Wide-Field, Imágenes en tiempo real de señales de heridas locales y sistémicas en Arabidopsis

Resumen

Extracelular glutamato desencadenado por la señalización sistémica de calcio es fundamental para la inducción de las respuestas de defensa de las plantas a las heridas mecánicas y ataques de herbívoros en las plantas. Este artículo describe un método para visualizar la dinámica espacial y temporal de ambos estos factores usando las plantas del thaliana de Arabidopsis que expresan los biosensores fluorescentes calcio y glutamato-sensibles.

Resumen

Las plantas responden a tensiones mecánicas como heridas y herbívoros induciendo respuestas de defensa tanto en las partes dañadas como en las distales no dañadas. Sobre herir de una hoja, un aumento en la concentración cytosolic del ion del calcio (señal de Ca²⁺⁾ ocurre en el sitio de la herida. Esta señal se transmite rápidamente a las hojas no dañadas, donde se activan las respuestas de defensa. Nuestra investigación reciente reveló que el glutamato que se escapa de las células heridas de la hoja en el apoplasto alrededor de ellos sirve como señal de la herida. Este glutamato activa los canales permeables de Ca²⁺ similares a los receptores de glutamato, lo que luego conduce a la propagación de señales de Ca²⁺ a larga distancia en toda la planta. Las características espaciales y temporales de estos eventos se pueden capturar con imágenes en tiempo real de plantas vivas que expresan biosensores fluorescentes codificados genéticamente. Aquí introducimos un método planta-ancho, en tiempo real de la proyección de imagen para supervisar la dinámica de las señales de Ca²⁺ y de los cambios en el glutamato apoplásico que ocurren en respuesta a herir. Este enfoque utiliza un microscopio de fluorescencia de campo amplio y plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan proteína verde fluorescente (GFP)-basado en Ca^{2 +} y biosensores de glutamato. Además, presentamos la metodología para provocar fácilmente herida-inducida, glutamato-accionado rápido y a larga distancia Ca²⁺ propagación de la señal. Este protocolo también se puede aplicar a estudios sobre otras tensiones de plantas para ayudar a investigar cómo la señalización sistémica de la planta podría estar involucrada en sus redes de señalización y respuesta.

Introducción

Las plantas no pueden escapar de las tensiones bióticas, por ejemplo, los insectos que se alimentan de ellas, por lo que han desarrollado sofisticados sistemas de detección de estrés y transducción de señales para detectar y luego protegerse de desafíos como la herbivoría^1. Al herir o atacar a los herbívoros, las plantas inician respuestas de defensa rápidas, incluida la acumulación del ácido fitohormona jasmónico (JA) no sólo en el sitio herido, sino también en los órganos distales no dañados^2. Este JA entonces ambos acciona respuestas de la defensa en los tejidos directamente dañados e induce preventivamente defensas e....

Protocolo

1. Preparación de material vegetal

1. En un microtubo de 1,5 mL, esterilizar en superficie las semillas de arabidopsis thaliana (col-0 accesión) planta que expresa ya sea GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR agitando con 20% (v / v) NaClO durante 3 min y luego lavar 5 veces con agua destilada estéril.
   NOTA: Las líneas transgénicas de Arabidopsis que expresan GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR han sido descritas^{previamente 6.}
2. En una capucha estéril, siembre 13 semillas esterilizadas en superficie en una placa de Petri de plástico cuadrada de 10 cm llena de 30 mL de murashige estéril (autoclave) y medio Skoog (MS) [1x sales ms, 1% (p/....

Resultados

La propagación de la señal de [Ca²⁺]_cyt y [Glu]_apo en respuesta a la herida se presenta en la Figura 3, figura 4, película S1y película S2. El corte del pecíolo de la hoja 1 en plantas que expresan GCaMP3 (a 0 s) llevó a un aumento significativo de [Ca²⁺]_cyt que fue rápidamente inducido localmente a través de la vasculatura (a los 40 s) (

Discusión

La señalización sistémica es importante para que las plantas respondan a estímulos ambientales externos localizados y luego mantengan su homeostasis a nivel de toda la planta. Aunque no están equipados con un sistema nervioso avanzado como los animales, emplean una comunicación rápida tanto dentro como entre órganos basados en factores como las señales eléctricas móviles (y posiblemente hidráulicas) y las ondas de propagación de ROS y Ca^2+46,47. El pro.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Arabidopsis expresando GCaMP3 Universidad de	Saitama
Arabidopsis expresando CHIB-iGluSnFR			Saitama
GraphPad Prisma 7	Software GraphPad
L-Glutamato	FUJIFILM Wako	072-00501	Disuelto en un medio de crecimiento líquido [1/2x sales de MS, 1% (p/v) de sacarosa y 0,05% (p/v) de MES; pH 5,1 ajustado con 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medio	FUJIFILM Wako	392-00591	composición: 1x sales MS, 1% (p/v) de sacarosa, 0,01% (p/v) de mioinositol, 0,05% (p/v) MES y 0,5% (p/v) goma gellan; pH 5,7 ajustado con 1N KOH.
Microscopio estereoscópico Nikon SMZ25	Análisis Nikon
NIS-Elements AR Lente	Nikon
1x (P2-SHR PLAN APO)Cámara	Nikon
sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Placa de Petri de plástico cuadrada	Simport	D210-16

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