2. Kør MENINGSLØS42 og AIMLESS43 for at skalere dataene. I AIMLESS skal du indstille parameteren ANOMALOUS TIL. Hvis GUI'en bruges, skal du vælge indstillingen Adskaf unormale par for afvigende afvisning og fletning af statistik. Det kan være nødvendigt at teste forskellige opløsningsafskæringer for at maksimere et unormalt signal.
  3. Løs proteinstrukturen ved hjælp af Auto-Rickshaw automatiseret krystalstruktur bestemmelse pipeline44. Auto-Rickshaw vil forsøge at løse fase problemet og opbygge krystal struktur af proteinet automatisk med protein modellering og raffinement software.
    1. For proteiner uden en homologi model skabelon, køre SAD protokol Auto-Rickshaw i Avanceret tilstand. Angiv de nødvendige parametre.
      1. Vælg PROTEIN som molekyletype.
      2. Indtast dataindsamlingsbølgelængden i angstroms (Å).
      3. Vælg "I" som understrukturelement for at angive, at jodatomer blev brugt.
      4. Vælg "i3c" som understrukturtype for at angive, at I3C var udfasningsmolekylet.
      5. Vælg "sub_direct" som metoden til bestemmelse af understrukturen. Denne metode anvender SHELXD32 til at søge efter understrukturen.
      6. Vælg "3" som antallet af forventede understrukturer pr. monomer.
      7. Indtast "1" som opløsningsafskæring af understruktursøgning. Dette gør det muligt for Auto-Rickshaw automatisk at bestemme en passende opløsning cutoff.
      8. Angiv antallet af rester i en enkelt monomer, mellemrumsgruppe i datasættet og antallet af molekyler i den asymmetriske enhed baseret på Matthews-koefficienten.
      9. Vælg det relevante formidlingsniveau for røntgendata, der passer til behovene. Hvis du vælger "AutoRickshaw-udviklere", kan auto-Rickshaw-udviklere foretage fejlfinding af kørslen, hvis der opstår problemer.
      10. Indtast de unormale data som en mtz-fil.
      11. Input protein sekvens som en seq, pir eller txt fil. En seq-fil kan genereres i en teksteditor (f.eks. Opret en ny fil, skal du indtaste den primære sekvens af proteinet som en lang linje eller adskilt af linjeskift. Gem filen med filtypenavnet .seq.
      12. Angiv en institutionel e-mailadresse.
  4. Resultaterne leveres via et weblink, der sendes til den angivne e-mailadresse.
    BEMÆRK: AutoRickshaw er en automatiseretrørledning,der påberåber sig forskellige krystallografi softwarepakker til at løse en X-ray krystalstruktur 32,33,45,46, 47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Hvis Auto-Rickshaw køre undlader at løse strukturen, andre Auto-Rickshaw indstillinger kan testes. Strukturbestemmelsesmetoden kan ændres til "sub_phassade" for at bruge Phaser59 i stedet for SHELXD32. Antallet af forventede understrukturer pr. monomer kan også øges eller reduceres.
  5. Under den eksperimentelle udfasning af krystalstrukturen vil Auto-Rickshaw forsøge at placere tunge atomer i enhedscellen, hvilket skaber en underkonstruktion. Den ligesidede trekant arrangement af jodatomer i I3C præsenterer en effektiv måde at validere understrukturen. Hvis trin 6.3 mislykkes, kan validering af understrukturen hjælpe med fejlfindingsstrukturløsningen.
    1. Download listen over tunge atom sites fra Auto-Rickshaw resultater side. Det er et hyperlink kaldet "tunge atom sites". Dette vil hente en tekstfil med de tunge atom sites.
    2. Skift filtypenavnet for filen fra .txt til .pdb.
    3. Åbn PDB-filen i Coot60. Tænd symmetri for at se andre tunge atomer fra tilstødende asymmetriske enheder.
    4. Mål afstandene mellem de tunge atomer, herunder på tværs af asymmetriske enheder. I3C vises som en ligesidet trekant med en sidelængde på 6 angstroms. Tilstedeværelsen af en trekant med disse dimensioner angiver placeringen af disse tunge atomer er korrekte.

