Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

البراز (الصغير) عزل الحمض النووي الريبي

Published: October 28, 2020 doi: 10.3791/61908
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

Summary

يعزل هذا البروتوكول الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من عينات البراز من الحيوانات والبشر. يتم استخدام مجموعة عزل miRNA التجارية مع تكيف كبير لعزل الحمض النووي الريبي النقي بكمية وجودة محسنة. تعتبر عزلات الحمض النووي الريبي جيدة لمعظم فحوصات الحمض النووي الريبي النهائية مثل التسلسل والمصفوفات الدقيقة و RT-PCR.

Abstract

أصبح من الواضح أن الحمض النووي الريبي موجود في تجويف الأمعاء والبراز في الحيوانات والبشر. يعزل البروتوكول الموصوف أدناه إجمالي الحمض النووي الريبي بما في ذلك الحمض النووي الريبي الميكروي من عينات البراز من الحيوانات والبشر. الهدف هو عزل الحمض النووي الريبي الكلي بنقاوة وكمية عالية للتحليلات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، RT-PCR ، والمصفوفات الدقيقة. تتمثل مزايا هذا البروتوكول الأمثل في عزل miRNA في قدرات عزل منتجات الحمض النووي الريبي عالية النقاء مع خطوات غسيل إضافية موصوفة ، وزيادة كمية الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بطريقة محسنة في إعادة تعليق العينة ، ونصائح مهمة لإزالة التلوث. أحد القيود هو عدم القدرة على معالجة وتنقية عينة أكبر من أكثر من 200 ملغ لأن أحجام العينات هذه قد تسبب صعوبة في التكوين الواضح للطور البيني. وبالتالي ، فإن حجم العينة الكبير قد يلوث المرحلة المائية المراد استخراجها كما هو موضح في البروتوكول مع المواد العضوية التي تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي المعزول في النهاية. ومع ذلك ، فإن عزلات الحمض النووي الريبي من عينة تصل إلى 200 ملغ كافية لمعظم التحليلات النهائية.

Introduction

يتم التعرف على الحمض النووي الريبي خارج الخلية كعامل مهم يتوسط العديد من العمليات البيولوجية1. تم الإبلاغ عن الحمض النووي الريبي خارج الخلية في البراز لأول مرة في عام 2008 كعلامة لسرطان القولون والتهاب القولون التقرحيالنشط 2 ، وتم الكشف عنه مؤخرا كمكون طبيعي لتجويف الأمعاء والبراز ويتوسط اتصالات ميكروب المضيف3،4،5. الغرض من بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي هذا هو استخراج الحمض النووي الريبي خارج الخلية عالي الجودة من عينات البراز التي تم جمعها من الحيوانات والبشر. تم تكييف البروتوكول من مجموعة عزل miRNA التجارية. يتم استخدام الحمض النووي الريبي المكتسب لتحليلات المصب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، RT-PCR ، والمصفوفات الدقيقة. يتضمن البروتوكول العديد من النصائح المهمة والمفيدة لتعظيم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي الموجود في براز الحيوانات والبشر. السبب في تطوير وتحسين هذه الطريقة لعزل الحمض النووي الريبي (بما في ذلك microRNA) هو تقليل الحمض النووي الريبي الميكروبي في البراز ، والحد من المتغيرات في الدراسات البحثية وتحليل تكوين الحمض النووي الريبي في الأمعاء دون حساب مختلف العوامل المربكة ومصادر التلوث. تجدر الإشارة إلى أن عزل الحمض النووي الريبي هذا يقلل من إطلاق الحمض النووي الريبي من الخلايا الحية والميكروبات الحية (الحمض النووي الريبي الخلوي). وهو يركز على الحمض النووي الريبي خارج الخلية التي تم إطلاقها بواسطة خلايا الأمعاء أو تم الحصول عليها عن طريق تناول الطعام. بشكل أساسي ، هذه الطريقة ليست مناسبة للدراسات التي يتم فيها فحص النسخ الميكروبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق التي تنطوي على البحث الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في مستشفى بريغهام والنساء ، كلية الطب بجامعة هارفارد.

تتوافق جميع الطرق التي تتضمن موضوعات البحث البشري الموضحة هنا مع الإرشادات التي وضعتها لجنة الأبحاث البشرية للشركاء.

1. جمع عينات البراز

  1. الأوتوكلاف أو إعداد أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وخالي من النيوكلياز سعة 2 مل مع غطاء لولبي لكل موضوع في التجربة.
    1. بالنسبة للبشر ، قم بتوفير جهاز جمع عينات براز مناسب وخالي من النيوكلياز ومعقم لكل موضوع.
  2. جمع 25-100 ملغ (حوالي 1-4 كريات برازية لعينات براز الفأر) من عينات البراز من كل موضوع حيواني في بيئة معقمة.
    ملاحظة: يفضل استخدام اثنين أو أكثر من الكريات البرازية (~ 50 مجم أو أثقل) للحصول على الحمض النووي الريبي من أعلى درجة نقاء.
    1. استخدم جميع معدات ومواد الحماية الشخصية اللازمة ، على سبيل المثال: زوج من قفازات المختبر ، ورذاذ مطهر ومنشفة ورقية معقمة ، لتعقيم منطقة العمل ، حيث يتم وضع موضوع البحث الحيواني ، لتجنب تلوث عينة البراز.
      1. بالنسبة للبشر ، اطلب من كل موضوع بحث / جامع جمع جمع 100-200 مجم من عينات البراز في بيئة معقمة قدر الإمكان. استخدم عملية معقمة قياسية وتجنب تلوث عينة البراز.
  3. اجمع عينات البراز من كل مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مع غطاء لولبي دون لمس أي أسطح أخرى لتجنب التلوث.
    1. بالنسبة للبشر ، اطلب من كل شخص التبرز مباشرة في جهاز جمع قابل للتطبيق (على سبيل المثال ، مجموعة جمع عينات البراز المعقمة) لتجنب التلوث.
      ملاحظة: اطلب من الخاضعين لتجنب التلوث بأسطح المراحيض أو الماء أو البول أو أي أسطح / أشياء أخرى غير معقمة.
  4. قم بتجميد عينات البراز التي تم جمعها في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل على الفور عند -80 درجة مئوية أو ضعها في دلو من الثلج الجاف للحصول على كمية ونوعية أفضل من الحمض النووي الريبي قبل إعادة تعليق البراز كما هو موضح في الخطوات أدناه.
    1. بالنسبة لعينات البراز البشري ، قم بتقسيم كل عينة جديدة من 200 مجم في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل مع أغطية لولبية وقم بتجميدها عند -80 درجة مئوية قبل إعادة تعليق البراز كما هو موضح أدناه.
      1. لتخزين عينات البراز غير الموجودة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل مع أغطية لولبية ، قم بوزن ونقل 100-200 مجم لكل من العينات المجمدة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة 2 مل مع أغطية لولبية قبل إعادة تعليق البراز كما هو موضح أدناه.
        ملاحظة: بالنسبة لعينات البراز البشري ، تجنب أخذ أكثر من 200 مجم من عينات البراز لعزل الحمض النووي الريبي لأنه قد يسبب صعوبات في الخطوات التالية. مع وجود عينة محملة بشكل زائد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل ، قد لا يتم تشكيل الطور المائي والطور العضوي والطور البيني وفصلها بوضوح. يمكن إيقاف الإجراء مؤقتا هنا.

2. الاستعدادات لحلول الغسيل

  1. أضف 21 مل من الإيثانول بدرجة 100٪ من الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS) إلى محلول الغسيل 1 المتوفر في مجموعة عزل miRNA (انظر جدول المواد) للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 30 مل ، كما هو موضح على الزجاجة. دوامة حتى يذوب كل شيء في الزجاجة.
  2. أضف 40 مل من الإيثانول بدرجة ACS بنسبة 100٪ إلى محلول الغسيل 2/3 المقدم للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 50 مل ، كما هو موضح على الزجاجة. دوامة لمدة 5 ثوان أو حتى يمتزج الخليط النهائي جيدا.

3. تحضير المعدات والمواد

  1. رش منطقة العمل والمعدات ، على سبيل المثال: مقعد المختبر ، ومنطقة العمل في غطاء الدخان الكيميائي ورفوف أنبوب الطرد المركزي الصغير ، بمحلول إزالة التلوث Ribonuclease (RNase) (على سبيل المثال ، محلول إزالة التلوث RNase المتاح تجاريا). لتجنب التلوث ، ضعه بمحلول إزالة التلوث RNase على الأسطح أينما ومتى لزم الأمر.
  2. ارتد معطفا مختبريا نظيفا ، وارتد قناعا للوجه ، وارتد قفازات المختبر المناسبة لحماية الحمض النووي الريبي في عينات البراز من النيوكليازات الموجودة على جلد الإنسان. رش القفازات بمحلول إزالة التلوث RNase وقم بتغيير القفازات بشكل متكرر لتجنب التلوث.
  3. قم بإعداد دلو من الثلج الجاف لعينات البراز المخزنة في -80 درجة مئوية لمنع الذوبان قبل إعادة تعليق البراز ودلو من الثلج للمواد ، على سبيل المثال: حمض الفينول: الكلوروفورم ، لإطالة العمر الافتراضي.
    ملاحظة: تأكد من أن المواد بما في ذلك الوسائط المستخدمة في البروتوكول معقمة دون تلوث النيوكليازات.

4. إعادة تعليق البراز

  1. إعادة تعليق 25-100 ملغ من عينات البراز في 600 ميكرولتر من محلول ملحي معقم 1x Dulbecco مخزن بالفوسفات (DPBS).
    تنبيه: يجب معالجة عينات البراز على الفور عند إذابتها من -80 درجة مئوية دون حتى ذوبان جزئي لتقليل إطلاق RNases والحمض النووي الريبي الخلوي حيث تمزق بلورات الثلج المقصورات الخلوية الداخلية والخارجية عند ذوبان الخلايا في العينة.
    1. أضف 600 ميكرولتر من 1x DPBS إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل مع غطاء لولبي يحتوي على عينات برازية في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. احتضان خليط من عينات البراز المغمورة في 600 ميكرولتر من 1x DPBS في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 2 مل المغطى لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. أعد تعليق الخليط عن طريق الهرس بطرف ماصة سعة 1 مل ودوامة جيدة مع تغطية أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل. لتحسين وزيادة كمية ونوعية الحمض النووي الريبي ، أعد تعليق الخليط باستخدام الخالط مع الإعداد لدورة واحدة عند S4000 (أو 4000 دورة في الدقيقة) و 45 ثانية.

5. استخراج العضوية

تنبيه: استخدم غطاء الدخان الكيميائي الخطير للخطوات التالية حتى الخطوة 6 باستخدام حمض الفينول: الكلوروفورم والإيثانول بدرجة ACS بنسبة 100٪ بسبب سميتها وقابليتها للاشتعال. قم بتغيير معدات الوقاية الشخصية حسب الحاجة واتبع الاحتياطات القياسية المناسبة عند التعامل مع المواد الخطرة.

  1. استخراج الحمض النووي الريبي مع 600 ميكرولتر من حمض الفينول: الكلوروفورم (حجم حمض الفينول: الكلوروفورم المطلوب يساوي الحجم الأولي ل 1x DPBS المضافة في الخطوة 4.1).
    1. أضف 600 ميكرولتر من حمض الفينول: الكلوروفورم إلى المعلق من الخطوة 4.1.
      ملاحظة: سحب حمض الفينول: الكلوروفورم من المرحلة السفلية في الزجاجة حيث يتم خلط المرحلة العليا مع مخزن مؤقت مائي. إذا تم إزعاج الطور البيني بين هاتين المرحلتين ، فانتظر واسحب حمض الفينول: الكلوروفورم فقط عندما يعيد الطور البيني تأسيس نفسه لتجنب التلوث.
  2. دوامة الخليط لمدة 60 ثانية لخلط جيدا. بدلا من ذلك ، لتحسين وزيادة كمية الحمض النووي الريبي في المحصول ، امزج باستخدام الخالط مع الإعداد لدورة واحدة عند S4000 و 45 ثانية.
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 10000 × جم في RT لفصل المراحل المائية والعضوية باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق. بعد الطرد المركزي ، يجب أن يكون الطور البيني مضغوطا. إذا لم يكن كذلك ، كرر الطرد المركزي.
    ملاحظة: إذا لم يكن من الممكن أن يكون الطور البيني مضغوطا كما هو مرغوب فيه ربما بسبب النسبة غير المتساوية للحجم الأولي إلى حجم حمض الفينول المضاف: الكلوروفورم بعد عدة تكرارات للطرد المركزي ، فتابع استعادة المرحلة المائية بعناية أكبر لتجنب التلوث.
  4. استرجع المرحلة المائية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2 مل مع غطاء مفصلي (لا توفره مجموعة عزل miRNA).
    1. قم بإزالة المرحلة المائية (أو العلوية) بعناية دون إزعاج المرحلة السفلية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2 مل مع غطاء مفصلي. لاحظ الحجم المنقول (على سبيل المثال ، ~ 500 ميكرولتر).
      ملاحظة: عندما يكون الطور البيني مضغوطا ويتم فصل المرحلة العليا بوضوح ، فمن المحتمل أن يكون هناك عدد قليل من الجسيمات المتبقية الصغيرة التي تطفو على الجزء العلوي من الطور المائي. ماصة بعناية لتجنب هذه البقايا واستعادة المرحلة المائية المنفصلة بشكل واضح وواضح فقط لضمان جودة إنتاج الحمض النووي الريبي ، حتى لو لم تتمكن من الحصول إلا على حجم صغير من المرحلة المائية.

6. عزل الحمض النووي الريبي النهائي

  1. أضف 1.25 حجما من الإيثانول RT ACS بدرجة 100٪ إلى الطور المائي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل (على سبيل المثال ، أضف 625 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إذا تم استرداد 500 ميكرولتر من الطور المائي من الخطوة 5.4.). دوامة 3 ثوان.
  2. قم بتحميل خليط الطور المائي / الإيثانول من خلال خرطوشة المرشح المتوفرة في مجموعة عزل miRNA.
    1. لكل عينة ، ضع خرطوشة المرشح في أحد أنابيب التجميع التي توفرها المجموعة.
      1. ماصة وتحميل 600 ميكرولتر من خليط الطور المائي / الإيثانول في خرطوشة المرشح.
        ملاحظة: دوامة الخليط لفترة وجيزة لخلط الإيثانول تماما مع الطور المائي قبل سحب العينات. لا يمكن تحميل أكثر من 700 ميكرولتر من خليط الطور المائي / الإيثانول في المرة الواحدة.
    2. جهاز طرد مركزي بسرعة 10000 × جم لمدة 90 ثانية للتصفية من خلال الخليط. قد يؤدي الدوران بسرعة أعلى إلى تلف الفلتر.
    3. تخلص من الراشح وكرر الخطوات من 6.2.1 إلى 6.2.2 حتى يتم ترشيح كل الخليط من خلال نفس غشاء المرشح في تطبيقات متتالية. احتفظ بنفس أنبوب التجميع وأعد استخدامه لخطوات الغسيل أدناه.
    4. اغسل الفلتر ب 700 ميكرولتر من محلول غسيل miRNA 1.
      تنبيه: يحتوي محلول غسيل miRNA 1 على ثيوسيانات الجوانيدين التي يمكن أن تسبب تهيج الجلد وتلف العين الخطير. ارتداء معدات الوقاية الشخصية اللازمة ، على سبيل المثال: قفازات ، درع الوجه ، معطف مختبر واقي. قم بتغيير القفازات بشكل متكرر حسب الضرورة.
      1. ضع 700 ميكرولتر من محلول غسيل miRNA 1 ، محلول العمل المحضر بالإيثانول 100٪ من درجة ACS ، في خرطوشة الفلتر.
      2. جهاز طرد مركزي لمدة 60 ثانية لتصفية محلول غسيل miRNA 1 من خلال خرطوشة الفلتر.
      3. تخلص من المرشح من أنبوب التجميع وضع نفس خرطوشة المرشح في نفس أنبوب التجميع.
    5. اغسل الفلتر بمحلول الغسيل 2/3 مرة واحدة لكل منها بأحجام 700 ميكرولتر و 500 ميكرولتر و 250 ميكرولتر على التوالي.
      1. ضع 700 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 ، محلول العمل المحضر بالإيثانول 100٪ من درجة ACS ، في خرطوشة المرشح.
        1. جهاز طرد مركزي بسرعة 10000 × جم لمدة 1 دقيقة.
        2. تخلص من المرشح من أنبوب التجميع وضع نفس خرطوشة المرشح في نفس أنبوب التجميع.
      2. ضع 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 في خرطوشة الفلتر.
        1. جهاز طرد مركزي بسرعة 10000 × جم لمدة 1 دقيقة.
        2. تخلص من المرشح من أنبوب التجميع وضع نفس خرطوشة المرشح في نفس أنبوب التجميع.
      3. ضع 250 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 في خرطوشة الفلتر.
        1. جهاز طرد مركزي بسرعة 10000 × جم لمدة 1 دقيقة.
        2. تخلص من الراشح من أنبوب التجميع.
      4. انقل خرطوشة الفلتر إلى أنبوب تجميع جديد وقم بتدوير المجموعة لمدة 5 دقائق لإزالة السائل المتبقي من الفلتر.

7. Elute RNA مع 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز

  1. انقل خرطوشة المرشح إلى أنبوب تجميع جديد. ماصة 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى مركز المرشح وغطاء أنبوب التجميع.
    1. احتضان في RT لمدة 10 دقائق.
    2. قم بالدوران لمدة 5 دقائق بسرعة 8000 × جم لاستعادة الحمض النووي الريبي في أنبوب التجميع الجديد.
    3. تحديد تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي البراز المستعاد باستخدام مقياس الفلور. يمكن تخزين الحمض النووي الريبي البرازي المستعاد عند -80 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم عزل الحمض النووي الريبي التمثيلي من عينات براز الفئران 50 ملغ (2 كريات براز الفئران) و 100 ملغ من عينات البراز البشري على التوالي واستخلصت في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. يشير تحليل مقياس الطيف الضوئي للتركيز إلى عزل كمية إجمالية قدرها 49 ميكروغرام و 16 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي على التوالي (الجدول 1). كانت نقاء الحمض النووي الريبي عالية كما هو موضح بنسبة A260 / A280 ~ 2.0 ونسبة A260 / A230 ~ 1.8 (الجدول 1). كما ورد في3 ، فإن غالبية الحمض النووي الريبي في البراز هي microRNA ويمكن أن توجد تلك microRNAs في exosome. واتساقا مع ذلك، يشير اختبار الرحلان الكهربائي القائم على الرقاقة للحمض النووي الريبي إلى أن عزلات الحمض النووي الريبي التمثيلية من براز الفأر والإنسان منخفضة أو تفتقر إلى تركيبات الحمض النووي الريبي 18S و 28S، ويقع حجم عزلات الحمض النووي الريبي في منطقة الحمض النووي الريبي الصغيرة (الشكل 1 أ). يكشف رحلان كهربائي صغير آخر للحمض النووي الريبي مع الرحلان الكهربائي القائم على الرقاقة أن جزءا كبيرا من الحمض النووي الريبي بحجم microRNA (الشكل 1B). هذا يتفق مع ملاحظة أن القياس الكمي المكتمل باستخدام محلل حيوي صغير للحمض النووي الريبي يمكن مقارنته بتلك التي تم الحصول عليها مع المقايسات السابقة6.

معرف العينة حجم الشطف (ميكرولتر) تركيز الحمض النووي الريبي (نانوغرام / ميكرولتر) أ 260/أ280 أ 260/أ230 العائد (نانوغرام)
فأر 50 978.333 2.036 1.897 48916.65
بشري 50 330.759 1.981 1.849 16537.95

الجدول 1: تحليل نانودروب تمثيلي للحمض النووي الريبي المعزول بهذا البروتوكول. تم عزل الحمض النووي الريبي التمثيلي من 2 كريات براز فأر أو 100 ملغ من عينات البراز البشري ، تم استخلاصها في ماء خال من النيوكلياز 50 ميكرولتر. تم قياس تركيز الحمض النووي الريبي ونسبة A260 / A280 ونسبة A260 / A230 باستخدام nanodrop.

Figure 1
الشكل 1: تحليلات الرحلان الكهربائي التمثيلية القائمة على الرقاقة لتوزيع حجم عزلات الحمض النووي الريبي البرازي. (أ) تم تمييز الحمض النووي الريبي التمثيلي المعزول من 2 كريات براز فأر (اللوحة اليسرى) و 100 ملغ من عينات البراز البشري (اللوحة اليمنى) باستخدام البروتوكول الموصوف هنا باستخدام مقايسة الرحلان الكهربائي القائمة على الرقاقة. يشير هذا الفحص إلى أن غالبية عزلات الحمض النووي الريبي كانت عبارة عن حمض نووي ريبوبي صغير. (ب) خضعت العزلات بعد ذلك للرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبي الصغير مع نظام الرحلان الكهربائي القائم على الرقاقة لتحليل توزيع حجم العزلات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من المهم استخدام تقنية خالية من RNase لمنع تلوث RNase أثناء العزل7. بعد الطرد المركزي وتشكيل الطور البيني المضغوط ، من المهم تجنب الطور البيني والمرحلة السفلية وملوث الجسيمات العائم على قمة الطور المائي عند استعادة المرحلة المائية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة خطوتين للغسيل بمحلول غسيل 500 ميكرولتر و 250 ميكرولتر 2/3 للتخلص من الملوثات في غشاء المرشح للحصول على جودة محسنة. علاوة على ذلك ، لا ينصح باستخدام مادة عينة بداية تزيد عن 200 مجم لأنها قد تخلق صعوبة في التكوين الواضح للطور البيني. وبالمثل ، لا ينصح باستخدام عينة من مادة أقل من 25 مجم لأنها قد لا تكون كافية لاستخراج عينات كافية من الحمض النووي الريبي لتحليل المصب.

أدى النمو المذهل في دراسة الميكروبيوم إلى دفع قياسات الأنواع الميكروبية والجينات إلى دراسات ما وراء النسخ للملف الميكروبي8. تمت دراسة MicroRNAs في البراز كعلامات للأمراض9،10،11. منذ التقرير الأول عن تفاعلات microRNA البرازية التي تتوسط بين المضيف والميكروب3 ، تبدأ الدراسات المتزايدة في التحقيق في مساهمات المضيف والنظام الغذائي في النظام البيئي للأمعاء12،13،14. تجدر الإشارة إلى أنه نظرا لثراء الميكروبات في تجويف الأمعاء والبراز ، فإن الدراسات التي تركز على الذراع المضيف للتفاعل بين المضيف والميكروب تتطلب الحد الأدنى من تلوث الحمض النووي الريبي من الميكروبات. وبالتالي ، فإن بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي الذي يتضمن خطوات تحلل الخلايا15 ليس مثاليا لدراسة الحمض النووي الريبي المنطلق من المضيف والنظام الغذائي. على هذا النحو ، قمنا بتكييف هذا البروتوكول للقضاء على خطوات التحلل لتقليل تلوث الحمض النووي الريبي من البكتيريا الحية والخلايا المضيفة الحية في البراز.

يعمل هذا البروتوكول مع الدراسات التي يكون فيها الحمض النووي الريبي خارج الخلية في محتوى البراز أو تجويف الأمعاء هدفا مثيرا للاهتمام. الحمض النووي الريبي المعزول باستخدام هذا البروتوكول هو الحمض النووي الريبي الكلي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الميكروي كمكون رئيسي. لا يميز هذا البروتوكول ما إذا كان الحمض النووي الريبي في exosome أو microvesicles أو في شكل خال من الحويصلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عن عدم وجود مصالح مالية ذات صلة أو مادية تتعلق بطريقة البحث الموضحة في ورقة البروتوكول هذه.

Acknowledgments

تلقينا مساعدة فنية من مرفق البوليمرات الحيوية في كلية الطب بجامعة هارفارد للمحلل الحيوي. تم دعم هذا العمل من خلال منحة أبحاث الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد RG-1707-28516 (H.L.W. و S.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Thermo Fischer Scientific AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fischer Scientific AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) Thermo Fischer Scientific AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer QIAGEN 13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fischer Scientific AM9780
Vortex Shaker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
  3. Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
  4. Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
  5. Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
  6. Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
  7. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
  8. Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
  9. Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers. Crohn's & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
  10. Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
  11. Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
  12. Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
  13. Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
  14. Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
  15. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 164 ، الحمض النووي الريبي الدقيق ، عينات البراز ، عينات البراز ، عزل الحمض النووي الريبي ، الحمض النووي الريبي الكلي ، الحمض النووي الريبي المرسال
البراز (الصغير) عزل الحمض النووي الريبي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. … More

Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. Fecal (micro) RNA Isolation. J. Vis. Exp. (164), e61908, doi:10.3791/61908 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter