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Biochemistry

रैंडम माइक्रोसीेड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग का उपयोग करके I3C के साथ प्रोटीन क्रिस्टल का व्युत्पन्न

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61894
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1
1School of Biological Sciences, The University of Adelaide, 2Institute of Photonics and Advanced Sensing (IPAS), School of Biological Sciences, The University of Adelaide
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख विरल मैट्रिक्स स्क्रीन में नई क्रिस्टलीकरण की स्थिति उत्पन्न करने के लिए माइक्रोसीडिंग का उपयोग करके I3C (5-अमीनो-2, 4,6-ट्राइओडोडिसोफैथैलिक एसिड) के साथ प्राप्त प्रोटीन क्रिस्टल उत्पन्न करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। ट्रे तरल वितरण रोबोट या हाथ से उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है।

Abstract

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग करके प्रोटीन संरचना स्पष्ट करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले विवर्तन क्रिस्टल और विवर्तन चरण समस्या के कम्प्यूटेशनल समाधान दोनों की आवश्यकता होती है। उपन्यास संरचनाओं जिनमें उपयुक्त होमोलॉजी मॉडल की कमी होती है, अक्सर प्रायोगिक चरण की जानकारी प्रदान करने के लिए भारी परमाणुओं के साथ प्राप्त होते हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल कुशलता से एक भारी परमाणु अणु I3C (5-अमीनो-2,4,6-triiodoisophthalic एसिड) के साथ व्युत्पन्न के साथ यादृच्छिक माइक्रोसीडिंग मैट्रिक्स स्क्रीनिंग के संयोजन से प्राप्त प्रोटीन क्रिस्टल उत्पन्न करता है। क्रिस्टल जाली में I3C को शामिल करके, विवर्तन चरण समस्या को एकल तरंगदैर्ध्य असंगत फैलाव (एसएडी) चरणबद्ध का उपयोग करके कुशलतापूर्वक हल किया जा सकता है। I3C में आयोडीन परमाणुओं की समभुज त्रिकोण व्यवस्था एक सही विसंगतिकीय उपसंरचना के तेजी से सत्यापन के लिए अनुमति देता है । यह प्रोटोकॉल संरचनात्मक जीवविज्ञानियों के लिए उपयोगी होगा जो प्रायोगिक चरणबद्ध में रुचि के साथ क्रिस्टलोग्राफी-आधारित तकनीकों का उपयोग करके मैक्रोमॉलिकुलर संरचनाओं को हल करते हैं।

Introduction

संरचनात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी को मैक्रोमॉलिक्यूल्स की परमाणु-संकल्प संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए स्वर्ण मानक तकनीक माना जाता है। इसका उपयोग रोगों के आणविक आधार को समझने, तर्कसंगत दवा डिजाइन परियोजनाओं का मार्गदर्शन करने और एंजाइमों1,2के उत्प्रेरक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। हालांकि संरचनात्मक डेटा ज्ञान का खजाना प्रदान करता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण, क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण की प्रक्रिया बेहद श्रमसाध्य हो सकती है। कई बाधाओं को आमतौर पर सामना करना पड़ता है कि इन परियोजनाओं की प्रगति में बाधा और यह कुशलता से क्रिस्टल संरचना निर्धारण पाइपलाइन को कारगर बनाने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए ।

पुनः संयोजन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के बाद, क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूल प्रारंभिक स्थितियों की पहचान की जानी चाहिए जो अक्सर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का एक दुरूह और समय लेने वाला पहलू होता है। इसअड़चनको कम करने के लिए ज्ञात और प्रकाशित स्थितियों को समेकित करने वाले वाणिज्यिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन विकसित किए गएहैं। हालांकि, अत्यधिक शुद्ध और केंद्रित प्रोटीन नमूनों का उपयोग करने के बावजूद इन प्रारंभिक स्क्रीन से कुछ हिट उत्पन्न करना आम बात है। स्पष्ट बूंदों को देखना इंगित करता है कि प्रोटीन क्रिस्टल को नाभिित करने के लिए आवश्यक अधिसंखन के स्तर तक नहीं पहुंच सकता है। क्रिस्टल नाभिक और विकास को प्रोत्साहित करने के लिए, पहले से मौजूद क्रिस्टल से उत्पादित बीजों को शर्तों में जोड़ा जा सकता है और यह क्रिस्टलीकरण अंतरिक्ष के बढ़ते नमूने के लिए अनुमति देता है। इरेटन और स्टोडार्ड ने सबसे पहले माइक्रोसीड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग विधि5पेश की । खराब गुणवत्ता वाले क्रिस्टल को बीज स्टॉक बनाने के लिए कुचल दिया गया था और फिर नए विवर्तन-गुणवत्ता वाले क्रिस्टल उत्पन्न करने के लिए विभिन्न लवणों वाली क्रिस्टलीकरण स्थितियों में व्यवस्थित रूप से जोड़ा गया था जो अन्यथा नहीं बनते थे। इस तकनीक को डी आर्सी एट अल द्वारा और बेहतर बनाया गया था, जिन्होंने यादृच्छिक माइक्रोसीड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग (आरएमएमएस) विकसित की जिसमें बीजों को अतिरिक्त मैट्रिक्स क्रिस्टलाइजेशन स्क्रीन6,7में पेश किया गया था। इससे क्रिस्टल की गुणवत्ता में सुधार हुआ और औसतन क्रिस्टलीकरण हिट की संख्या में 7 के कारक की वृद्धि हुई।

क्रिस्टल सफलतापूर्वक उत्पादित होने के बाद और एक्स-रे विवर्तन पैटर्न प्राप्त किया जाता है, 'चरण समस्या' को हल करने के रूप में एक और अड़चन का सामना करना पड़ता है। डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान, विवर्तन की तीव्रता (आयाम के वर्ग के आनुपातिक) दर्ज की जाती है लेकिन चरण की जानकारी खो जाती है, जिससे चरण की समस्या को जन्म दिया जाता है जो तत्काल संरचना निर्धारण8को रोकता है। यदि लक्ष्य प्रोटीन पहले से निर्धारित संरचना वाले प्रोटीन को उच्च अनुक्रम पहचान साझा करता है, तो आणविक प्रतिस्थापन का उपयोग चरण की जानकारी9,10, 11,12का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। यद्यपि यह विधि तेज और सस्ती है, मॉडल संरचनाएं उपलब्ध या उपयुक्त नहीं हो सकती हैं। होमोलॉजी मॉडल आधारित आणविक प्रतिस्थापन विधि की सफलता काफी गिर जाती है क्योंकि अनुक्रम पहचान 35%13से नीचे गिर जाती है। एक उपयुक्त होमोलॉजी मॉडल के अभाव में, एआरसीआईबोल्डो14, 15 और पर्याप्त16जैसे एबी इनिटियो विधियों का परीक्षण किया जा सकता है। ये विधियां आणविक प्रतिस्थापन के लिए शुरुआती बिंदुओं के रूप में गणना की भविष्यवाणी किए गए मॉडल या टुकड़ों का उपयोग करती हैं। पर्याप्त है, जो शुरुआती अंक के रूप में भविष्यवाणी फंदा मॉडल का उपयोग करता है, बड़े (>100 अवशेषों) प्रोटीन और प्रोटीन मुख्य रूप से β चादरें युक्त की संरचनाओं को हल करने के लिए संघर्ष । ARCIMBOLDO, जो एक बड़ी संरचना में विस्तार करने के लिए छोटे टुकड़ों को फिट करने का प्रयास करता है, उच्च रिज़ॉल्यूशन डेटा (≤2 Å) तक सीमित है और टुकड़ों को पूर्ण संरचना में विस्तारित करने के लिए एल्गोरिदम की क्षमता से सीमित है।

यदि आणविक प्रतिस्थापन विधियां विफल हो जाती हैं, तो आइसोमोर्फसरिप्लेसमेंट 17,18 और एक ही तरंगदैर्ध्य (एसएडी19)या कई तरंगदैर्ध्य (MAD20)पर असंगत बिखरने जैसे प्रत्यक्ष तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए। यह अक्सर वास्तव में उपन्यास संरचनाओं के लिए मामला होता है, जहां क्रिस्टल का गठन किया जाना चाहिए या भारी परमाणु के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए। इसे भारी एटम यौगिक, रासायनिक संशोधन (जैसे आरएनए में 5-ब्रोमोरेसिल निगमन) या लेबल किए गए प्रोटीन अभिव्यक्ति (जैसे प्राथमिक संरचना में सेलेनोमेथिनोनाइन या सेलेनोसिस्टीन अमीनो एसिड को शामिल करना)21, 22के साथ भिगोने या सह-क्रिस्टलीकरण करके प्राप्त किया जा सकता है। यह क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया को और जटिल बनाता है और अतिरिक्त स्क्रीनिंग और अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

I3C (5-अमीनो-2, 4, 6-ट्राइओओडोइसोफलिक एसिड) और बी 3 सी (5-अमीनो-2, 4, 6-ट्राइब्रोमोइसोफैथैलिक एसिड) सहित चरणबद्ध यौगिकों का एक नया वर्ग, पहले से मौजूदचरणबद्ध यौगिकों23,24,25पर रोमांचक लाभ प्रदान करता है। I3C और B3C दोनों में एक सुगंधित रिंग पाड़ की सुविधा है जिसमें प्रत्यक्ष चरणबद्ध तरीकों और अमीनो या कार्बोक्सिलेट कार्यात्मक समूहों के लिए आवश्यक असंगत स्कैटर की एक वैकल्पिक व्यवस्था है जो प्रोटीन के साथ विशेष रूप से बातचीत करते हैं और बाध्यकारी साइट विशिष्टता प्रदान करते हैं। भारी धातु समूहों की बाद की समभुज त्रिकोणीय व्यवस्था चरणबद्ध उपसंरचना के सरलीकृत सत्यापन के लिए अनुमति देती है। लेखन के समय, प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में 26 I3C-बाध्य संरचनाएं हैं, जिनमें से 20 को एसएडी चरणबद्ध26का उपयोग करके हल किया गया था ।

यह प्रोटोकॉल भारी धातु व्युत्पन्न और आरएमएमएस स्क्रीनिंग के तरीकों को मिलाकर संरचना निर्धारण पाइपलाइन की प्रभावकारिता में सुधार करता है ताकि क्रिस्टलीकरण हिट की संख्या में वृद्धि हो और क्रिस्टल व्युत्पन्न प्रक्रिया को सरल बनाया जा सके। हमने इस विधि का प्रदर्शन किया जिसमें मुर्गी के अंडे के सफेद lysozyme और बैक्टीरियोफेज पी6827से एक उपन्यास lysin प्रोटीन का डोमेन था। अत्यधिक स्वचालित ऑटो-रिक्शा संरचना निर्धारण पाइपलाइन का उपयोग करके संरचना समाधान का वर्णन किया गया है, विशेष रूप से I3C चरणबद्ध यौगिक के लिए सिलवाया गया है। अन्य स्वचालित पाइपलाइनें मौजूद हैं जिनका उपयोग ऑटोसोल28,एल्व्स29 और क्रैन 230जैसे किया जा सकता है। शेलक्ससी/डी/ई जैसे गैर-पूरी तरह से स्वचालित पैकेजों का उपयोग31,32,33भी किया जा सकता है। यह विधि विशेष रूप से शोधकर्ताओं के लिए फायदेमंद है जो पीडीबी में समरूप मॉडलों की कमी वाले प्रोटीन का अध्ययन कर रहे हैं, स्क्रीनिंग और अनुकूलन चरणों की संख्या को काफी कम करके। इस विधि के लिए एक शर्त प्रोटीन क्रिस्टल या लक्ष्य प्रोटीन का एक क्रिस्टलीय वर्षा है, जो पिछले क्रिस्टलीकरण परीक्षणों से प्राप्त की जाती है।

Protocol

1. प्रायोगिक योजना और विचार

  1. रुचि के प्रोटीन के पूर्व-मौजूदा क्रिस्टल का उपयोग करें, अधिमानतः वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण के माध्यम से उत्पन्न होता है। वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण के सामान्यीकृत प्रोटोकॉल के लिए, बेनवेनुती और मैंगनी34देखें। तेल और मुफ्त इंटरफेस प्रसार के तहत माइक्रोबैच जैसे क्रिस्टलीकरण के अन्य तरीकों को माइक्रोबीज उत्पन्न करने के लिए कुचलने से पहले क्रिस्टल की कटाई की आवश्यकता होगी।
  2. बीज स्टॉक तैयार करने में, उच्चतम गुणवत्ता वाले क्रिस्टल का उपयोग करें जिन्हें बलिदान किया जा सकता है। उच्चतम गुणवत्ता वाले क्रिस्टल को आकृति विज्ञान के आधार पर नेत्रहीन आंका जा सकता है या यदि ऐसा डेटा उपलब्ध है तो सर्वश्रेष्ठ विवर्तन क्रिस्टल का चयन किया जा सकता है। यह बहुत संभावना है कि सीडिंग के माध्यम से अनुकूलन के बाद बेहतर गुणवत्ता वाले क्रिस्टल प्राप्त किए जाते हैं। मामले में जहां कोई क्रिस्टल उपलब्ध नहीं है, क्रिस्टलीय वर्षा जैसे स्पेरोलाइट्स और सुई का उपयोग किया जा सकता है।
  3. नमक क्रिस्टल की पहचान करें। नमक क्रिस्टल क्रिस्टलीकरण स्क्रीन में विकसित कर सकते हैं और प्रोटीन क्रिस्टल की तरह लग सकते हैं। RMMS में नमक क्रिस्टल का उपयोग कोई लाभ प्रदान करेगा और कीमती नमूना बर्बाद होगा, तो यह नमक झूठी सकारात्मक को खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    1. नमक क्रिस्टल जोर से कर रहे हैं जब वे कुचल रहे हैं। क्रिस्टल एक बीज स्टॉक उत्पन्न करने के लिए कुचल दिया जाना चाहिए, तो इस रणनीति विशेष रूप से प्रासंगिक है । क्रिस्टल को कुचलते समय यदि श्रव्य दरार ध्वनि सुनाई देती है, तो क्रिस्टल नमक होने की संभावना है।
    2. यदि प्रोटीन में ट्रिप्टोफान और टायरोसिन अवशेष होते हैं, तो प्रोटीन क्रिस्टल की पहचान करने के लिए पराबैंगनी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें जो इन प्रकाश परिस्थितियों में फ्लोरोरेस करते हैं।
    3. प्रोटीन क्रिस्टल को दागने के लिए इज़िट डाई (मेथिलीन ब्लू) का उपयोग करें ताकि उन्हें नमक क्रिस्टल में अंतर किया जा सके जो अपेक्षाकृत सना हुआ रहता है। हालांकि, यह प्रक्रिया अधिक विनाशकारी है और केवल यदि किसी के पास एक ही बूंद की प्रतिकृति से अतिरिक्त क्रिस्टल हो तो अनुशंसित है।
      नोट: हालांकि उपर्युक्त परीक्षण आशाजनक परिणाम दे सकते हैं, नमक क्रिस्टल अभी भी प्रोटीन क्रिस्टल के लिए गलत हो सकता है । इस मामले में, विवर्तन प्रयोगों का उपयोग प्रोटीन और नमक क्रिस्टल के बीच निश्चित रूप से विचार करने के लिए किया जा सकता है।

2. लिथियम I3C स्टॉक की तैयारी

  1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 120 मिलीग्राम I3C (5-अमीनो-2,4,6-ट्राइओओडोसिसोफैथैलिक एसिड) को मापें।
  2. 2 एम लिथियम हाइड्रोक्साइड के 200 माइक्रोन में I3C भंग करें। विघटन को प्रोत्साहित करने के लिए 40-60 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक का उपयोग करके समाधान को धीरे-धीरे गर्म किया जा सकता है। जिसके परिणामस्वरूप लिथियम I3C समाधान भूरा होना चाहिए और 1 एम की एकाग्रता है।
    सावधानी: लिथियम हाइड्रोक्साइड संक्षारक है। सुरक्षा चश्मा, दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहना जाना चाहिए।
  3. समाधान के पीएच को मापें। यदि आवश्यक हो, तो पीएच को 7 और 8 के बीच समायोजित करने के लिए 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड या 2 एम लिथियम हाइड्रोक्साइड की छोटी मात्रा जोड़ें। 400 माइक्रोन करने के लिए अंतिम समाधान मात्रा बनाने के लिए मिलीक्यू पानी जोड़ें। I3C स्टॉक समाधान की एकाग्रता 0.5 एम है।
    नोट: चरण 2.3 वैकल्पिक है। समाधान का पीएच किसी भी पीएच समायोजन से पहले पीएच 7-8 के बीच होना चाहिए। यदि ब्याज का प्रोटीन पीएच से दृढ़ता से प्रभावित होता है तो यह कदम किया जाना चाहिए। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है। लिथियम I3C को कम से कम दो सप्ताह35तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखा जा सकता है।

3. प्रोटीन स्टॉक के लिए I3C के अलावा

  1. विधि 1
    1. लक्ष्य प्रोटीन के 150 μL aliquot में स्टॉक लिथियम I3C जोड़ें। अंतिम एकाग्रता 5-40 mm लिथियम I3C के बीच होना चाहिए।
  2. विधि 2 (जेंटलर विधि)
    1. एक प्रोटीन कमजोर पड़ने बफर तैयार करें जो लक्ष्य प्रोटीन के बफर से मेल खाता है। इस कमजोर पड़ने बफर के लिए, 10-80 mM के बीच लिथियम I3C की एकाग्रता देने के लिए स्टॉक लिथियम I3C जोड़ें।
    2. प्रोटीन 1:1 प्रोटीन कमजोर पड़ने बफर के साथ पतला करने के लिए 5-40 mM के बीच लिथियम I3C की एक अंतिम एकाग्रता दे ।
      नोट: कुछ प्रोटीन विधि 1 में लिथियम I3C की उच्च सांद्रता के साथ संपर्क में आने पर उपजी होगी, जबकि अन्य प्रोटीन इसे बर्दाश्त कर सकते हैं । विधि 2 वर्षा की संभावना को कम करती है। हालांकि, यह विधि प्रोटीन एकाग्रता को आधा कर देती है। प्रोटीन के लिए जिनके पास स्थापित क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल नहीं है, 10 मिलीग्राम/एमएल की प्रोटीन एकाग्रता आम तौर पर प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग के लिए अनुशंसित है। 8 के प्रोटीन के लिए I3C के एक प्रारंभिक मोलर अनुपात की सिफारिश की है । प्रोटीन के लिए I3C के प्रोटीन एकाग्रता और मोलर अनुपात प्रारंभिक स्क्रीन के बाद अनुकूलित किया जा सकता है।

4. बीज का स्टॉक बनाना

  1. क्रिस्टल को कुचलने के लिए गोल जांच करें।
    1. नीली लौ पर एक बुनसेन बर्नर के साथ, अपने बीच की ओर एक पाश्चर पिपेट गर्म करें। चिमटी का उपयोग करके, पाश्चुर पिपेट के अंत को 0.3 मिमी से कम पतले व्यास में आकर्षित करने के लिए खींचें।
    2. एक बार जब मिडसेक्शन काफी पतला हो जाता है, तो इस बिंदु पर पिपेट को अलग करने के लिए लौ में उस सेगमेंट को पकड़ें और ग्लास जांच को खत्म करने के लिए पिपेट के अंत को गोल करें।
      नोट: गोल जांच क्रिस्टल क्रशर तीसरे पक्ष के विक्रेताओं द्वारा बेचे जाते हैं। ये गोल जांच करने के लिए एक विकल्प हैं ।
  2. बर्फ पर पांच 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें।
  3. एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत, माइक्रोक्रिस्टल उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त स्थिति के लिए क्रिस्टलीकरण ट्रे की जांच करें। आदर्श रूप में, अच्छे आकृति विज्ञान बड़े क्रिस्टल का चयन किया जाता है। हालांकि, यह तकनीक खराब आकृति विज्ञान क्रिस्टल, सुई, प्लेट, माइक्रोक्रिस्टल और स्पेरूलाइट्स के साथ भी काम करती है।
  4. क्रिस्टलीकरण ट्रे को अच्छी तरह से खोलें। प्लास्टिक के साथ सील किए गए 96 अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण ट्रे के लिए, प्लास्टिक को अच्छी तरह से सील करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। तेल के साथ सील ड्रॉप ट्रे फांसी के लिए, कवरस्लिप चिमटी का उपयोग कर हटाया जा सकता है और एक भी सतह पर उलटा ।
  5. एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के लिए जलाशय समाधान के 70 μL हस्तांतरण और बर्फ पर ठंडा। अन्य माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के लिए, जलाशय समाधान के 90 माइक्रोन जोड़ें और ठंडा करने के लिए बर्फ पर लौटें।
    नोट: यदि जलाशय में पर्याप्त मात्रा नहीं है या मौजूद नहीं है (तेल के नीचे माइक्रोबैच के मामले में), तो उचित अभिकर् तारों को मिलाकर क्रिस्टलीकरण जलाशय बनाएं।
  6. क्रिस्टल जांच का उपयोग कर ड्रॉप में क्रिस्टल उत्तेजित करने के लिए अच्छी तरह से इसे कुचलने । क्रिस्टल को पूरी तरह से कुचलने की जरूरत है जिसे माइक्रोस्कोप के नीचे मॉनिटर किया जा सकता है।
  7. ड्रॉप से सभी तरल निकालें और जलाशय समाधान के साथ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। मिक्स करें और बाद में माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब से 2 माइक्रोल मिश्रण लें और इसे वापस कुएं में जोड़ें। समाधान के साथ अच्छी तरह से कुल्ला और माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करें। इस कुल्ला कदम एक बार और दोहराएं। इस बिंदु से, मिश्रण में माइक्रोबीज पिघलने से बचने के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब ठंडा रखें।
  8. भंवर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम गति से ट्यूब, नियमित रूप से रोकने के लिए बर्फ पर ट्यूब ठंडा करने के लिए ओवरहीटिंग को रोकने के लिए ।
    नोट: कुछ माइक्रोसीडिंग प्रोटोकॉल क्रिस्टल क्रशिंग7,36की सहायता करने के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन सीड मनका जोड़ते हैं। हम सफलता के साथ एक बीज मनका के उपयोग के बिना तकनीक कार्यरत है, लेकिन क्रिस्टल को कुचलने के लिए एक बीज मनका का उपयोग करने के साथ कोई समस्या नहीं देखते हैं ।
  9. ठंडा जलाशय समाधान के बीच क्रमिक रूप से 10 माइक्रोन स्थानांतरित करके बीज स्टॉक के 10 सीरियल कमजोर पड़ने में 1 बनाओ।
  10. बीज स्टॉक स्टोर करें जिनका उपयोग -80 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत नहीं किया जाएगा।

5. एक आरएएमएस स्क्रीन स्थापित करना

  1. एक तरल वितरण रोबोट का उपयोग कर एक ९६ अच्छी तरह से स्क्रीनिंग प्लेट की स्थापना । रोबोट के अभाव में मल्टीचैनल पिपेट का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. एक गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक से 75 μL को 96 अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण ट्रे में स्थानांतरित करें। क्रिस्टलीकरण ड्रॉप में 1 माइक्रोन जोड़ें और जलाशय में 74 माइक्रोन जोड़ें।
    2. लिथियम I3C के साथ पूरक प्रोटीन के 1 μL हस्तांतरण, 2 कदम में बनाया, क्रिस्टलीकरण ड्रॉप करने के लिए ।
    3. क्रिस्टलीकरण ड्रॉप करने के लिए बीज स्टॉक के 0.1 μL हस्तांतरण।
    4. स्पष्ट सीलिंग टेप के साथ प्लेट को सील करें और क्रिस्टल विकास की अनुमति देने के लिए प्लेट को निरंतर तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  2. एक फांसी ड्रॉप स्क्रीन की स्थापना
    1. हैंगिंग ड्रॉप कुओं के किनारों को तेल (हैंगिंग ड्रॉप क्रिस्टलाइजेशन ट्रे 24 और 48 अच्छी तरह से प्रारूपों में पाया जा सकता है)।
    2. जलाशय में 500 माइक्रोन क्रिस्टलीकरण समाधान स्थानांतरित करें।
    3. एक ग्लास कवर स्लाइड के केंद्र के पास, लिथियम I3C के साथ पूरक प्रोटीन की एक 1 μL ड्रॉप रखें, जो चरण 2 में बनाया गया है।
    4. ड्रॉप करने के लिए क्रिस्टलीकरण समाधान के 1 μL जोड़ें।
    5. क्रिस्टलीकरण ड्रॉप करने के लिए बीज स्टॉक के 0.1 μL हस्तांतरण।
    6. कवर स्लाइड को उलटें और कवर स्लाइड को तेल में धकेलकर क्रिस्टलीकरण को अच्छी तरह से सील करें।
    7. क्रिस्टल विकास की अनुमति देने के लिए प्लेट को निरंतर तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: नए और अपरीक्षित बीज शेयरों के साथ, क्रिस्टलीकरण हिट होने की संभावना को अधिकतम करने के लिए सबसे केंद्रित बीज स्टॉक का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। क्रिस्टल की संख्या को अनुकूलित करने के लिए कम बीज एकाग्रता के साथ बाद की स्थितियों को स्थापित किया जा सकता है।
  3. क्रिस्टल विकास के लिए नियमित रूप से माइक्रोस्कोप के नीचे क्रिस्टल ट्रे का निरीक्षण करें। यदि क्रिस्टल पर्याप्त गुणवत्ता के हैं, तो उन्हें डेटा संग्रह के लिए काटा जा सकता है। क्रिस्टल का उपयोग नए बीज स्टॉक और नए आरएमएमएस स्क्रीन उत्पन्न करने के लिए भी किया जा सकता है ताकि पुनरावर्तक अनुकूलन के लिए अनुमति दी जा सके।

6. डेटा संग्रह

  1. क्रायोलोप का उपयोग करके क्रिस्टल की कटाई करें, क्रिस्टल को क्रायोप्रोटेक्ट करें और तरल नाइट्रोजन में उन्हें ठंडा करें। फ्लैश कूलिंग क्रिस्टल के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए, टेंग37 और गार्मन और मिशेल38का उल्लेख करें।
    1. क्रायोप्रोटेक्शन चरण के दौरान, यदि क्रिस्टल को एक नए जलीय समाधान से पारित किया जाता है, तो आई 3सी को क्रायोप्रोटेक्शन समाधान में जोंकने के कारण क्रिस्टल से खो दिया जा सकता है। क्रायोप्रोटेक्शन समाधान में लिथियम I3C का उपयोग एकाग्रता पर करें जो इसे कम करने के लिए क्रिस्टलीकरण की स्थिति से मेल खाता है।
    2. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उगाए गए क्रिस्टल को पैराबार 10312 तेल आधारित क्रायोप्रोटेक्टेंट (हैम्पटन रिसर्च) का उपयोग करके सफलतापूर्वक क्रायोप्रोटेक्टेड किया गया है।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, जबकि क्रिस्टल तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत कर रहे हैं ।
      सावधानी: तरल नाइट्रोजन ठंड से जलने का कारण बन सकता है। यदि संलग्न स्थानों में उपयोग किया जाता है तो तरल नाइट्रोजन भी श्वासावरोध का कारण बन सकता है।
  2. एक्स-रे स्रोत गोनियोमीटर पर क्रिस्टल माउंट करें और एक्स-रे स्रोत के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करके विवर्तन डेटा एकत्र करें।
  3. यह तकनीक I3C में आयोडीन परमाणुओं से असंगत संकेत पर निर्भर करती है। इस प्रकार, इस संकेत को अधिकतम करने के लिए एक्स-रे की ऊर्जा का चयन करें।
    1. यथासंभव कम ट्यूनेबल ऊर्जा के साथ सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे स्रोतों को सेट करें। कई मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइंस के लिए, सबसे कम विन्यास ऊर्जा 8000 से 8500 ईवी है।
    2. एनोड एक्स-रे स्रोतों को घुमाया नहीं जा सकता है। आमतौर पर तांबे के साथ इस्तेमाल एनोड स्रोतों में 8046 ईवी पर Kα बढ़त होती है, जो आयोडीन (एफ" = 6.9 ई) के लिए एक अच्छा असंगत संकेत प्रदान करता है। क्रोमियम के साथ एनोड स्रोतों में 5415 ईवी पर एक Kα बढ़त है, जो आयोडीन (एफ" = 12.6 ई) के लिए एक बड़ा असंगत संकेत प्रदान करता है।
  4. डाटा संग्रह के दौरान विकिरण क्षति एक महत्वपूर्ण समस्या है क्योंकि यह असंगत संकेत को नीचा दिखादेगा। विकिरण खुराक को कम करते हुए सबसे अच्छा विवर्तन प्राप्त करने के लिए बीम के एक्सपोजर समय और क्षीणन का चयन करें।
    नोट: ब्रोमीन परमाणुओं के साथ प्रतिस्थापित आयोडीन परमाणुओं के साथ एक समान चरणबद्ध यौगिक में, विकिरण क्षति कार्बन ब्रोमीन बांड के रेडियोलिसिस और ब्रोमीन परमाणुओं24की अधिभोग में कमी का कारण दिखाया गया है ।
    1. एक संग्रह रणनीति के रूप में विलोम बीम एसएडी डेटा संग्रह का उपयोग करें। डेटा वेजेज में एकत्र किया जाता है, जिसमें विपरीत वेजेज एक दूसरे के बाद एकत्र किए जाते हैं। यह फ्रीडेल जोड़े को समकक्ष खुराक के साथ एकत्र करने की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप विकिरण क्षति से कम असंगत संकेत का बेहतर माप होता है। उदाहरण के लिए, 360 डिग्री एकत्र करने के लिए आठ वेज रणनीति में वेज 1 (0 डिग्री-45 डिग्री), वेज 2 (180 डिग्री-225 डिग्री), वेज 3 (46 डिग्री-90 डिग्री), वेज 4 (225 डिग्री) के क्रम में डेटा एकत्र करना शामिल होगा। -270 °), कील 5 (90 डिग्री-135 डिग्री), वेज 6 (270 डिग्री-315 डिग्री), वेज 7 (135 डिग्री-180 डिग्री) और वेज 8 (315 डिग्री-360 डिग्री) ।
      नोट: सतत रोटेशन विलोम बीम डेटा संग्रह के लिए एक वैकल्पिक संग्रह रणनीति है। संग्रह रणनीतियों की हालिया तुलना के लिए, गार्सी-बोंटे और कटोना40देखें।

7. डेटा प्रोसेसिंग और संरचना समाधान

  1. असंगत संकेत को अधिकतम करने के उद्देश्य से, XDS41का उपयोग करके विवर्तन डेटा पर डेटा में कमी करें। डेटा में कमी इनपुट पैरामीटर डेटासेट के लिए विशिष्ट हैं और कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता हो सकती है। यहां कुछ सिफारिशें शुरू करने के लिए कर रहे हैं ।
    1. फ्रीडेल के कानून = झूठी सेट करें। दो बार सही निष्पादित करें, STRICT_ABSORPTION_CORRECT की स्थापना = सच है और STRICT_ABSORPTION_CORRECT = झूठी। एक रन में दूसरे की तुलना में अधिक असंगत संकेत हो सकते हैं । आउटपुट में 'एनोमाक कोर' और 'सिगानो' विषयों का उपयोग करके रनों के बीच असंगत संकेतों की तुलना करें। यह डेटा गुणवत्ता का संकेतक प्रदान करता है।
    2. XDS_ASCII पर SHELXC चलाएं। विसंगतिपूर्ण संकेत के अधिक सटीक संकेत के लिए एचकेएल फ़ाइल। 'रानोम' अनुशासन विभिन्न संकल्पों पर असंगत संकेत का संकेत देगा।
  2. डेटा को स्केल करने के लिए व्यर्थ42 और AIMLESS43 चलाएं। लक्ष्यहीन में, पैरामीटर विसंगतिपूर्ण पर सेट करें। यदि जीयूआई का उपयोग किया जाता है, तो आउटलियर अस्वीकृति और विलय आंकड़ों के लिए विकल्प अलग असंगत जोड़ेका चयन करें। असंगत संकेत को अधिकतम करने के लिए विभिन्न संकल्प कटऑफ का परीक्षण करना आवश्यक हो सकता है।
  3. ऑटो-रिक्शा स्वचालित क्रिस्टल संरचना निर्धारण पाइपलाइन44का उपयोग करके प्रोटीन संरचना को हल करें। ऑटो रिक्शा चरण की समस्या को हल करने और प्रोटीन मॉडलिंग और शोधन सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित रूप से प्रोटीन की क्रिस्टल संरचना का निर्माण करने का प्रयास करेगा।
    1. एक होमोलॉजी मॉडल टेम्पलेट के बिना प्रोटीन के लिए, उन्नत मोड में ऑटो-रिक्शा के एसएडी प्रोटोकॉल चलाएं। आवश्यक मापदंडों को दर्ज करें।
      1. अणु प्रकार के रूप में प्रोटीन का चयन करें।
      2. एंग्स्ट्रॉम (Å) में डेटा संग्रह तरंगदैर्ध्य दर्ज करें।
      3. आयोडीन परमाणुओं का उपयोग करने के लिए उपसंरचना तत्व के रूप में "I" का चयन करें।
      4. I3C को चरणबद्ध अणु से संकेत मिलता है कि उपसंरचना प्रकार के रूप में "i3c" का चयन करें।
      5. उपसंरचना निर्धारण विधि के रूप में "sub_direct" का चयन करें। यह विधि सबस्ट्रक्चर की खोज करने के लिए शेलएक्सडी32 को रोजगार देती है।
      6. प्रति मोनोमर अपेक्षित उपसंरचना की संख्या के रूप में "3" का चयन करें।
      7. उपसंरचना खोज के संकल्प कटऑफ के रूप में "1" दर्ज करें। इससे ऑटो रिक्शा अपने आप एक उपयुक्त संकल्प कटऑफ निर्धारित कर सकता है।
      8. मैथ्यू गुणांक के आधार पर असममित इकाई में एक ही मोनोमर, डेटासेट के स्पेसग्रुप और अणुओं की संख्या में अवशेषों की संख्या दर्ज करें।
      9. जरूरतों के अनुरूप एक्स-रे डेटा के उचित प्रसार स्तर का चयन करें। "ऑटोरिक्शा डेवलपर्स" का चयन करने से ऑटो-रिक्शा डेवलपर्स को समस्या उत्पन्न होने पर रन का निवारण करने की अनुमति मिलेगी।
      10. एक mtz फ़ाइल के रूप में असंगत डेटा इनपुट।
      11. प्रोटीन अनुक्रम को सेक्यू, पीर या टीएक्सटी फाइल के रूप में इनपुट करें। एक टेक्स्ट एडिटर (जैसे विंडोज पर नोटपैड ++9 या लिनक्स में नैनो) में सेक्यू फाइल जेनरेट की जा सकती है। एक नई फ़ाइल बनाएं, प्रोटीन के प्राथमिक अनुक्रम को एक लंबी रेखा के रूप में दर्ज करें या लाइन ब्रेक से अलग करें। फाइल को .seq फ़ाइल एक्सटेंशन के साथ सहेजें।
      12. एक संस्थागत ईमेल पता दर्ज करें।
  4. परिणाम प्रदान किए गए ईमेल पते पर भेजे गए वेब-लिंक के माध्यम से वितरित किए जाते हैं।
    नोट: ऑटोरिक्शा एक स्वचालित पाइपलाइन है जो एक्स-रे क्रिस्टल संरचना32,33,45, 46, 47,48, 49,50, 51, 52,53,54,55,56, 57,58को हल करने के लिए विभिन्न क्रिस्टलोग्राफी सॉफ्टवेयर पैकेजों का आह्वान करती है। यदि ऑटो रिक्शा चलाने के ढांचे को हल करने में विफल रहता है, अन्य ऑटो रिक्शा सेटिंग्स का परीक्षण किया जा सकता है। संरचना निर्धारण विधि को शेलएक्सडी32के बजाय फेजर59 का उपयोग करने के लिए "sub_phassade" में बदला जा सकता है। प्रति मोनोमर अपेक्षित उपसंरचना की संख्या में भी वृद्धि या कमी की जा सकती है।
  5. क्रिस्टल संरचना के प्रयोगात्मक चरणबद्ध के दौरान, ऑटो रिक्शा इकाई सेल में भारी परमाणुओं को स्थिति में रखने का प्रयास करेगा, जिससे एक उपसंरचना का निर्माण होगा। I3C में आयोडीन परमाणुओं की समभुज त्रिकोण व्यवस्था उपसंरचना को मान्य करने का एक कुशल तरीका प्रस्तुत करती है। यदि चरण 6.3 विफल रहता है, तो उपसंरचना को मान्य करने से समस्या निवारण संरचना समाधान में सहायता मिल सकती है।
    1. ऑटो रिक्शा परिणाम पृष्ठ से भारी परमाणु साइटों की सूची डाउनलोड करें। यह एक हाइपरलिंक है जिसे "भारी परमाणु साइटें" कहा जाता है। इससे हैवी एटम साइट्स के साथ टेक्स्ट फाइल डाउनलोड होगी।
    2. फाइल का फाइल एक्सटेंशन .txt से बदलकर .pdb।
    3. कूट 60में पीडीबी फाइल खोलें । पड़ोसी असममित इकाइयों से अन्य भारी परमाणुओं को देखने के लिए समरूपता चालू करें।
    4. भारी परमाणुओं के बीच की दूरी को मापें, जिसमें असममित इकाइयां शामिल हैं। I3C 6 एंग्स्ट्रॉम की एक साइड लेंथ के साथ एक समभुज त्रिकोण के रूप में दिखाई देगा। इन आयामों के साथ एक त्रिकोण की उपस्थिति इंगित करता है कि उन भारी परमाणुओं के प्लेसमेंट सही हैं।

Representative Results

RMMS में I3C शामिल करने से व्युत्पन्न क्रिस्टल विकास का समर्थन करने वाली नई स्थितियां उत्पन्न हो सकती हैं
एक साथ आरएमएमएस स्क्रीनिंग और आई 3सी व्युत्पन्न की प्रभावकारिता को दो प्रोटीन, मुर्गी अंडे सफेद लिसोजाइम (एचईडब्ल्यूएल, एक लिओफिलाइज्ड पाउडर के रूप में प्राप्त) और बैक्टीरियोफेज P68 से ख्यात Orf11 lysin N-टर्मिनल डोमेन (Orf11 NTD) में प्रदर्शित किया गया था। प्रत्येक प्रोटीन सहित चार अलग शर्तों के तहत खूंटी/आयन एचटी के खिलाफ जांच की गई थी: गैर वरीयता प्राप्त, वरीयता प्राप्त, I3C के साथ गैर वरीयता प्राप्त और I3C(चित्रा 1)के साथ वरीयता प्राप्त । दोनों प्रोटीन के लिए, I3C के एकमात्र इसके अलावा क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूल शर्तों की संख्या में वृद्धि नहीं की । Orf11 NTD के मामले में, केवल एक उपयुक्त स्थिति के साथ और I3C(चित्रा 1B) केबिना पहचान की गई थी । जब I3C को एचईडब्ल्यूएल स्क्रीन में जोड़ा गया था, तो हिट की संख्या 31 से घटाकर 26 कर दी गई थी, जो चरणबद्ध यौगिकों(चित्रा 1A)को पेश करते समय क्रिस्टलीकरण की अतिरिक्त जटिलताओं को रेखांकित करती थी। अन्य अध्ययनों के अनुरूप, आरएमएमएस स्क्रीन उत्पन्न करने के लिए वाणिज्यिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन में बीज जोड़ने से दोनों प्रोटीन के लिए संभावित क्रिस्टलीकरण की स्थिति की संख्या में काफी वृद्धि हुई, जिसके परिणामस्वरूप एचईडब्ल्यूएल और ऑर्फ 11 एनटीडी के लिए क्रमशः6,61 (चित्रा 1)में2.1और 6 गुना वृद्धि हुई। सबसे महत्वपूर्ण बात, I3C और बीज के एक साथ जोड़ एक गैर वरीयता प्राप्त स्क्रीन के सापेक्ष हिट की संख्या में वृद्धि हुई है, क्रमशः HEWL और Orf11 NTD के लिए एक २.३ और 7 गुना वृद्धि का प्रदर्शन । I3C की उपस्थिति में आरएमएमएस से कई क्रिस्टल उत्कृष्ट क्रिस्टल आकृति विज्ञान(चित्रा 2) दिखाते हैं।

सीडिंग I3C rMMS स्क्रीन में क्रिस्टल संख्या के सावधान नियंत्रण की अनुमति देता है
माइक्रोसीडलिंग प्रयोगों में, क्रिस्टलीकरण परीक्षण में पेश किए गए बीजों की संख्या को बीज स्टॉक को कमजोर करके नियंत्रित किया जा सकता है और यह ड्रॉप7,36में नाभिक के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। यह अक्सर बड़े क्रिस्टल बनाने की अनुमति देता है क्योंकि नाभिक स्थलों पर प्रोटीन अणुओं की प्रतिस्पर्धा कम होती है। यह लाभ I3C-rMMS विधि तक भी फैली हुई है और एचईडब्ल्यूएल और ऑर्फ 11 एनटीडी दोनों में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है। एक पतला बीज स्टॉक के साथ I3C-rMMS स्क्रीन से पहचाने गए क्रिस्टलीकरण की स्थिति का मनोरंजन कम लेकिन बड़ा क्रिस्टल(चित्रा 3)मिला।

एसएडी चरणबद्ध का उपयोग आरएमएमएस I3C स्क्रीन से प्राप्त क्रिस्टल से संरचनाओं को हल करने के लिए किया जा सकता है
चित्रा 3 में दिखाए गए पतला बीज स्टॉक का उपयोग करके उगाए गए क्रिस्टल का उपयोग एक क्रिस्टल(चित्रा 4)से विवर्तन डेटा का उपयोग करके एसएडी चरणबद्ध का उपयोग करके प्रोटीन की संरचना को हल करने के लिए किया गया था। डेटा ऑस्ट्रेलियन सिंक्रोट्रॉन एमएक्स 1 बीमलाइन62पर एकत्र किया गया था। विस्तृत डेटा संग्रह और संरचना समाधान विवरणकहीं और 27वर्णित हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 - आरएमएमएस का उपयोग दो परीक्षण प्रोटीन के लिए I3C की उपस्थिति में क्रिस्टल विकास के लिए नई स्थितियां उत्पन्न करने के लिए किया गया था। 96 अच्छी तरह से वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण स्क्रीन वाणिज्यिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन का उपयोग कर किया गया। (A)इंडेक्स एचटी स्क्रीन के साथ मुर्गी अंडे की सफेदी की जांच की गई। ट्रे को एचडब्ल्यूएल क्रिस्टल के साथ वरीयता प्राप्त 0.2 मीटर अमोनियम टार्ट्रेट डायबेसिक पीएच 7.0, 20% (डब्ल्यू/वी) पॉलीथीन ग्लाइकोल 3350 में उगाया गया था। (ख)जीवाणु पी68 से Orf11 एनटीडी का परीक्षण खूंटी/आयन स्क्रीन के साथ किया गया था । Orf11 NTD ट्रे गैर वरीयता प्राप्त स्क्रीन से हालत G12 से क्रिस्टल से वरीयता प्राप्त थे, नीले रंग में दिखाया गया है । क्रिस्टल विकास का समर्थन करने वाली स्थितियां लाल रंग में दिखाई जाती हैं। I3C की उपस्थिति और अनुपस्थिति में आरएमएमएस सीडिंग दोनों ने गैर-वरीयता प्राप्त ट्रे की तुलना में काफी अधिक क्रिस्टल हिट दिया। ट्रूओंग एट अल27से अनुकूलित चित्रा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 - वाष्प प्रसार परीक्षणों से उगाए गए क्रिस्टल की प्रतिनिधि छवियां चित्र 1 (ए) और (ख) में दिखाई गई हैं। ट्रूओंग एट अल27से अनुकूलित चित्रा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 - बीज स्टॉक को कमजोर करना आई 3सी-आरएमएमएस विधि का उपयोग करके पाए जाने वाले क्रिस्टलीकरण स्थिति में नाभिक को कम करने का एक प्रभावी तरीका है, जो क्रिस्टल की संख्या को नियंत्रित करने के लिए है। एक बूंद के भीतर नाभिक को कम करने के परिणामस्वरूप अक्सर क्रिस्टल बड़े आयामों तक बढ़ जाते हैं। ट्रूओंग एट अल27से अनुकूलित चित्रा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) और HEWL (PDB ID 6PBB) I3C-rMMS विधि का उपयोग कर सघन और ऑटो रिक्शा SAD चरणबद्ध का उपयोग कर हल किया गया। (A)एचईडब्ल्यूएल और ऑर्फ 11 एनटीडी की रिबन संरचनाओं को प्रायोगिक चरणबद्ध रूप से हल किया गया। (ख)आई3सी अणु एचईडब्ल्यूएल और ऑर्फ11 एनटीडी से बंधे । (ग) आई3 सी में असंगत आयोडीन परमाणुओं की व्यवस्था 6 Å के समभुज त्रिकोण में की जाती है । इस प्रकार चरणबद्ध उपसंरचना में इस त्रिकोण की उपस्थिति इंगित करती है कि उस स्थिति में एक I3C अणु है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

आणविक प्रतिस्थापन के लिए एक उपयुक्त होमोलॉजी मॉडल के अभाव में एक उपन्यास प्रोटीन की संरचना निर्धारण के लिए प्रयोगात्मक चरणबद्ध की आवश्यकता होती है। इन तरीकों को प्रोटीन क्रिस्टल में भारी परमाणुओं के समावेश की आवश्यकता होती है जो संरचना निर्धारण पाइपलाइन में जटिलता का स्तर जोड़ता है और कई बाधाओं को पेश कर सकता है जिन्हें संबोधित किया जाना चाहिए। सेलेनोमेथियोनाइन और सेलेनोसिस्टीन का उपयोग करके लेबल की अभिव्यक्ति के माध्यम से भारी परमाणुओं को सीधे प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है। चूंकि यह विधि महंगी, श्रमसाध्य है और इसके परिणामस्वरूप कम प्रोटीन पैदावार हो सकती है, क्रिस्टलीकरण की स्थिति पाए जाने और अवेलेबल प्रोटीन के साथ अनुकूलित होने के बाद लेबल किए गए प्रोटीन को अक्सर व्यक्त किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, क्रिस्टल को भारी परमाणुओं वाले समाधान में भिगोकर प्राप्त किया जा सकता हैजिसमें 22,63,64। यह विधि अक्सर उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल का उपयोग करती है और इसलिए एक मजबूत क्रिस्टलीकरण विधि पहले से ही विकसित होने के बाद की जाती है। इस विधि का उपयोग करके सफलतापूर्वक एक व्युत्पन्न क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए प्रक्रियाओं को भिगोने और विभिन्न चरणबद्ध यौगिकों की स्क्रीनिंग के आगे अनुकूलन की आवश्यकता होती है, इसलिए पहले से ही श्रमसाध्य प्रक्रिया में अधिक समय जोड़ते हैं।

भारी परमाणु के साथ प्रोटीन का सह-क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग चरण में किया जा सकता है, इस प्रकार प्रक्रिया को कुशलतापूर्वक सुव्यवस्थित करता है और क्रिस्टल हेरफेर चरणों को कम करता है जो नुकसान पहुंचा सकता है। हालांकि, अभी भी कुछ प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण हिट प्राप्त करने के संभावित परिदृश्य और एक संगत भारी परमाणु यौगिक चुनने की समस्या मौजूद है। वर्तमान में उपलब्ध कई चरणबद्ध यौगिक आमतौर पर क्रिस्टलीकरण की स्थिति में पाए जाने वाले तेज़, बफ़र्स और एडिटिव्स के साथ असंगत हैं। वे सल्फेट और फॉस्फेट बफ़र्स में अघुलनशील हो सकते हैं, साइट्रेट और एसीटेट के लिए चेलेट, हेपेस और ट्रिस बफ़र्स के साथ प्रतिकूल प्रतिक्रिया करते हैं या डीटीटी और β-मर्केप्टोथेनॉल21द्वारा तनहा हो जाते हैं। चूंकि I3C चरणबद्ध यौगिक इन असंगतियों से पीड़ित नहीं है, इसलिए यह एक मजबूत चरणबद्ध यौगिक है जो कई अलग-अलग स्थितियों के लिए उत्तरदायी हो सकता है।

इस अध्ययन में, आई 3सी चरणबद्ध यौगिक और आरएमएमएस के एक साथ सह-क्रिस्टलीकरण के माध्यम से एसएडी चरणबद्ध के लिए तैयार व्युत्पन्न क्रिस्टल के उत्पादन की एक सुव्यवस्थित विधि प्रस्तुत की गई है। दोनों तकनीकों का संयोजन क्रिस्टलीकरण हिट की संख्या को बढ़ाता है, जिसमें कई स्थितियों में बेहतर आकृति विज्ञान और विवर्तन विशेषताएं होती हैं। Orf11 NTD और HEWL परीक्षण दोनों मामलों में, I3C-rMMS स्क्रीन में नई शर्तों की पहचान की गई थी जो I3C मौजूद नहीं होने पर अनुपस्थित थे। संभावित रूप से, I3C प्रोटीन के लिए अनुकूल रूप से बांध सकता है, क्रिस्टल संपर्कों के गठन और स्थिरीकरण को सुविधाजनक बना सकता है27। बदले में, यह क्रिस्टलीकरण को प्रेरित कर सकता है और संभवतः विवर्तन विशेषताओं में सुधार कर सकता है। विरल मैट्रिक्स स्क्रीन के साथ संगत यौगिक होने के अलावा, I3C अपने आंतरिक गुणों के कारण एक आकर्षक चरणबद्ध यौगिक भी है। कार्यात्मक समूह जो सुगंधित अंगूठी पाड़ पर आयोडीन के साथ वैकल्पिक होते हैं, प्रोटीन के लिए विशिष्ट बाध्यकारी की अनुमति देते हैं। इससे अधिक अधिभोग होता है और संभावित रूप से पृष्ठभूमि संकेत23को कम कर देता है । इसके अलावा, एक समभुज त्रिकोण में असंगत स्कैटरर्स की व्यवस्था उपसंरचना में स्पष्ट है और इसका उपयोग I3C(चित्रा 4B और 4C)के बाध्यकारी को तेजी से मान्य करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, यह ट्यूनेबल सिंक्रोट्रॉन विकिरण के साथ-साथ क्रोमियम और कॉपर घूर्णन एनोड एक्स-रे स्रोतों के साथ एक असंगत संकेत का उत्पादन कर सकता है। इस प्रकार, इसे कई अलग-अलग कार्यप्रवाहों पर लागू किया जा सकता है। के रूप में I3C व्यापक रूप से उपलब्ध है और खरीद करने के लिए सस्ती है, इस दृष्टिकोण सबसे संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच के भीतर है ।

I3C-rMMS विधि का उपयोग करते समय कई प्रयोगात्मक विचारों को संबोधित किया जाना चाहिए। यदि प्रोटीन की प्रारंभिक क्रिस्टलीय सामग्री प्राप्त नहीं की जा सकती है तो इस विधि को लागू नहीं किया जा सकता है। मुश्किल मामलों में, एक समरूप प्रोटीन से क्रिस्टलीय सामग्री का उपयोग बीज स्टॉक उत्पन्न करने के लिए भी किया जा सकता है। आरएमएमएस के लिए इस क्रॉस-सीडिंग दृष्टिकोण ने कुछ आशाजनक परिणाम दिखाए हैं7। बीज स्टॉक के कमजोर पड़ने के माध्यम से क्रिस्टल संख्या का अनुकूलन एक महत्वपूर्ण कदम है, जिसे अनदेखा नहीं किया जाना चाहिए, ताकि उच्च गुणवत्ता वाले बड़े क्रिस्टल के उत्पादन और उपयुक्त विवर्तन डेटा प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम किया जा सके। यदि असममित इकाई में कुछ I3C साइटों की पहचान की जाती है, तो क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूल परिस्थितियों को I3C की बढ़ी हुई एकाग्रता के साथ आगे अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह असंगत संकेत को अधिकतम करने और क्रिस्टल व्युत्पन्न सहायता करने के लिए I3C की अधिभोग में वृद्धि कर सकता है।

ऐसे मामले हो सकते हैं जहां यह तकनीक प्रोटीन क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए इष्टतम विधि नहीं हो सकती है। के रूप में एक प्रोटीन या प्रोटीन जटिल बढ़ जाती है के आकार, प्रोटीन की सतह पर I3C साइटों की सीमित संख्या संरचना को हल करने के लिए पर्याप्त चरणबद्ध शक्ति प्रदान नहीं कर सकते हैं । इन परिदृश्यों में जहां प्रोटीन का आकार चरणबद्ध रूप से बाधित होने की आशंका है, प्रोटीन की सेलेनोमेथियोनाइन लेबलिंग प्रोटीन को चरणबद्ध रूप से समाप्त करने के लिए अधिक व्यवहार्य दृष्टिकोण हो सकता है । यदि प्रोटीन में मेथियोनिन अवशेषों की पर्याप्त संख्या है (प्रति 100 अवशेषों में कम से कम एक मेथियोनिन होने की सिफारिश की65)और प्रोटीन में उच्च दक्षता सेलेनोइन निगमन प्राप्त किया जा सकता है (जैसे बैक्टीरियल अभिव्यक्ति सिस्टम66में), संरचना को चरणबद्ध करने के लिए कई उच्च अधिभोग सेलेनियम परमाणु क्रिस्टल में मौजूद होंगे।

इसके अलावा, कुछ प्रोटीन स्वाभाविक रूप से I3C के साथ व्युत्पन्न के लिए अनुपयुक्त हो सकते हैं। प्रोटीन पर I3C बाध्यकारी साइटें प्रोटीन संरचना पर निर्भर हैं। ऐसे प्रोटीन मौजूद हो सकते हैं जिनमें स्वाभाविक रूप से I3C बाध्यकारी के साथ संगत कुछ उजागर पैच होते हैं। इस प्रकार, यह अनिकट नहीं है कि I3C के साथ कुछ लक्षित प्रोटीन को सह-क्रिस्टलाइज करने में कठिनाइयां हो सकती हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह शोध ANSTO के हिस्से ऑस्ट्रेलियन सिंक्रोट्रॉन में एमएक्स1 बीमलाइन पर किया गया था । लेखक इस काम पर चर्चा के लिए शेरविन और ब्रूनिंग प्रयोगशालाओं के सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक डॉ संतोष पंजिकर और डॉ लिंडा व्हाट-शेरविन को भी स्वीकार करना चाहेंगे जिन्होंने इस प्रोटोकॉल का बीड़ा उठाने वाले मूल कार्य में योगदान दिया ।

निम्नलिखित धन स्वीकार किया है: ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (अनुदान नग। DP150103009 और DP160101450 कीथ ई. शेरविन के लिए); एडिलेड विश्वविद्यालय (ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम जिया Quyen Truong और स्टेफनी गुयेन के लिए वजीफा छात्रवृत्ति) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL disposable luer lock syringes Adelab Scientific T3SS10LAT Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells
24 well tissue culture plate Sigma Aldrich CLS3527 Used for hanging drop crystal tray
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506 For 96 well crystallization screens set up by robot
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid Alfa Aesar B22178 Commonly referred to as I3C in the article
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original Hampton Research HR3-297 For 96 well crystallization screens set up by robot
Coverslips  Thermo Fisher Scientific 18X18-2 Coverslips for hanging drop crystal tray wells
Dow Corning vacuum grease Hampton Research HR3-510 Used for sealing hanging drop crystal tray wells
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL Eppendorf 3120000011
Gilson Pipette 2 μL-20 μL John Morris Group 1153247
Gilson Pipette 20 μL-200 μL John Morris Group 1152006
Glass pasteur pipettes Adelab Scientific HIR92601.01
Hen Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Approximately 95% pure
IndexHT screen Hampton Research HR2-134
Microscope illuminator Meiji Techno FT192/230 Light source to illuminate crystallography experiments
PEG/ION HT screen Hampton Research HR2-139
Phoenix Liquid Dispenser Art Robbins Instruments 602-0001-10
Scalpel with scalpel blade no. 15 Adelab Scientific LV-SMSCPO15
Seed bead kit Hampton Research HR2-320 Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.
Stereo microscope  Meiji Techno EMZ-5TR Microscope for visualising crystallography experiments
Tweezers Sigma-Aldrich T5415
Vortex mixer Adelab Scientific RAVM1

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 167 सीडिंग रैंडम माइक्रोसीड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग आरएमएमएस प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी चरणबद्ध द मैजिक ट्रायंगल आई3सी
रैंडम माइक्रोसीेड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग का उपयोग करके I3C के साथ प्रोटीन क्रिस्टल का व्युत्पन्न
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Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning,… More

Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (167), e61894, doi:10.3791/61894 (2021).

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