Representative Results

Indarbejde I3C i rMMS kan generere nye betingelser, der understøtter derivatized krystal vækst
Effekten af samtidig rMMS screening og I3C-derivatisering blev påvist i to proteiner, æggehvide lysozyme (HEWL, fremstillet som et frysetørret pulver) og det formodede Orf11 lysin N-terminal domæne (Orf11 NTD) fra bakteriofage P68. Hvert protein blev screenet mod PEG/ION HT under fire forskellige betingelser, herunder: unseeded, seedet, unseeded med I3C og seedet med I3C (Figur 1). For begge proteiners vedkommende øgede den eneste tilsætning af I3C ikke antallet af betingelser, der var befordrende for krystallisering. For Orf11 NTD's tilfælde blev der kun identificeret én egnet betingelse med og uden I3C (Figur 1B). Da I3C blev føjet til HEWL-skærmene, blev antallet af hits reduceret fra 31 til 26, hvilket fremhævede krystalliseringens ekstra kompleksitet ved indførelse af udfasningsforbindelser (figur 1A). I overensstemmelse med andre undersøgelser, tilføje frø til kommercielle sparsomme matrix skærme til at generere en rMMS skærm betydeligt øget antallet af mulige krystallisering betingelser for begge proteiner, hvilket resulterer i en 2,1 og 6 gange stigning for HEWL og Orf11 NTD,henholdsvis 6,61 ( Figur1). Vigtigst er det, samtidig tilføjelse af I3C og frø øget antallet af hits i forhold til en unseeded skærm, viser en 2,3 og 7 gange stigning for HEWL og Orf11 NTD, henholdsvis. Mange af krystallerne fra rMMS i nærvær af I3C viser fremragende krystalmorfologi (Figur 2).

Såning giver mulighed for omhyggelig kontrol af krystal nummer i I3C rMMS skærme
I mikrofrøforsøg kan antallet af frø, der indføres i et krystalliseringsforsøg, kontrolleres ved fortynding af frøbestanden, og dette giver mulighed for præcis kontrol af nucleation idråben 7,36. Dette giver ofte større krystaller til at danne, da der er reduceret konkurrence af protein molekyler på nucleation steder. Denne fordel omfatter også I3C-rMMS-metoden og er blevet påvist med succes i både HEWL og Orf11 NTD. Rekreation af en krystalliseringstilstand, der er identificeret fra I3C-rMMS-skærmen med en fortyndet frøbestand, gav færre, men større krystaller (Figur 3).

SAD-udfasning kan bruges til at løse strukturerne fra krystaller, der stammer fra rMMS I3C-skærm
Krystaller, der dyrkes ved hjælp af den fortyndede frøbestand, der er vist i figur 3, blev anvendt til at løse proteinernes struktur ved hjælp af SAD-udfasning ved hjælp af diffraktionsdata fra en enkelt krystal (Figur 4). Der blev indsamlet data på den australske Synchrotron MX1-strålelinje62. Detaljerede oplysninger om dataindsamling og strukturløsning beskrivesandetsteds 27.

Figure 1
Figur 1 - rMMS blev brugt til at skabe nye betingelser for krystalvækst ved tilstedeværelse af I3C for to testproteiner. 96 godt damp diffusion krystallisering skærme blev udført ved hjælp af kommercielle sparsomme matrix skærme. (A) Høne æggehvide lysozym blev testet med Index HT skærmen. Bakkerne var seedet med HEWL krystaller dyrket i 0,2 M ammonium tartrat dibasic pH 7,0, 20% (w / v) polyethylenglycol 3350. (B) Orf11 NTD fra bakteriofage P68 blev testet med PEG/ION-skærmen. Orf11 NTD bakker var seedet fra krystaller fra betingelse G12 fra unseeded skærmen, vist med blåt. Betingelser, der understøtter krystalvækst, vises med rødt. rMMS såning i nærvær og fravær af I3C både gav betydeligt mere krystal hits end unseeded bakker. Figur tilpasset fra Truong et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 - Repræsentative billeder af krystaller, der er dyrket fra de dampdiffusionsforsøg, der er vist i figur 1, litra a) og b). Figur tilpasset fra Truong et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 - Fortynding af frøbestanden er en effektiv måde at reducere nukleation i en krystallisering tilstand findes ved hjælp af I3C-rMMS metode, at kontrollere antallet af krystaller, der danner. Reduktion af nucleation i et fald ofte resulterer i krystaller vokser til større dimensioner. Figur tilpasset fra Truong et al.27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) og HEWL (PDB ID 6PBB) blev krystalliseret ved hjælp af I3C-rMMS-metoden og løst ved hjælp af Auto-Rickshaw SAD-udfasning. a) Båndkonstruktioner af HEWL og Orf11 NTD løst ved eksperimentel udfasning. b) I3C-molekyle bundet til HEWL og Orf11 NTD. c) Unormale jodatomer i I3C er anbragt i en ligesidet trekant på 6 Å. Tilstedeværelsen af denne trekant i den udfasningsunderstruktur indikerer således, at der er et I3C-molekyle i denne position. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Strukturbestemmelse af et nyt protein i mangel af en egnet homologimodel til molekylær udskiftning kræver eksperimentel udfasning. Disse metoder kræver inkorporering af tunge atomer i proteinkrystallen, hvilket tilføjer en grad af kompleksitet til konstruktionsbestemmelsesrørledningen og kan indføre mange forhindringer, der skal løses. Tunge atomer kan inkorporeres direkte i proteinet ved hjælp af mærket udtryk ved hjælp af selenomethionin og selenocystein. Da denne metode er dyr, besværlig og kan resultere i lavere proteinudbytter, udtrykkes mærket protein ofte efter krystalliseringsbetingelser er blevet fundet og optimeret med umærket protein. Alternativt kan krystaller afaktiveres ved iblødsætning i en opløsning, der indeholder tunge atomer22,63,64. Denne metode bruger ofte krystaller af høj kvalitet og udføres derfor efter en robust krystalliseringsmetode er allerede udviklet. Held opnå en derivatized krystal ved hjælp af denne metode kræver yderligere optimering af iblødsætning procedurer og screening af forskellige udfasning forbindelser, derfor tilføje mere tid til en allerede besværlig proces.

Co-krystallisering af proteinet med det tunge atom kan udføres på screeningsstadiet, hvilket effektivt strømliner processen og reducerer krystalmanipulationstrin, der kan forårsage skade. Men der stadig eksisterer det potentielle scenario for at opnå nogle indledende krystallisering hits og problemet med at vælge en kompatibel tung atomforbindelse. Mange i øjeblikket tilgængelige udfasning forbindelser er uforenelige med udfældende stoffer, buffere og tilsætningsstoffer, der almindeligvis findes i krystallisering betingelser. De kan være uopløselige i sulfat- og fosfatbuffer, chelat til citrat og acetat, reagere negativt med HEPES- og Tris-buffere eller blive afsondret af DTT og β-mercaptoethanol21. Da I3C udfasning sammensatte ikke lider af disse uoverensstemmelser, Det er en robust udfasning sammensatte, der kunne være modtagelige for mange forskellige betingelser.

I denne undersøgelse præsenteres en strømlinet metode til fremstilling af derivatiserede krystaller, der er klar til SAD-udfasning gennem samtidig co-krystallisering af I3C-udfasningsstoffet og rMMS. Kombinationen af begge teknikker øger antallet af krystallisering hits, med mange af de betingelser, der har forbedret morfologi og diffraktion egenskaber. I både Orf11 NTD- og HEWL-testtilfælde blev der identificeret nye forhold på I3C-rMMS-skærmen, som ikke var til stede, da I3C ikke var til stede. Potentielt kan I3C binde sig positivt til proteinet, hvilket letter dannelsen og stabiliseringen af krystalkontakter27. Til gengæld kan dette fremkalde krystallisering og muligvis forbedre diffraktion egenskaber. Udover at være en forbindelse kompatibel med sparsomme matrix skærme, I3C er også en attraktiv udfasning sammensatte på grund af dens iboende egenskaber. De funktionelle grupper, der veksler med jod på det aromatiske ringstillads, tillader specifik binding til proteiner. Dette fører til større belægning og reducerer potentielt baggrundssignal23. Desuden er placeringen af unormale spredere i en ligesidet trekant indlysende i understrukturen og kan bruges til hurtigt at validere binding af I3C (Figur 4B og 4C). Endelig kan det producere en unormal signal med tunable synkrotron stråling samt krom og kobber roterende anode røntgenkilder. Det kan således anvendes på mange forskellige arbejdsgange. Da I3C er bredt tilgængelige og billigt at købe, er denne fremgangsmåde inden for rækkevidde for de fleste strukturelle biologilaboratorier.

Der er flere eksperimentelle overvejelser, der skal behandles, når du bruger I3C-rMMS-metoden. Denne metode kan ikke anvendes, hvis der ikke kan opnås det første krystallinske materiale af proteinet. I vanskelige tilfælde kan krystallinsk materiale fra et homologt protein også bruges til at generere frøbestand. Denne krydssåningstilgang til rMMS har vist nogle lovende resultater7. Optimering krystal nummer gennem fortynding af frø bestanden er et afgørende skridt, som ikke bør overses, for at maksimere chancen for at producere høj kvalitet store krystaller og erhverve passende diffraktion data. Hvis der kun er identificeret få I3C-steder i den asymmetriske enhed, bør de betingelser, der fremmer krystallisering, optimeres yderligere med en øget koncentration af I3C. Dette kan øge belægningen af I3C for at maksimere det unormale signal og støtte krystal derivatization.

Der kan være tilfælde, hvor denne teknik ikke kan være den optimale metode til at derivatize protein krystaller. Efterhånden som størrelsen af et protein- eller proteinkompleks stiger, giver det begrænsede antal I3C-steder på proteinoverfladen muligvis ikke tilstrækkelig udfasningskraft til at løse strukturen. I disse scenarier, hvor proteinstørrelse mistænkes for at hindre udfasning, kan selenomethioninmærkning af proteinet være en mere holdbar tilgang til udfasning af proteinet. Hvis proteinet har et tilstrækkeligt antal methioninrester i proteinet (anbefales at have mindst én methionin pr. 100restkoncentrationer 65), og der kan opnås højeffektiv selenomethioninindblanding i et protein (f.eks. i bakterielle ekspressionssystemer66), vil der være flere højindstykningssuktomer til stede i krystallerne for at fase strukturen.

Desuden kan nogle proteiner i sagens natur være uegnet til derivatisering med I3C. I3C-bindingssteder for proteiner er afhængige af proteinstruktur. Der kan findes proteiner, der naturligt har få eksponerede plastre, der er kompatible med I3C-binding. Det er således ikke uforudsigeligt, at der kan være problemer med at co-krystallisere nogle målproteiner med I3C.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev foretaget på MX1 beamline på den australske Synchrotron, en del af ANSTO. Forfatterne vil gerne anerkende medlemmer af Shearwin og Bruning laboratorier for drøftelser om dette arbejde. Forfatterne vil også gerne anerkende Dr. Santosh Panjikar og Dr. Linda Whyatt-Shearwin, der bidrog til det oprindelige arbejde, der banebrydende denne protokol.

Følgende finansiering er anerkendt: Australian Research Council (tilskud nr. DP150103009 og DP160101450 til Keith E. Shearwin); University of Adelaide (australian government research training program stipendium til Jia Quyen Truong og Stephanie Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL disposable luer lock syringes Adelab Scientific T3SS10LAT Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells
24 well tissue culture plate Sigma Aldrich CLS3527 Used for hanging drop crystal tray
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506 For 96 well crystallization screens set up by robot
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid Alfa Aesar B22178 Commonly referred to as I3C in the article
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original Hampton Research HR3-297 For 96 well crystallization screens set up by robot
Coverslips  Thermo Fisher Scientific 18X18-2 Coverslips for hanging drop crystal tray wells
Dow Corning vacuum grease Hampton Research HR3-510 Used for sealing hanging drop crystal tray wells
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL Eppendorf 3120000011
Gilson Pipette 2 μL-20 μL John Morris Group 1153247
Gilson Pipette 20 μL-200 μL John Morris Group 1152006
Glass pasteur pipettes Adelab Scientific HIR92601.01
Hen Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Approximately 95% pure
IndexHT screen Hampton Research HR2-134
Microscope illuminator Meiji Techno FT192/230 Light source to illuminate crystallography experiments
PEG/ION HT screen Hampton Research HR2-139
Phoenix Liquid Dispenser Art Robbins Instruments 602-0001-10
Scalpel with scalpel blade no. 15 Adelab Scientific LV-SMSCPO15
Seed bead kit Hampton Research HR2-320 Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.
Stereo microscope  Meiji Techno EMZ-5TR Microscope for visualising crystallography experiments
Tweezers Sigma-Aldrich T5415
Vortex mixer Adelab Scientific RAVM1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zheng, H., Hou, J., Zimmerman, M. D., Wlodawer, A., Minor, W. The future of crystallography in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (2), 125-137 (2014).
  2. Oakley, A. J., Wilce, M. C. J. Macromolecular crystallography as a tool for investigating drug, enzyme and receptor interactions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 27 (3), 145-151 (2000).
  3. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling. A screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24, pt 4 409-411 (1991).
  4. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- To medium-sized academic laboratories: The PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1426-1431 (2005).
  5. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  6. D'Arcy, A., Villard, F., Marsh, M. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (4), 550-554 (2007).
  7. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  8. Taylor, G. The phase problem. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (11), 1881-1890 (2003).
  9. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A. 46 (2), 73-82 (1990).
  10. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  11. Millán, C., Jiménez, E., Schuster, A., Diederichs, K., Usón, I. ALIXE: a phase-combination tool for fragment-based molecular replacement. Acta Crystallographica Section D. 76 (3), 209-220 (2020).
  12. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: Recent developments in Phenix. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  13. Abergel, C. Molecular replacement: Tricks and treats. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (11), 2167-2173 (2013).
  14. Pröpper, K., et al. Structure solution of DNA-binding proteins and complexes with ARCIMBOLDO libraries. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (6), 1743-1757 (2014).
  15. Rodríguez, D. D., et al. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature Methods. 6 (9), 651-653 (2009).
  16. Bibby, J., Keegan, R. M., Mayans, O., Winn, M. D., Rigden, D. J. AMPLE: A cluster-and-truncate approach to solve the crystal structures of small proteins using rapidly computed ab initio models. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (12), 1622-1631 (2012).
  17. Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287-307 (1954).
  18. Blow, D. M., Rossmann, M. G. The single isomorphous replacement method. Acta Crystallographica. 14 (11), 1195-1202 (1961).
  19. Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 115, 90-112 (1985).
  20. Hendrickson, W. A. Determination of macromolecular structures from anomalous diffraction of synchrotron radiation. Science. 254 (5028), 51-58 (1991).
  21. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
  22. Dauter, Z., Dauter, M., Rajashankar, K. R. Novel approach to phasing proteins: Derivatization by short cryo-soaking with halides. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (2), 232-237 (2000).
  23. Beck, T., Krasauskas, A., Gruene, T., Sheldrick, G. M. A magic triangle for experimental phasing of macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (11), 1179-1182 (2008).
  24. Beck, T., Gruene, T., Sheldrick, G. M. The magic triangle goes MAD: Experimental phasing with a bromine derivative. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 374-380 (2010).
  25. Beck, T., Da Cunha, C. E., Sheldrick, G. M. How to get the magic triangle and the MAD triangle into your protein crystal. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (10), 1068-1070 (2009).
  26. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. , (2000).
  27. Truong, J. Q., Panjikar, S., Shearwin-Whyatt, L., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Combining random microseed matrix screening and the magic triangle for the efficient structure solution of a potential lysin from bacteriophage P68. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (7), 670-681 (2019).
  28. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: The PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 582-601 (2009).
  29. Holton, J., Alber, T. Automated protein crystal structure determination using ELVES. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (6), 1537-1542 (2004).
  30. Skubák, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4, (2013).
  31. Sheldrick, G. M. Crystal structure refinement with SHELXL. Acta Crystallographica Section C: Structural Chemistry. 71, 3-8 (2015).
  32. Schneider, T. R., Sheldrick, G. M. Substructure solution with SHELXD. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1772-1779 (2002).
  33. Sheldrick, G. M. Macromolecular phasing with SHELXE. Zeitschrift fur Kristallographie. 217 (12), 644-650 (2002).
  34. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature Protocols. , (2007).
  35. Beck, T. Sticky triangles New tools for experimental phasing of biological macromolecules. , (2010).
  36. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  37. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29, 584-587 (1996).
  39. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  40. Garcia-Bonete, M. J., Katona, G. Bayesian machine learning improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 75, 851-860 (2019).
  41. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  44. Panjikar, S., Parthasarathy, V., Lamzin, V. S., Weiss, M. S., Tucker, P. A. Auto-Rickshaw: An automated crystal structure determination platform as an efficient tool for the validation of an X-ray diffraction experiment. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (4), 449-457 (2005).
  45. Jones, T. A., Thirup, S. Using known substructures in protein model building and crystallography. The EMBO journal. 5 (4), 819-822 (1986).
  46. Kleywegt, G. J., Jones, T. A. Template convolution to enhance or detect structural features in macromolecular electron-density maps. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (2), 179-185 (1997).
  47. Perrakis, A., Morris, R., Lamzin, V. S. Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nature Structural Biology. 6 (5), 458-463 (1999).
  48. Morris, R. J., et al. Breaking good resolutions with ARP/wARP. Journal of Synchrotron Radiation. 11 (1), 56-59 (2004).
  49. Yao, D. Q., et al. SAD phasing by OASIS-2004: Case studies of dual-space fragment extension. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 883-890 (2006).
  50. Hao, Q. ABS: A program to determine absolute configuration and evaluate anomalous scatterer substructure. Journal of Applied Crystallography. 37 (3), 498-499 (2004).
  51. Collaborative Computational Project Number 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  52. Sheldrick, G. M., Hauptman, H. A., Weeks, C. M., Miller, R., Usón, I. Ab initio phasing. International Tables for Crystallography. , 333-345 (2006).
  53. Smith, G. D. Matching selenium-atom peak positions with a different hand or origin. Journal of Applied Crystallography. 35 (3), 368-370 (2002).
  54. Pannu, N. S., McCoy, A. J., Read, R. J. Application of the complex multivariate normal distribution to crystallographic methods with insights into multiple isomorphous replacement phasing. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (10), 1801-1808 (2003).
  55. Pannu, N. S., Read, R. J. The application of multivariate statistical techniques improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (1), 22-27 (2004).
  56. De La Fortelle, E., Bricogne, G. Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods in Enzymology. 276, 472-494 (1997).
  57. Cowtan, K. Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein. Crystallography. 31, 34-38 (1994).
  58. Terwilliger, T. C. Maximum-likelihood density modification. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (8), 965-972 (2000).
  59. Read, R. J., McCoy, A. J. Maximum-likelihood determination of anomalous substructures. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2018).
  60. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  61. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. Journal of visualized experiments JoVE. (78), e50548 (2013).
  62. McPhillips, T. M., et al. Blu-Ice and the distributed control system: Software for data acquisition and instrument control at macromolecular crystallography beamlines. Journal of Synchrotron Radiation. 9 (6), 401-406 (2002).
  63. Nagem, R. A. P., Polikarpov, I., Dauter, Z. Phasing on Rapidly Soaked Ions. Methods in Enzymology. 374, 120-137 (2003).
  64. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  65. Hendrickson, W. A., Ogata, C. M. Phase determination from multiwavelength anomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology. 276, 494-523 (1997).
  66. Doublié, S. Production of Selenomethionyl Proteins in Prokaryotic and Eukaryotic Expression Systems. Macromolecular Crystallography Protocols. Methods in Molecular Biology. , 91-108 (2007).

Tags

Biokemi såning tilfældig mikroseed matrix screening rMMS protein krystallografi udfasning den magiske trekant I3C
Derivatization af Protein Krystaller med I3C ved hjælp af Random Microseed Matrix Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning,… More

Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (167), e61894, doi:10.3791/61894 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter