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Biochemistry

Dérivation des cristaux protéiques avec I3C à l’aide du criblage aléatoire de matrice microséeed

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61894
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1
1School of Biological Sciences, The University of Adelaide, 2Institute of Photonics and Advanced Sensing (IPAS), School of Biological Sciences, The University of Adelaide
* These authors contributed equally

Summary

Cet article présente une méthode pour générer des cristaux protéiques dérivés de l’I3C (acide 5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic) utilisant le microsédage pour générer de nouvelles conditions de cristallisation dans des écrans matriciels clairsemés. Les plateaux peuvent être mis en place à l’aide de robots de distribution liquide ou à la main.

Abstract

L’élucidation de la structure protéique à l’aide de la cristallographie aux rayons X nécessite à la fois des cristaux de diffractation de haute qualité et une solution computationnelle du problème de phase de diffraction. Les nouvelles structures qui n’ont pas de modèle d’homologie approprié sont souvent dérivées d’atomes lourds pour fournir des informations expérimentales sur la phase. Le protocole présenté génère efficacement des cristaux de protéines dérivatisés en combinant le criblage aléatoire de matrice de microsédage avec la dérivation avec une molécule d’atome lourde I3C (acide 5-amiino-2,4,6-triiodoisophthalic). En incorporant l’I3C dans le treillis de cristal, le problème de phase de diffraction peut être résolu efficacement à l’aide de la dispersion anormale à longueur d’onde unique (TAS). L’arrangement trilatéral de triangle des atomes d’iode dans I3C permet la validation rapide d’une sous-structure anormale correcte. Ce protocole sera utile aux biologistes structurels qui résolvent les structures macromoléculaires à l’aide de techniques cristallisées qui s’intéressent à l’élimination progressive expérimentale.

Introduction

Dans le domaine de la biologie structurale, la cristallographie aux rayons X est considérée comme la technique de l’étalon-or pour déterminer les structures de résolution atomique des macromolécules. Il a été largement utilisé pour comprendre la base moléculaire des maladies, guider des projets rationnels de conception de médicaments et élucider le mécanisme catalytique des enzymes1,2. Bien que les données structurelles fournissent une richesse de connaissances, le processus d’expression et de purification des protéines, de cristallisation et de détermination de la structure peut être extrêmement laborieux. Plusieurs goulets d’étranglement sont couramment rencontrés qui entravent l’avancement de ces projets et il faut s’y attaquer pour rationaliser efficacement le pipeline de détermination de la structure cristalline.

Après l’expression et la purification recombinantes, les conditions préliminaires propices à la cristallisation doivent être identifiées, ce qui est souvent un aspect ardu et long de la cristallographie aux rayons X. Des écrans matriciels clairsemés commerciaux qui consolident les conditions connues et publiées ont été développés pour atténuer ce goulotd’étranglement 3,4. Cependant, il est courant de générer peu de succès à partir de ces écrans initiaux en dépit de l’utilisation d’échantillons de protéines très pures et concentrées. L’observation de gouttes claires indique que la protéine peut ne pas atteindre les niveaux de sursaturation nécessaires pour nucléer un cristal. Pour encourager la nucléation et la croissance des cristaux, les graines produites à partir de cristaux préexistants peuvent être ajoutées aux conditions, ce qui permet un échantillonnage accru de l’espace de cristallisation. Ireton et Stoddard ont introduit pour la première fois la méthode de criblage de matrice microsécadavres 5. Des cristaux de mauvaise qualité ont été broyés pour faire un stock de graines, puis ajoutés systématiquement aux conditions de cristallisation contenant différents sels pour générer de nouveaux cristaux de qualité diffraction qui ne se seraient pas formés autrement. Cette technique a été encore améliorée par D’Arcy et coll. qui ont développé le criblage aléatoire de matrice de microseed (rMMS) dans lequel les graines ont été introduites dans un écran de cristallisation dematrice de rechange 6,7. Cela a amélioré la qualité des cristaux et augmenté le nombre de coups de cristallisation en moyenne d’un facteur de 7.

Une fois que les cristaux sont produits avec succès et un modèle de diffraction de rayon X est obtenu, un autre goulot d’étranglement sous la forme de résoudre le « problème de phase » est rencontré. Au cours du processus d’acquisition des données, l’intensité de la diffraction (proportionnelle au carré de l’amplitude) est enregistrée, mais l’information de phase est perdue, ce qui donne lieu au problème de phase qui arrête la détermination immédiate de la structure8. Si la protéine cible partage l’identité de séquence élevée à une protéine avec une structure précédemment déterminée, le remplacement moléculaire peut être employé pour estimer l’information de phase9,10,11,12. Bien que cette méthode soit rapide et peu coûteuse, les structures du modèle peuvent ne pas être disponibles ou appropriées. Le succès de la méthode de remplacement moléculaire basée sur le modèle d’homologie diminue considérablement à mesure que l’identité de la séquence tombe en dessous de 35% 13. En l’absence d’un modèle d’homologie approprié, des méthodes ab initio, telles que ARCIMBOLDO14,15 et AMPLE16, peuvent être testées. Ces méthodes utilisent des modèles ou des fragments prédits par calcul comme points de départ pour le remplacement moléculaire. AMPLE, qui utilise les modèles de leurre prévus comme points de départ, lutte pour résoudre les structures de grandes protéines (>100 résidus) et de protéines contenant principalement β feuilles. ARCIMBOLDO, qui tente d’insérer de petits fragments pour s’étendre dans une structure plus grande, est limité aux données haute résolution (≤2 Å) et par la capacité des algorithmes à étendre les fragments dans une structure complète.

Si les méthodes de remplacement moléculaire échouent, des méthodes directes telles que le remplacement isomorphe17,18 et la diffusion anormale à une seule longueur d’onde (SAD19) ou à plusieurs longueurs d’onde (MAD20) doivent être utilisées. C’est souvent le cas pour des structures vraiment nouvelles, où le cristal doit être formé ou dérivé avec un atome lourd. Ceci peut être réalisé en trempant ou en co-cristallisant avec un composé atome lourd, la modification chimique (telle que l’incorporation de 5-bromouracil dans l’ARN) ou l’expression étiquetée de protéine (telle que incorporer la sélénomethionine ou les acides aminés de selénocystéine dans la structure primaire)21,22. Cela complique encore le processus de cristallisation et nécessite un dépistage et une optimisation supplémentaires.

Une nouvelle classe de composés phasing, y compris I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acide) et B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic acide), offrent des avantages passionnants par rapport aux composés préexistants23,24,25. I3C et B3C disposent d’un échafaudage aromatique avec un arrangement alternatif de dispersions anormales nécessaires pour les méthodes d’élimination progressive directe et les groupes fonctionnels aminés ou carboxylate qui interagissent spécifiquement avec la protéine et fournissent la spécificité du site contraignant. L’agencement triangulaire équilatéral subséquent des groupes de métaux lourds permet une validation simplifiée de la sous-structure d’élimination progressive. Au moment d’écrire ces lignes, il y avait 26 structures liées à l’I3C dans la Banque de données protéiques (PDB), dont 20 ont été résolues à l’aide de l’élimination progressive du TAS26.

Ce protocole améliore l’efficacité du pipeline de détermination de la structure en combinant les méthodes de dérivation des métaux lourds et de criblage rMMS afin d’augmenter simultanément le nombre de coups de cristallisation et de simplifier le processus de dérivation des cristaux. Nous avons démontré que cette méthode était extrêmement efficace avec le lysozyme de blanc d’oeuf de poule et un domaine d’une protéine nouvelle de lysine du bactériophage P6827. La solution de structure utilisant le pipeline hautement automatisé de détermination de structure d’auto-pousse-pousse est décrite, spécifiquement adaptée pour le composé de phasing d’I3C. Il existe d’autres pipelines automatisés qui peuvent être utilisés tels que AutoSol28, ELVES29 et CRANK230. Les paquets non entièrement automatisés tels que SHELXC/D/E peuvent également êtreutilisés 31,32,33. Cette méthode est particulièrement bénéfique pour les chercheurs qui étudient les protéines dépourvues de modèles homologues dans la PDB, en réduisant considérablement le nombre d’étapes de dépistage et d’optimisation. Une condition préalable à cette méthode est les cristaux protéiques ou un précipité cristallin de la protéine cible, obtenu à partir d’essais de cristallisation antérieurs.

Protocol

1. Planification expérimentale et considérations

  1. Utilisez des cristaux préexistants de la protéine d’intérêt, de préférence générés par la cristallisation par diffusion de vapeur. Pour un protocole généralisé de cristallisation de la diffusion des vapeurs, voir Benvenuti et Mangani34. D’autres méthodes de cristallisation telles que le microbatch sous huile et la diffusion libre de l’interface nécessiteront la récolte des cristaux avant le concassage pour générer des microsérages.
  2. Dans la préparation d’un stock de graines, utilisez des cristaux de la plus haute qualité qui peuvent être sacrifiés. Le cristal de la plus haute qualité peut être jugé visuellement en fonction de la morphologie ou le meilleur cristal diffracting peut être sélectionné, si de telles données sont disponibles. Il est très probable que des cristaux de meilleure qualité soient obtenus après optimisation par l’ensemencement. Dans le cas où aucun cristal n’est disponible, des précipités cristallins tels que des sphérulites et des aiguilles peuvent être utilisés.
  3. Identifier les cristaux de sel. Les cristaux de sel peuvent se développer dans des écrans de cristallisation et peuvent ressembler à des cristaux de protéines. L’utilisation de cristaux de sel dans rMMS ne fournira aucun avantage et gaspillera l’échantillon précieux, ainsi il est important d’éliminer le sel faux positifs.
    1. Les cristaux de sel sont forts lorsqu’ils sont écrasés. Les cristaux doivent être broyés pour générer un stock de semences, de sorte que cette stratégie est particulièrement pertinente. Si un bruit de fissure audible est entendu lors de l’écrasement des cristaux, le cristal est susceptible d’être du sel.
    2. Si la protéine contient des résidus de tryptophane et de tyrosine, utilisez la microscopie à fluorescence ultraviolette pour identifier les cristaux de protéines qui fluorent dans ces conditions d’éclairage.
    3. Utilisez le colorant Izit (bleu méthylène) pour tacher les cristaux de protéines pour les différencier des cristaux de sel qui restent relativement non tachés. Cependant, cette procédure est plus destructrice et n’est recommandée que si l’on a des cristaux à épargner des répliques de la même goutte.
      REMARQUE : Bien que les tests susmentionnés puissent donner des résultats prometteurs, les cristaux de sel peuvent encore être confondus avec des cristaux de protéines. Dans ce cas, des expériences de diffraction peuvent être utilisées pour discerner définitivement entre une protéine et un cristal de sel.

2. Préparation du stock de lithium I3C

  1. Mesurez 120 mg d’I3C (acide microcentrifique 5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic) dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
  2. Dissoudre l’I3C en 200 μL d’hydroxyde de lithium de 2 M. La solution peut être chauffée en douceur à l’aide d’un bloc thermique à 40-60 °C pour encourager la dissolution. La solution lithium I3C qui en résulte doit être brune et avoir une concentration de 1 M.
    MISE EN GARDE : L’hydroxyde de lithium est corrosif. Des lunettes de sécurité, des gants et un manteau de laboratoire doivent être portés.
  3. Mesurer le pH de la solution. Si nécessaire, ajouter de petites quantités d’acide chlorhydrique de 1 M ou d’hydroxyde de lithium de 2 M pour ajuster le pH entre 7 et 8. Ajouter de l’eau milliQ pour faire le volume final de la solution à 400 μL. La concentration de la solution de stock I3C est de 0,5 M.
    REMARQUE : L’étape 2.3 est facultative. Le pH de la solution doit se trouver entre le pH 7-8 avant tout ajustement de pH. Cette étape doit être effectuée si la protéine d’intérêt est fortement affectée par le pH. Le protocole peut être mis en pause ici. Lithium I3C peut être maintenu dans l’obscurité à 4 °C pendant au moins deux semaines35.

3. Ajout de l’I3C au stock de protéines

  1. Méthode 1
    1. Ajouter le stock de lithium I3C à un aliquot de 150 μL de la protéine cible. La concentration finale devrait être comprise entre 5-40 mM lithium I3C.
  2. Méthode 2 (méthode plus douce)
    1. Préparez un tampon de dilution des protéines qui correspond au tampon de la protéine cible. À ce tampon de dilution, ajouter le stock de lithium I3C pour donner une concentration de lithium I3C entre 10-80 mM.
    2. Diluer la protéine 1:1 avec tampon de dilution des protéines pour donner une concentration finale de lithium I3C entre 5-40 mM.
      REMARQUE : Certaines protéines se précipitent en entrant en contact avec des concentrations élevées de lithium I3C dans la méthode 1, tandis que d’autres protéines peuvent le tolérer. La méthode 2 réduit la probabilité de précipitations. Cependant, cette méthode réduit de moitié la concentration en protéines. Pour les protéines qui n’ont pas de protocole de cristallisation établi, une concentration protéique de 10 mg/mL est généralement recommandée pour le dépistage initial de la cristallisation. Un rapport molaire initial d’I3C à la protéine de 8 est recommandé. La concentration en protéines et le rapport molaire de l’I3C à la protéine peuvent être optimisés après l’écran initial.

4. Faire un stock de semences

  1. Faire une sonde arrondie pour écraser les cristaux.
    1. Avec un brûleur Bunsen sur la flamme bleue, chauffer une pipette Pasteur vers son milieu. À l’aide d’une pince à épiler, tirer l’extrémité de la pipette Pasteur pour la tirer dans un diamètre mince de moins de 0,3 mm.
    2. Une fois que la section médiane est assez mince, maintenez ce segment dans la flamme pour séparer la pipette à ce point et autour de l’extrémité de la pipette pour terminer la sonde en verre.
      REMARQUE : Les broyeurs de cristal à sonde arrondie sont vendus par des vendeurs tiers. Il s’agit d’une alternative à la fabrication de sondes arrondies.
  2. Placer cinq tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL sur la glace.
  3. Au microscope léger, examiner le plateau de cristallisation pour trouver une condition appropriée pour générer des microcrystals. Idéalement, une bonne morphologie de gros cristaux sont sélectionnés. Cependant, cette technique fonctionne également avec de pauvres cristaux de morphologie, aiguilles, plaques, microcrystals et sphérulites.
  4. Ouvrez bien le plateau de cristallisation. Pour 96 plateaux de cristallisation bien scellés avec du plastique, utilisez un scalpel pour couper le plastique scellant le puits. Pour les bacs suspendus scellés avec de la graisse, le coverslip peut être enlevé à l’aide d’une pince à épiler et inversé sur une surface plane.
  5. Transférer 70 μL de solution de réservoir dans un tube de microcentrifugeuse et le refroidir sur de la glace. Dans les autres tubes de microcentrifugeuse, ajouter 90 μL de solution de réservoir et retourner à la glace pour refroidir.
    REMARQUE : Si le réservoir n’a pas assez de volume ou n’existe pas (dans le cas du microbatch sous l’huile), créez un réservoir de cristallisation en mélangeant les réhésifs appropriés.
  6. Agiter le cristal dans la goutte à l’aide de la sonde cristalline pour bien l’écraser. Le cristal doit être complètement broyé qui peut être surveillé au microscope.
  7. Retirez tout le liquide de la goutte et transférez-le dans le tube de microcentrifugeuse avec la solution du réservoir. Mélanger et ensuite prendre 2 μL de mélange du tube de microcentrifugeuse et l’ajouter au puits. Rincez le puits avec la solution et transférez-le dans le tube de microcentrifugeuse. Répétez cette étape de rinçage une fois de plus. À partir de ce moment, garder le tube de microcentrifugeuse froid pour éviter de faire fondre les microsépènes dans le mélange.
  8. Vortex le tube à vitesse maximale à 4 °C pendant 3 minutes, s’arrêtant régulièrement pour refroidir le tube sur la glace pour éviter la surchauffe.
    REMARQUE : Certains protocoles de microsédage ajoutent une perle de graines de polytétrafluoroéthylène au tube de microcentrifugeuse pour faciliter leconcassage de cristaux 7,36. Nous avons utilisé la technique sans l’utilisation d’une perle de graines avec succès, mais ne vois aucun problème avec l’utilisation d’une perle de graines pour écraser les cristaux.
  9. Faire une dilution périodique 1 sur 10 du stock de graines en transférant séquentiellement 10 μL entre les solutions de réservoir réfrigérées.
  10. Conserver les stocks de semences qui ne seront pas utilisés immédiatement à -80 °C.

5. Mise en place d’un écran rMMS

  1. Mise en place d’une plaque de criblage de puits 96 à l’aide d’un robot de distribution liquide. En l’absence d’un robot, une pipette multicanal peut également être utilisée.
    1. Transférer 75 μL d’un bloc de puits profond à un plateau de cristallisation de 96 puits. Ajouter 1 μL à la goutte de cristallisation et 74 μL au réservoir.
    2. Transférer 1 μL de protéines complétées par du lithium I3C, fabriqué à l’étape 2, à la goutte de cristallisation.
    3. Transférer 0,1 μL de bouillon de graines à la goutte de cristallisation.
    4. Sceller la plaque avec du ruban adhésif clair et incuber la plaque à une température constante pour permettre la croissance du cristal.
  2. Mise en place d’écrans suspendus
    1. Graisser les bords des puits suspendus (des bacs de cristallisation suspendus peuvent être trouvés dans 24 et 48 formats de puits).
    2. Transférer la solution de cristallisation de 500 μL dans le réservoir.
    3. Près du centre d’une glissière de couverture en verre, placez une goutte de protéines de 1 μL complétée au lithium I3C, faite à l’étape 2.
    4. Ajouter 1 μL de la solution de cristallisation à la goutte.
    5. Transférer 0,1 μL de bouillon de graines à la goutte de cristallisation.
    6. Inversez la glissière du couvercle et scellez bien la cristallisation en poussant la glissière du couvercle dans la graisse.
    7. Incuber la plaque à température constante pour permettre la croissance du cristal.
      REMARQUE : Avec des stocks de semences nouveaux et non testés, il est recommandé d’utiliser le stock de semences le plus concentré pour maximiser les chances d’obtenir des coups de cristallisation. Des conditions ultérieures peuvent être mises en place avec une concentration réduite de graines afin d’optimiser le nombre de cristaux.
  3. Inspectez régulièrement les plateaux en cristal au microscope pour la croissance des cristaux. Si les cristaux sont de qualité suffisante, ils peuvent être récoltés pour la collecte de données. Les cristaux peuvent également être utilisés pour générer de nouveaux stocks de semences et de nouveaux écrans rMMS pour permettre une optimisation itérative.

6. Collecte de données

  1. Récoltez les cristaux à l’aide de cryoloops, cryoprotect les cristaux et flash refroidir dans de l’azote liquide. Pour plus d’informations sur les cristaux de refroidissement flash, consultez Teng37 et Garman et Mitchell38.
    1. Pendant le stade de cryoprotection, si le cristal est passé à travers une nouvelle solution aqueuse, I3C peut être perdu du cristal en raison de son sangsue dans la solution de cryoprotection. Utilisez le lithium I3C dans la solution de cryoprotection à une concentration qui correspond à la condition de cristallisation pour atténuer cela.
    2. Les cristaux cultivés à l’aide de ce protocole ont été cryoprotected utilisant parabar 10312 cryoprotecteur à base d’huile (Hampton Research).
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici pendant que les cristaux sont stockés dans de l’azote liquide.
      ATTENTION : L’azote liquide peut causer des brûlures à froid. L’azote liquide peut également causer l’asphyxie s’il est utilisé dans des espaces clos.
  2. Montez le cristal sur le goniomètre source de rayons X et recueillez des données de diffraction à l’aide du protocole spécifique à la source de rayons X.
  3. Cette technique repose sur un signal anormal provenant d’atomes d’iode en I3C. Ainsi, sélectionnez l’énergie de la radiographie pour maximiser ce signal.
    1. Réglez les sources de rayons X synchrotron avec des énergies tunable aussi bas que possible. Pour de nombreuses lignes de faisceau de cristallographie macromoléculaire, l’énergie configurable la plus basse est de 8000 à 8500 eV.
    2. Les sources de rayons X à anodes rotatives ne peuvent pas être réglées. Les sources d’anode couramment utilisées avec du cuivre ont le bord Kα à 8046 eV, ce qui fournit un bon signal anormal pour l’iode (f » = 6,9 e). Les sources d’anodes avec chrome ont un bord Kα à 5415 eV, ce qui fournit un grand signal anormal pour l’iode (f » = 12,6 e).
  4. Les dommages causés par les radiations sont un problème important lors de la collecte de données, car ils dégraderont le signalanormal 39. Sélectionnez le temps d’exposition et l’atténuation du faisceau pour obtenir la meilleure diffraction tout en minimisant la dose de rayonnement.
    REMARQUE : Dans un composé de phasage similaire avec les atomes d’iode remplacés par des atomes de brome, des dommages de rayonnement ont été montrés pour causer la radiolyse de la liaison de brome de carbone et une réduction de l’occupation des atomes de brome24.
    1. Utilisez la collecte de données SAD à faisceau inverse comme stratégie de collecte. Les données sont collectées en coins, avec des coins opposés collectés les uns après les autres. Cela permet de recueillir des paires de Friedel avec une dose équivalente, ce qui permet d’améliorer la mesure du signal anormal moins affecté par les dommages causés par les radiations. Par exemple, une stratégie de huit coins pour recueillir 360° consisterait à recueillir les données dans l’ordre du coin 1 (0°-45°), du coin 2 (180°-225°), du coin 3 (46°-90°), du coin 4 (225°). -270°), wedge 5 (90°-135°), wedge 6 (270°-315°), wedge 7 (135°-180°) et wedge 8 (315°-360°).
      REMARQUE : La rotation continue est une stratégie de collecte alternative à celle de la collecte de données de faisceau inverse. Pour une comparaison récente des stratégies de collecte, voir Garcie-Bonte & Katona40.

7. Solution de traitement et de structure de données

  1. Effectuer la réduction des données sur les données de diffraction à l’aide de XDS41, dans le but de maximiser le signal anormal. Les paramètres d’entrée de réduction des données sont spécifiques à l’ensemble de données et peuvent nécessiter des essais et des erreurs. Voici quelques recommandations pour commencer.
    1. Définir FRIEDEL’S LAW=FALSE. Exécutez CORRECT deux fois, STRICT_ABSORPTION_CORRECT = VRAI et STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FAUX. Une course peut avoir un signal anormal plus élevé que l’autre. Comparez les signaux anormaux entre les pistes à l’aide des disciplines « Anomal Corr » et « SigAno » dans la sortie. Cela fournit un indicateur de la qualité des données.
    2. Exécutez SHELXC sur le XDS_ASCII. Fichier HKL pour une indication plus précise du signal anormal. La discipline « Ranom » donnera une indication du signal anormal à différentes résolutions.
  2. Exécutez INUTILE42 et AIMLESS43 pour mettre à l’échelle les données. Dans AIMLESS, définissez le paramètre ANOMALOUS ON. Si l’interface graphique est utilisée, sélectionnez l’option Paires anormales séparées pour les statistiques de rejet et de fusion aberrantes. Il peut être nécessaire de tester différentes coupures de résolution pour maximiser le signal anormal.
  3. Résoudre la structure protéique à l’aide du pipeline automatisé de détermination de la structure cristalline Auto-Rickshaw44. Auto-Pousse-pousse tentera de résoudre le problème de phase et de construire la structure cristalline de la protéine automatiquement avec la modélisation des protéines et le logiciel de raffinement.
    1. Pour les protéines sans modèle de modèle d’homologie, exécutez le protocole SAD d’Auto-Rickshaw en mode avancé. Entrez les paramètres requis.
      1. Sélectionnez PROTÉINE comme type de molécule.
      2. Entrez la longueur d’onde de collecte de données dans angstroms (Å).
      3. Sélectionnez « I » comme élément de sous-structure pour indiquer que des atomes d’iode ont été utilisés.
      4. Sélectionnez « i3c » comme type de sous-structure pour indiquer que l’I3C était la molécule de phasing.
      5. Sélectionnez « sub_direct » comme méthode de détermination de la sous-structure. Cette méthode utilise SHELXD32 pour rechercher la sous-structure.
      6. Sélectionnez « 3 » comme nombre de sous-structures prévues par monomère.
      7. Entrez « 1 » comme seuil de résolution de la recherche de sous-structure. Cela permet à Auto-Rickshaw de déterminer automatiquement une coupure de résolution appropriée.
      8. Entrez le nombre de résidus dans un seul monomère, le groupe spatial de l’ensemble de données et le nombre de molécules dans l’unité asymétrique en fonction du coefficient de Matthews.
      9. Sélectionnez le niveau de diffusion approprié des données radiographiques qui conviennent aux besoins. La sélection des développeurs d’AutoRickshaw permettra aux développeurs d’Auto-Rickshaw de dépanner la course en cas de problème.
      10. Entrez les données anormales sous forme de fichier mtz.
      11. Entrez la séquence protéique sous forme de fichier seq, pir ou txt. Un fichier seq peut être généré dans un éditeur de texte (comme Notepad++9 sur Windows ou nano sous Linux). Créez un nouveau fichier, entrez la séquence primaire de la protéine sous forme d’une longue ligne ou séparez-le par des ruptures de ligne. Enregistrez le fichier avec l’extension de fichier .seq.
      12. Entrez une adresse e-mail institutionnelle.
  4. Les résultats sont livrés via un lien Web envoyé à l’adresse e-mail fournie.
    NOTE: AutoRickshaw est un pipeline automatisé qui invoque divers logiciels de cristallographie pour résoudre une structure cristalline à rayons X32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Si la course Auto-Rickshaw ne parvient pas à résoudre la structure, d’autres paramètres auto-pousse-pousse peuvent être testés. La méthode de détermination de la structure peut être modifiée en « sub_phassade » pour utiliser phaser59 au lieu de SHELXD32. Le nombre de sous-structures prévues par monomère peut également être augmenté ou diminué.
  5. Au cours de l’élimination progressive expérimentale de la structure cristalline, Auto-Rickshaw tentera de positionner les atomes lourds dans la cellule unitaire, créant ainsi une sous-structure. L’agencement trilatéral des atomes d’iode en I3C présente un moyen efficace de valider la sous-structure. Si l’étape 6.3 échoue, la validation de la sous-structure pourrait aider à résoudre la solution de structure de dépannage.
    1. Téléchargez la liste des sites d’atomes lourds à partir de la page de résultats Auto-Rickshaw. Il s’agit d’un lien hypertexte appelé « sites atome lourd ». Cela permettra de télécharger un fichier texte avec les sites d’atomes lourds.
    2. Modifiez l’extension de fichier du fichier de .txt à .pdb.
    3. Ouvrez le fichier PDB dans Coot60. Activez la symétrie pour voir d’autres atomes lourds provenant d’unités asymétriques voisines.
    4. Mesurer les distances entre les atomes lourds, y compris à travers les unités asymétriques. I3C apparaîtra comme un triangle équilatéral avec une longueur latérale de 6 angstroms. La présence d’un triangle avec ces dimensions indique que les emplacements de ces atomes lourds sont corrects.

Representative Results

L’intégration de l’I3C dans le SMMR peut générer de nouvelles conditions soutenant la croissance du cristal dérivatif
L’efficacité du criblage simultané de rMMS et de la dérivation d’I3C a été démontrée dans deux protéines, le lysozyme blanc d’oeuf de poule (HEWL, obtenu comme poudre lyophilisée) et le domaine putatif de N-terminal d’Orf11 (Orf11 NTD) du bactériophage P68. Chaque protéine a été examinée contre PEG/ION HT dans quatre conditions différentes, y compris : non ensemencée, ensemencée, non ensemencée avec I3C et ensemencée avec I3C (figure 1). Pour les deux protéines, le seul ajout d’I3C n’a pas augmenté le nombre de conditions propices à la cristallisation. Dans le cas d’Orf11 NTD, une seule condition appropriée a été identifiée avec et sans I3C (Figure 1B). Lorsque l’I3C a été ajouté aux écrans HEWL, le nombre de visites a été réduit de 31 à 26, mettant en évidence les complexités supplémentaires de la cristallisation lors de l’introduction de composés de phasing (Figure 1A). Conformément à d’autres études, l’ajout de semences aux écrans matriciels clairsemés commerciaux pour générer un écran rMMS a considérablement augmenté le nombre de conditions de cristallisation possibles pour les deux protéines, ce qui a entraîné une augmentation de 2,1 et 6 fois pour hewl et orf11 NTD,respectivement 6,61 ( figure1). Plus important encore, l’ajout simultané d’I3C et de graines a augmenté le nombre de visites par rapport à un écran non ensemencé, démontrant une augmentation de 2,3 et 7 fois pour HEWL et Orf11 NTD, respectivement. Beaucoup de cristaux de rMMS en présence d’I3C montrent une excellente morphologie cristalline (Figure 2).

L’ensemencement permet un contrôle attentif du nombre de cristaux dans les écrans RMMS I3C
Dans les expériences de microsédage, le nombre de graines introduites dans un essai de cristallisation peut être contrôlé par dilution du stock de graines, ce qui permet un contrôle précis de la nucléation dansla chute 7,36. Cela permet souvent la forme de cristaux plus gros puisqu’il y a une concurrence réduite des molécules protéiques sur les sites de nucléation. Cet avantage s’étend également à la méthode I3C-rMMS et a été démontré avec succès dans HEWL et Orf11 NTD. La reconstitution d’une condition de cristallisation identifiée à partir de l’écran I3C-rMMS avec un stock de graines diluées a donné moins de cristaux, mais plus gros (figure 3).

L’élimination progressive sad peut être utilisée pour résoudre les structures à partir de cristaux dérivés de l’écran RMMS I3C
Les cristaux cultivés à l’aide du stock de graines diluées indiqué à la figure 3 ont été utilisés pour résoudre la structure des protéines à l’aide de l’élimination progressive du TAS à l’aide de données de diffraction à partir d’un seul cristal (figure 4). Les données ont été recueillies sur la ligne de faisceau Synchrotron MX1australienne 62. Des détails détaillés de la collecte de données et de la solution de structure sontdécrits ailleurs 27.

Figure 1
Figure 1 - RMMS a été utilisé pour générer de nouvelles conditions de croissance du cristal en présence d’I3C pour deux protéines d’essai. 96 écrans de cristallisation de diffusion de vapeur de puits ont été effectués à l’aide d’écrans matriciels clairsemés commerciaux. (A) Lysozyme blanc d’œuf de poule a été testé avec l’écran Index HT. Les plateaux ont été ensemencés avec des cristaux HEWL cultivés en 0,2 M ammonium tartrate dibasic pH 7,0, 20% (w/v) polyéthylène glycol 3350. (B) Orf11 NTD du bactériophage P68 a été testé avec l’écran PEG/ION. Les plateaux Orf11 NTD ont été ensemencés à partir de cristaux de l’état G12 de l’écran non ensemencé, montré en bleu. Les conditions soutenant la croissance du cristal sont indiquées en rouge. l’ensemencement rMMS en présence et en l’absence d’I3C a donné beaucoup plus de coups de cristal que les plateaux non ensemencés. Figure adaptée de Truong et coll.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 - Images représentatives de cristaux cultivés à partir des essais de diffusion de vapeur montrés à la figure 1 (a) et (b). Figure adaptée de Truong et coll.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 - La dilution du stock de graines est un moyen efficace de réduire la nucléation dans un état de cristallisation trouvé en utilisant la méthode I3C-rMMS, pour contrôler le nombre de cristaux qui se forment. La réduction de la nucléation à l’intérieur d’une goutte entraîne souvent la croissance des cristaux vers de plus grandes dimensions. Figure adaptée de Truong et coll.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) et HEWL (PDB ID 6PBB) ont été cristallisés à l’aide de la méthode I3C-rMMS et résolus à l’aide de l’auto-pousse-pousse SAD phasing. (A) Structures de ruban de HEWL et Orf11 NTD résolu par l’élimination progressive expérimentale. (B) Molécule I3C liée à HEWL et Orf11 NTD. (C) Des atomes d’iode anormaux en I3C sont disposés dans un triangle équilatéral de 6 Å. Ainsi, la présence de ce triangle dans la sous-structure progressive indique qu’il y a une molécule I3C dans cette position. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

La détermination de structure d’une protéine nouvelle en l’absence d’un modèle approprié d’homologie pour le remplacement moléculaire exige l’élimination progressive expérimentale. Ces méthodes nécessitent l’incorporation d’atomes lourds dans le cristal protéique, ce qui ajoute un niveau de complexité au pipeline de détermination de la structure et peut introduire de nombreux obstacles qui doivent être abordés. Les atomes lourds peuvent être incorporés directement dans la protéine par l’expression étiquetée utilisant la sélénomethionine et la selénocystéine. Comme cette méthode est coûteuse, laborieuse et peut entraîner des rendements protéiques inférieurs, les protéines étiquetées sont souvent exprimées après que des conditions de cristallisation ont été trouvées et optimisées avec des protéines non étiquetées. Alternativement, les cristaux peuvent être dérivés en trempant dans une solution contenant des atomes lourds22,63,64. Cette méthode utilise souvent des cristaux de haute qualité et est donc effectuée après qu’une méthode de cristallisation robuste a déjà été développée. L’obtention réussie d’un cristal dérivatisé à l’aide de cette méthode nécessite une optimisation plus continue des procédures de trempage et le criblage de différents composés de phasage, ajoutant ainsi plus de temps à un processus déjà laborieux.

La co-cristallisation de la protéine avec l’atome lourd peut être effectuée au stade de criblage, rationalisant ainsi efficacement le processus et réduisant les étapes de manipulation du cristal qui peuvent causer des dommages. Cependant, il existe toujours le scénario potentiel d’obtenir peu de coups de cristallisation initiale et le problème de choisir un composé atome lourd compatible. De nombreux composés de phasage actuellement disponibles sont incompatibles avec les précipités, les tampons et les additifs couramment trouvés dans les conditions de cristallisation. Ils peuvent être insolubles dans les tampons de sulfate et de phosphate, chélate au citrate et à l’acétate, réagir défavorablement avec des tampons HEPES et Tris ou être séquestrés par la TNT et le β-mercaptoéthanol21. Comme le composé de phasage I3C ne souffre pas de ces incompatibilités, c’est un composé robuste de phasing qui pourrait être aimable à beaucoup de conditions différentes.

Dans cette étude, une méthode simplifiée de production de cristaux dérivatisés prêts pour le TSO progressivement par co-cristallisation simultanée du composé de phasage I3C et du RMMS est présentée. La combinaison des deux techniques augmente le nombre de coups de cristallisation, avec beaucoup de conditions ayant amélioré la morphologie et les caractéristiques de diffraction. Dans les cas d’essai orf11 NTD et HEWL, de nouvelles conditions dans l’écran I3C-rMMS ont été identifiées qui étaient absentes quand I3C n’était pas présent. Potentiellement, I3C peut se lier favorablement à la protéine, facilitant la formation et la stabilisation des contacts en cristal27. À son tour, cela peut induire la cristallisation et peut-être améliorer les caractéristiques de diffraction. En plus d’être un composé compatible avec des écrans matriciels clairsemés, I3C est également un composé attrayant de phasing en raison de ses propriétés intrinsèques. Les groupes fonctionnels qui alternent avec l’iode sur l’échafaudage aromatique permettent une liaison spécifique aux protéines. Cela conduit à une plus grande occupation et réduit potentiellement le signal d’arrière-plan23. De plus, l’agencement de disperseurs anormaux dans un triangle équilatéral est évident dans la sous-structure et peut être utilisé pour valider rapidement la liaison de l’I3C(figure 4B et 4C). Enfin, il peut produire un signal anormal avec le rayonnement synchrotron tunable ainsi que le chrome et le cuivre tournant anode X-ray sources. Ainsi, il peut être appliqué à de nombreux workflows différents. Comme i3C est largement disponible et peu coûteux à acheter, cette approche est à portée de main pour la plupart des laboratoires de biologie structurelle.

Il y a plusieurs considérations expérimentales qui doivent être abordées lors de l’utilisation de la méthode I3C-rMMS. Cette méthode ne peut pas être appliquée si le matériau cristallin initial de la protéine ne peut pas être obtenu. Dans les cas difficiles, des matériaux cristallins provenant d’une protéine homologue peuvent également être utilisés pour générer des stocks de semences. Cette approche d’ensemencement croisé à rMMS a montré quelques résultatsprometteurs 7. L’optimisation du nombre de cristaux par dilution du stock de semences est une étape cruciale, qu’il ne faut pas négliger, afin de maximiser les chances de produire de gros cristaux de haute qualité et d’acquérir des données de diffraction appropriées. S’il y a peu de sites I3C identifiés dans l’unité asymétrique, les conditions propices à la cristallisation devraient être encore optimisées avec une concentration accrue d’I3C. Cela peut augmenter l’occupation de l’I3C afin de maximiser le signal anormal et faciliter la dérivation des cristaux.

Il peut y avoir des cas où cette technique peut ne pas être la méthode optimale pour dérivatiser les cristaux de protéines. À mesure que la taille d’une protéine ou d’un complexe protéique augmente, le nombre limité de sites I3C à la surface des protéines peut ne pas fournir suffisamment de puissance d’élimination progressive pour résoudre la structure. Dans ces scénarios où l’on soupçonne que la taille des protéines entrave l’élimination progressive, l’étiquetage de la protéine par la sélénomethionine peut être une approche plus viable pour éliminer progressivement la protéine. Si la protéine a un nombre suffisant de résidus de méthionine dans la protéine (recommandé d’avoir au moins une méthionine pour 100 résidus65) et l’incorporation de sélénomethionine à haut rendement dans une protéine peut être atteint (comme dans les systèmes d’expressionbactérienne 66), plusieurs atomes de sélénium à occupation élevée seront présents dans les cristaux pour phaser la structure.

En outre, certaines protéines peuvent intrinsèquement ne pas être adaptées à la dérivation avec I3C. Les sites de liaison I3C sur les protéines dépendent de la structure protéique. Il peut exister des protéines qui ont naturellement peu de patchs exposés compatibles avec la liaison I3C. Par conséquent, il n’est pas imprévisible qu’il puisse y avoir des difficultés à co-cristalliser certaines protéines cibles avec l’I3C.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été entreprise sur la ligne de faisceau MX1 du Synchrotron australien, qui fait partie de l’ANSTO. Les auteurs aimeraient remercier les membres des laboratoires Shearwin et Bruning pour leurs discussions sur ces travaux. Les auteurs aimeraient également remercier le Dr Santosh Panjikar et la Dre Linda Whyatt-Shearwin qui ont contribué aux travaux originaux qui ont été à l’origine de ce protocole.

Le financement suivant est reconnu : Australian Research Council (subvention Nos. DP150103009 et DP160101450 à Keith E. Shearwin); Bourse d’études de l’Université d’Adélaïde (Australian Government Research Training Program à Jia Quyen Truong et Stephanie Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL disposable luer lock syringes Adelab Scientific T3SS10LAT Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells
24 well tissue culture plate Sigma Aldrich CLS3527 Used for hanging drop crystal tray
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506 For 96 well crystallization screens set up by robot
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid Alfa Aesar B22178 Commonly referred to as I3C in the article
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original Hampton Research HR3-297 For 96 well crystallization screens set up by robot
Coverslips  Thermo Fisher Scientific 18X18-2 Coverslips for hanging drop crystal tray wells
Dow Corning vacuum grease Hampton Research HR3-510 Used for sealing hanging drop crystal tray wells
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL Eppendorf 3120000011
Gilson Pipette 2 μL-20 μL John Morris Group 1153247
Gilson Pipette 20 μL-200 μL John Morris Group 1152006
Glass pasteur pipettes Adelab Scientific HIR92601.01
Hen Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Approximately 95% pure
IndexHT screen Hampton Research HR2-134
Microscope illuminator Meiji Techno FT192/230 Light source to illuminate crystallography experiments
PEG/ION HT screen Hampton Research HR2-139
Phoenix Liquid Dispenser Art Robbins Instruments 602-0001-10
Scalpel with scalpel blade no. 15 Adelab Scientific LV-SMSCPO15
Seed bead kit Hampton Research HR2-320 Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.
Stereo microscope  Meiji Techno EMZ-5TR Microscope for visualising crystallography experiments
Tweezers Sigma-Aldrich T5415
Vortex mixer Adelab Scientific RAVM1

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References

  1. Zheng, H., Hou, J., Zimmerman, M. D., Wlodawer, A., Minor, W. The future of crystallography in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (2), 125-137 (2014).
  2. Oakley, A. J., Wilce, M. C. J. Macromolecular crystallography as a tool for investigating drug, enzyme and receptor interactions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 27 (3), 145-151 (2000).
  3. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling. A screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24, pt 4 409-411 (1991).
  4. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- To medium-sized academic laboratories: The PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1426-1431 (2005).
  5. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  6. D'Arcy, A., Villard, F., Marsh, M. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (4), 550-554 (2007).
  7. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  8. Taylor, G. The phase problem. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (11), 1881-1890 (2003).
  9. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A. 46 (2), 73-82 (1990).
  10. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  11. Millán, C., Jiménez, E., Schuster, A., Diederichs, K., Usón, I. ALIXE: a phase-combination tool for fragment-based molecular replacement. Acta Crystallographica Section D. 76 (3), 209-220 (2020).
  12. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: Recent developments in Phenix. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  13. Abergel, C. Molecular replacement: Tricks and treats. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (11), 2167-2173 (2013).
  14. Pröpper, K., et al. Structure solution of DNA-binding proteins and complexes with ARCIMBOLDO libraries. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (6), 1743-1757 (2014).
  15. Rodríguez, D. D., et al. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature Methods. 6 (9), 651-653 (2009).
  16. Bibby, J., Keegan, R. M., Mayans, O., Winn, M. D., Rigden, D. J. AMPLE: A cluster-and-truncate approach to solve the crystal structures of small proteins using rapidly computed ab initio models. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (12), 1622-1631 (2012).
  17. Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287-307 (1954).
  18. Blow, D. M., Rossmann, M. G. The single isomorphous replacement method. Acta Crystallographica. 14 (11), 1195-1202 (1961).
  19. Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 115, 90-112 (1985).
  20. Hendrickson, W. A. Determination of macromolecular structures from anomalous diffraction of synchrotron radiation. Science. 254 (5028), 51-58 (1991).
  21. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
  22. Dauter, Z., Dauter, M., Rajashankar, K. R. Novel approach to phasing proteins: Derivatization by short cryo-soaking with halides. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (2), 232-237 (2000).
  23. Beck, T., Krasauskas, A., Gruene, T., Sheldrick, G. M. A magic triangle for experimental phasing of macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (11), 1179-1182 (2008).
  24. Beck, T., Gruene, T., Sheldrick, G. M. The magic triangle goes MAD: Experimental phasing with a bromine derivative. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 374-380 (2010).
  25. Beck, T., Da Cunha, C. E., Sheldrick, G. M. How to get the magic triangle and the MAD triangle into your protein crystal. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (10), 1068-1070 (2009).
  26. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. , (2000).
  27. Truong, J. Q., Panjikar, S., Shearwin-Whyatt, L., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Combining random microseed matrix screening and the magic triangle for the efficient structure solution of a potential lysin from bacteriophage P68. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (7), 670-681 (2019).
  28. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: The PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 582-601 (2009).
  29. Holton, J., Alber, T. Automated protein crystal structure determination using ELVES. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (6), 1537-1542 (2004).
  30. Skubák, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4, (2013).
  31. Sheldrick, G. M. Crystal structure refinement with SHELXL. Acta Crystallographica Section C: Structural Chemistry. 71, 3-8 (2015).
  32. Schneider, T. R., Sheldrick, G. M. Substructure solution with SHELXD. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1772-1779 (2002).
  33. Sheldrick, G. M. Macromolecular phasing with SHELXE. Zeitschrift fur Kristallographie. 217 (12), 644-650 (2002).
  34. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature Protocols. , (2007).
  35. Beck, T. Sticky triangles New tools for experimental phasing of biological macromolecules. , (2010).
  36. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  37. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29, 584-587 (1996).
  39. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  40. Garcia-Bonete, M. J., Katona, G. Bayesian machine learning improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 75, 851-860 (2019).
  41. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  44. Panjikar, S., Parthasarathy, V., Lamzin, V. S., Weiss, M. S., Tucker, P. A. Auto-Rickshaw: An automated crystal structure determination platform as an efficient tool for the validation of an X-ray diffraction experiment. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (4), 449-457 (2005).
  45. Jones, T. A., Thirup, S. Using known substructures in protein model building and crystallography. The EMBO journal. 5 (4), 819-822 (1986).
  46. Kleywegt, G. J., Jones, T. A. Template convolution to enhance or detect structural features in macromolecular electron-density maps. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (2), 179-185 (1997).
  47. Perrakis, A., Morris, R., Lamzin, V. S. Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nature Structural Biology. 6 (5), 458-463 (1999).
  48. Morris, R. J., et al. Breaking good resolutions with ARP/wARP. Journal of Synchrotron Radiation. 11 (1), 56-59 (2004).
  49. Yao, D. Q., et al. SAD phasing by OASIS-2004: Case studies of dual-space fragment extension. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 883-890 (2006).
  50. Hao, Q. ABS: A program to determine absolute configuration and evaluate anomalous scatterer substructure. Journal of Applied Crystallography. 37 (3), 498-499 (2004).
  51. Collaborative Computational Project Number 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  52. Sheldrick, G. M., Hauptman, H. A., Weeks, C. M., Miller, R., Usón, I. Ab initio phasing. International Tables for Crystallography. , 333-345 (2006).
  53. Smith, G. D. Matching selenium-atom peak positions with a different hand or origin. Journal of Applied Crystallography. 35 (3), 368-370 (2002).
  54. Pannu, N. S., McCoy, A. J., Read, R. J. Application of the complex multivariate normal distribution to crystallographic methods with insights into multiple isomorphous replacement phasing. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (10), 1801-1808 (2003).
  55. Pannu, N. S., Read, R. J. The application of multivariate statistical techniques improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (1), 22-27 (2004).
  56. De La Fortelle, E., Bricogne, G. Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods in Enzymology. 276, 472-494 (1997).
  57. Cowtan, K. Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein. Crystallography. 31, 34-38 (1994).
  58. Terwilliger, T. C. Maximum-likelihood density modification. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (8), 965-972 (2000).
  59. Read, R. J., McCoy, A. J. Maximum-likelihood determination of anomalous substructures. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2018).
  60. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  61. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. Journal of visualized experiments JoVE. (78), e50548 (2013).
  62. McPhillips, T. M., et al. Blu-Ice and the distributed control system: Software for data acquisition and instrument control at macromolecular crystallography beamlines. Journal of Synchrotron Radiation. 9 (6), 401-406 (2002).
  63. Nagem, R. A. P., Polikarpov, I., Dauter, Z. Phasing on Rapidly Soaked Ions. Methods in Enzymology. 374, 120-137 (2003).
  64. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  65. Hendrickson, W. A., Ogata, C. M. Phase determination from multiwavelength anomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology. 276, 494-523 (1997).
  66. Doublié, S. Production of Selenomethionyl Proteins in Prokaryotic and Eukaryotic Expression Systems. Macromolecular Crystallography Protocols. Methods in Molecular Biology. , 91-108 (2007).

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Biochimie numéro 167 ensemencement criblage aléatoire de matrice de microsémés rMMS cristallographie de protéine phasing triangle magique I3C
Dérivation des cristaux protéiques avec I3C à l’aide du criblage aléatoire de matrice microséeed
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Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (167), e61894, doi:10.3791/61894 (2021).

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