Myosinspesifikke tilpasninger av in vitro fluorescensmikroskopibaserte motilitetsanalyser

Summary

Presentert her er en prosedyre for å uttrykke og rense myosin 5a etterfulgt av en diskusjon av karakteriseringen, ved hjelp av både ensemble og enkeltmolekyl in vitro fluorescensmikroskopibaserte analyser, og hvordan disse metodene kan endres for karakterisering av nonmuscle myosin 2b.

Abstract

Myosinproteiner binder og samhandler med filamentøs aktin (F-aktin) og finnes i organismer over det fylogenetiske treet. Deres struktur og enzymatiske egenskaper er tilpasset den spesielle funksjonen de utfører i celler. Myosin 5a går prosesjonelt på F-aktin for å transportere melanosomer og vesicles i celler. Omvendt fungerer nonmuscle myosin 2b som en bipolar filament som inneholder ca. 30 molekyler. Den beveger F-aktin av motsatt polaritet mot midten av filamentet, hvor myosinmolekylene arbeider asynkront for å binde aktin, gi et kraftslag og dissosiere før de gjentar syklusen. Nonmuscle myosin 2b, sammen med sine andre nonmuscle myosin 2 isoformer, har roller som inkluderer celleadhesjon, cytokinesis og spenningsvedlikehold. Mekanokjemien til myosiner kan studeres ved å utføre in vitro motility-analyser ved hjelp av rensede proteiner. I glidende aktinfilamentanalyse er myosinene bundet til et mikroskopdeksler og omfordeler fluorescerende merket F-aktin, som kan spores. I enkeltmolekylet/ensemblemotilitetsanalysen er imidlertid F-aktin bundet til en coverlip og bevegelsen av fluorescerende merket myosinmolekyler på F-aktin observeres. I denne rapporten er rensing av rekombinant myosin 5a fra Sf9-celler ved hjelp av affinitetskromatografi skissert. Etter dette skisserer vi to fluorescensmikroskopibaserte analyser: glidende aktinfilamentanalyse og den omvendte motilitetsanalysen. Fra disse analysene kan parametere som aktintranslokasjonshastigheter og enkeltmolekylløpslengder og hastigheter trekkes ut ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren. Disse teknikkene kan også brukes til å studere bevegelsen av enkeltfilamenter av nonmuscle myosin 2 isoforms, diskutert heri i sammenheng med nonmuscle myosin 2b. Denne arbeidsflyten representerer en protokoll og et sett med kvantitative verktøy som kan brukes til å studere enkeltmolekylet og ensembledynamikken til nonmuscle myosiner.

Introduction

Myosiner er motorproteiner som utøver kraft på aktinfilamenter ved hjelp av energien avledet fra adenosin tripfosfat (ATP) hydrolyse¹. Myosiner inneholder et hode-, nakke- og haledomene. Hoveddomenet inneholder aktinbindingsregionen samt stedet for ATP-binding og hydrolyse. Nakkedomenene består av IQ-motiver, som binder seg til lyskjeder, calmodulin eller calmodulin-lignende proteiner^2,3. Haleområdet har flere funksjoner som er spesifikke for hver klasse myosiner, inkludert, men ikke begrenset til, dimerisering av to tunge kjeder, binding av lastmolekyler og regulering av myosin via autoinhibitory interaksjoner med hodedomenene¹.

Motile egenskaper av myosin varierer sterkt mellom klasser. Noen av disse egenskapene inkluderer pliktforhold (brøkdelen av myosins mekaniske syklus der myosin er bundet til aktin) og prosesjon (motorens evne til å gjøre flere trinn på sporet før løsrivelse)⁴. De over 40 klassene av myosiner ble bestemt basert på sekvensanalyser^5,6,7,8. Klasse 2 myosiner er klassifisert som "konvensjonelle" siden de var de første som ble studert; Alle andre klasser av myosiner er derfor klassifisert som "ukonvensjonelle".

Myosin 5a (M5a) er en klasse 5 myosin og er en prosesjonsmotor, noe som betyr at den kan ta flere skritt langs aktin før den dissosierer. Den har et høyt forhold, noe som indikerer at den bruker en stor del av sin mekaniske syklus bundet til actin^{9,10,11,12,13,14}. I likhet med andre myosiner inneholder den tunge kjeden et N-terminal motordomene som inkluderer både en aktinbinding og et ATP hydrolysested etterfulgt av en nakkeregion som fungerer som en spakarm, med seks IQ-motiver som binder seg til essensielle lyskjeder (ELC) og calmodulin (CaM)¹⁵. Haleområdet inneholder α heliske spolespoler, som dimmerer molekylet, etterfulgt av en kuleformet haleregion for bindende last. Dens kinetikk gjenspeiler sitt engasjement i transport av melanosomer i melanocytter og av endoplasmic retikulum i Purkinje nevroner^16,17. M5a regnes som den prototypiske lasttransportmotoren¹⁸.

Klasse 2 myosiner, eller konvensjonelle myosiner, inkluderer myosiner som driver sammentrekning av skjelett, hjerte og glatt muskel i tillegg til nonmuscle myosin 2 (NM2) isoformer, NM2a, 2b og 2c¹⁹. NM2-isoformene finnes i cytoplasma av alle celler og har delte roller i cytokinesis, adhesjon, vevsmorfogenese og cellemigrasjon^19,20,21,22. Dette dokumentet diskuterer konvensjonelle myosinprotokoller i sammenheng med nonmuscle myosin 2b (NM2b)²³. NM2b, sammenlignet med M5a, har et lavt driftsforhold og er enzymatisk tregere med en_V-maks 0,2 s^-123 sammenlignet med M5as_V-maks ≈18 s^-124. Spesielt avkortede NM2b-konstruksjoner med to hoder beveger seg ikke lett prosessivt på aktin; snarere resulterer hvert møte med aktin i et kraftslag etterfulgt av dissosiasjon av^{molekylet 25}.

NM2b inneholder to myosin tunge kjeder, hver med ett kuleformet hodedomene, en spak-arm (med en ELC og en regulatorisk lyskjede (RLC)), og en α-spiralformet spole/hale domene, ca 1100 aminosyrer lang, som dimmer disse to tunge kjedene. Den enzymatiske aktiviteten og strukturtilstanden til NM2b reguleres av fosforylering av RLC²³. Unphosphorylated NM2b, i nærvær av ATP og fysiologiske ioniske styrker (ca. 150 mM salt), vedtar en kompakt konformasjon der de to hodene deltar i en asymmetrisk interaksjon og halen bretter seg tilbake over hodene på to steder²³. I denne tilstanden samhandler myosin ikke sterkt med aktin og har svært lav enzymatisk aktivitet. Ved RLC fosforylering ved calmodulin-avhengig myosin lyskjede kinase (MLCK) eller Rho-assosiert protein kinase, molekylet strekker seg og forbinder med andre myosiner gjennom hale regionen for å danne bipolar filamenter på ca 30 myosin molekyler²³. Den nevnte fosforyleringen av RLC fører også til økt aktinaktivert ATPase-aktivitet av NM2b med omtrent fire ganger^26,27,28. Dette bipolare filamentarrangementet, med mange myosinmotorer i hver ende, er optimalisert for roller i sammentrekning og spenningsvedlikehold, hvor aktinfilamenter med motstridende polariteter kan flyttes i forhold til hverandre^23,29. Følgelig har NM2b vist seg å fungere som et ensemble av motorer når de samhandler med aktin. Det store antallet motorer i denne filamentet tillater NM2b-filamenter å bevege seg projektivt på aktinfilamenter, noe som gjør in vitro filamentprosesjon mulig å karakterisere²⁹.

Mens det er gjort fremskritt i å forstå myosinenes rolle i cellen, er det behov for å forstå deres individuelle egenskaper på proteinnivå. For å forstå actomyosin interaksjoner på et enkelt protein-protein interaksjonsnivå, i stedet for innsiden av en celle, kan vi uttrykke og rense rekombinante myosiner for bruk i in vitro-studier. Resultatene av slike studier informerer deretter mekanobiologer om de biofysiske egenskapene til spesifikke myosiner som til slutt driver komplekse cellulære prosesser^{12,13,14,25,29}. Dette oppnås vanligvis ved å legge til en affinitetskode i en full lengde eller avkortet myosinkonstruksjon og rensing via affinitetskromatografi^29,30,31. I tillegg kan konstruksjonen konstrueres til å inkludere en genetisk enkodbar fluorofor eller en tag for proteinmerking med syntetisk fluorofor. Ved å legge til en slik fluorescerende etikett, kan enkeltmolekylavbildningsstudier utføres for å observere myosinmekanikk og kinetikk.

Etter rensing kan myosin karakteriseres på flere måter. ATPase-aktivitet kan måles ved hjelp av kolorimetriske metoder, noe som gir innsikt i motorens samlede energiforbruk og aktinaffinitet under forskjellige forhold³². For å lære om mekanokjemien til motiliteten, er det nødvendig med ytterligere eksperimenter. Dette dokumentet beskriver to in vitro fluorescensmikroskopibaserte metoder som kan brukes til å karakterisere motile egenskaper til et renset myosinprotein.

Den første av disse metodene er glidende actin filamentanalyse, som kan brukes til kvantitativt å studere ensembleegenskapene til myosinmotorer, samt kvalitativt studere kvaliteten på en batch renset protein³³. Selv om dette dokumentet diskuterer bruken av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi for denne analysen, kan disse eksperimentene effektivt utføres ved hjelp av et vidfelt fluorescensmikroskop utstyrt med et digitalt kamera, ofte funnet i mange laboratorier³⁴. I denne analysen er et mettende lag av myosinmotorer festet til en deksle. Dette kan oppnås ved hjelp av nitrocellulose, antistoffer, membraner, SiO_2-avlededeoverflater (som trimethylchlorosilane), blant annet^{29,33,35,36,37,38}. Fluorescerende merket aktinfilamenter passeres gjennom dekslene, hvorpå aktinet binder seg til myosin festet til overflaten. Ved tilsetning av ATP (og kinaser i studiet av NM2) er kammeret avbildet for å observere translokasjonen av aktinfilamenter av overflatebundne myosiner. Sporingsprogramvare kan brukes til å korrelere hastigheten og lengden på hver glidende aktinfilament. Analyseprogramvare kan også gi et mål på antall både bevegelige og stasjonære aktinfilamenter, noe som kan være nyttig for å bestemme kvaliteten på et gitt myosinpreparat. Andelen stalled filamenter kan også med vilje moduleres ved overflatetethering av aktin til andre proteiner og måles for å bestemme belastningsavhengigheten til myosin³⁹. Fordi hver aktinfilament kan drives av et stort antall tilgjengelige motorer, er denne analysen svært reproduserbar, med den endelige målte hastigheten robust mot perturbasjoner som endringer i startminosinkonsentrasjonen eller tilstedeværelsen av ytterligere faktorer i løsningen. Dette betyr at det lett kan modifiseres for å studere myosinaktivitet under forskjellige forhold, for eksempel endret fosforylering, temperatur, ionisk styrke, løsningsviskositet og effekten av belastning indusert av overflatetethers. Selv om faktorer som sterk bindende myosin "døde hoder" ute av stand til ATP hydrolyse kan forårsake stoppet aktinfilamenter, finnes det flere metoder for å redusere slike problemer og muliggjøre nøyaktige målinger. De kinetiske egenskapene til myosin varierer sterkt på tvers av klasser, og avhengig av hvilken myosin som brukes, kan hastigheten på aktinfilamentgliding i denne analysen variere fra under 20 nm / s (myosin 9)^40,41og opptil 60,000 NM / s (Characean myosin 11)⁴².

Den andre analysen inverterer geometrien til glidende aktinfilamentanalyse¹². Her er aktinfilamentene festet til coverlipoverflaten og bevegelsen av enkeltmolekyler av M5a eller av individuelle bipolare filamenter av NM2b visualiseres. Denne analysen kan brukes til å kvantifisere løpelengder og hastigheter av enkelt myosinmolekyler eller filamenter på aktin. En coverlip er belagt med en kjemisk forbindelse som blokkerer ikke-spesifikk binding og samtidig funksjonaliserer overflaten, for eksempel biotin-polyetylenglykol (biotin-PEG). Tilsetningen av modifiserte avidinderivater primer deretter overflaten og biotinylert aktin passeres gjennom kammeret, noe som resulterer i et lag av F-aktin stabilt bundet til bunnen av kammeret. Til slutt strømmes aktivert og fluorescerende merket myosin (vanligvis 1-100 nM) gjennom kammeret, som deretter avbildes for å observere myosinbevegelse over de stasjonære aktinfilamentene.

Disse modalitetene representerer raske og reproduserbare metoder som kan brukes til å undersøke dynamikken i både nonmuscle og muskel myosiner. Denne rapporten skisserer prosedyrene for å rense og karakterisere både M5a og NM2b, som representerer henholdsvis ukonvensjonelle og konvensjonelle myosiner. Dette etterfølges av en diskusjon om noen av de myosinspesifikke tilpasningene, som kan utføres for å oppnå vellykket fangst av bevegelse i de to typene av analysen.

Uttrykk og molekylærbiologi
cDNA for myosin av interesse må klones på en modifisert pFastBac1-vektor som koder for enten en C-terminal FLAG-tag (DYKDDDDK) hvis du uttrykker M5a-HMM, eller en N-terminal FLAG-tag hvis du uttrykker molekylet i full lengde av NM2b^{23,43,44,45,46}. C-terminal FLAG-tagger på NM2b resulterer i en svekket affinitet av proteinet for FLAG-affinitetskolonnen. I motsetning binder det N-terminalt FLAGG-taggede proteinet vanligvis godt til FLAG-affinitetskolonnen²³. Det N-terminalt merkede proteinet beholder enzymatisk aktivitet, mekanisk aktivitet og fosforyleringsavhengig regulering²³.

I dette papiret ble en avkortet mus M5a tung meromyosin (HMM)-lignende konstruksjon med en GFP mellom FLAG-taggen og C-terminus av myosin tungkjeden brukt. Merk at I motsetning til NM2b, kan M5a-HMM bli merket og renset med enten N- eller C-terminal FLAG-koder, og i begge tilfeller vil den resulterende konstruksjonen være aktiv. M5a tungkjede ble avkortet ved aminosyre 1090 og inneholder en tre aminosyrekobling (GCG) mellom GFP og spoleområdet i M5a⁴⁷. Ingen ekstra kobling ble lagt til mellom GFP- og FLAG-koden. M5a-HMM ble co-uttrykt med calmodulin. Den menneskelige NM2b-konstruksjonen i full lengde ble uttrykt sammen med ELC og RLC. N-termini av RLC ble fusjonert med en GFP via en linker på fem aminosyrer (SGLRS). Direkte knyttet til FLAG-taggen var en HaloTag. Mellom HaloTag og N-terminus av myosin tung kjeden var en linker laget av to aminosyrer (AS).

Begge myosinpreparatene ble renset fra en liter Sf9 cellekultur infisert med baculovirus med en tetthet på ca. 2 x 10⁶ celler / ml. Volumene av baculoviruset for hver underenhet var avhengig av virusets mangfold av infeksjon som bestemt av produsentens instruksjoner. Når det gjelder M5a, ble cellene co-infisert med to forskjellige baculovirus-en for calmodulin, og en for M5a tung kjede. Når det gjelder NM2b, ble cellene co-infisert med tre forskjellige virus-en for ELC, en for RLC og en for NM2b tungkjede. For laboratorier som arbeider med et mangfold av myosiner (eller andre multi-komplekse proteiner), er denne tilnærmingen effektiv siden den gir mulighet for mange kombinasjoner av tunge og lette kjeder og ofte brukte lyskjeder som calmodulin kan kryssaseres med mange forskjellige myosin tunge kjeder. Alt cellearbeid ble fullført i et biosikkerhetsskap med riktig steril teknikk for å unngå forurensning.

For uttrykk for både M5a og NM2b ble Sf9-cellene som produserer rekombinante myosiner samlet inn 2-3 dager etter infeksjon, via sentrifugering og lagret ved -80 °C. Cellepellets ble oppnådd ved sentrifugering av de co-infiserte Sf9-cellene ved 4 °C i 30 minutter ved 2800 x g. Proteinrensingsprosessen er beskrevet nedenfor.

Protocol

1. Protein rensing

1. Cellelys og proteinekstraksjon
   1. Klargjør en 1,5x ekstraksjonsbuffer basert på tabell 1. Filtrer og oppbevar ved 4 °C.
   2. Begynn å tine cellepellets på is. Mens pelletsene tiner, supplerer du 100 ml ekstraksjonsbuffer med 1,2 mM dithiothreitol (DTT), 5 μg/ml leupeptin, 0,5 μM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og to proteasehemmertabletter. Hold deg på isen.
   3. Når pelletsen har tint, tilsett 1 ml av den supplerte ekstraksjonsbufferen per 10 ml cellekultur. For eksempel, hvis cellepellets ble dannet fra 500 ml cellekultur, legg deretter 50 ml supplert ekstraksjonsbuffer til pelletsen.
   4. Soniker cellepellets mens du holder dem på is. For hver pellets, bruk følgende forhold: 5 s PÅ, 5 s AV, varighet på 5 min, effekt 4-5.
   5. Samle alle homogeniserte lysat i et beger og tilsett ATP (0,1 M lagerløsning; pH 7.0) slik at den endelige konsentrasjonen av ATP er 1 mM. Rør i 15 min i et kaldt rom. ATP tar avstand fra aktiv myosin fra aktin, slik at den kan skilles i følgende sentrifugeringstrinn. Det er derfor viktig å gå videre til neste trinn umiddelbart for å minimere muligheten for ATP-uttømming og ombinding til aktin.
   6. Sentrifuger lysatene ved 48 000 x g i 1 time ved 4 °C. Mens dette skjer, begynn å vaske 1-5 ml av en 50% slurry av Anti-FLAG affinitetharpiks (for en pellet dannet fra 1 L celler) med 100 ml fosfatbufret saltvann (PBS), i henhold til produsentens instruksjoner. For eksempel, for 5 ml harpiks, vask 10 ml av en 50% slurry. I det siste vasketrinnet, resuspend harpiksen med 1-5 ml PBS med nok volum til å skape en 50% slurry.
   7. Etter lysate sentrifugering, kombiner supernatanten med den vaskede harpiksslammet og rock forsiktig i kjølerommet i 1-4 timer. Mens du venter, gjør du bufferne beskrevet i tabell 1 og holder dem på is.
2. FLAGG klargjøring av affinitetsrensing
   1. Sentrifuger oppløsningen i trinn 1,7 ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Harpiksen vil bli pakket på bunnen av røret. Uten å forstyrre harpiksen, fjern supernatanten.
   2. Resuspend harpiksen i 50 ml buffer A som beskrevet i tabell 1 og sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Uten å forstyrre harpiksen, fjern supernatanten.
   3. Resuspend harpiksen i 50 ml buffer B som beskrevet i tabell 1 og sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Gjenta dette trinnet en gang til, og gi harpiksen på nytt i 20 ml buffer B. Bland deretter harpiksen og bufferen grundig ved å snu røret forsiktig for hånd ca. 10 ganger.
3. Protein elution og konsentrasjon
   1. Lag 30 ml elutionbuffer som beskrevet i tabell 1 og la den kjøle seg ned på is.
   2. Sett opp elution-kolonnen i et kaldt rom. Hell forsiktig harpiksslammet inn i kolonnen. Vask kolonnen med 1-2 kolonnevolumer buffer B som harpikspakkene på bunnen, og sørg for at harpiksen ikke tørker ut.
   3. Strømning 1 ml av elutionbufferen gjennom harpiksen og samle gjennomstrømningen i et 1,5 ml rør. Gjenta slik at 12, 1 ml fraksjoner samles inn.
   4. På dette tidspunktet, utfør en rå Bradford test på fraksjonene for å kvalitativt bestemme hvilke brøker som er de mest konsentrerte⁴⁸. På en rad av en 96-brønns plate, pipette 60 μL 1x Bradford reagens. Etter hvert som fraksjoner samles, bland 20 μL av hver brøkdel per brønn. En mørkere blå farge angir de mer konsentrerte brøkene.
   5. I et 50 ml rør samler du det gjenværende proteinet ved å forsiktig pipettere den gjenværende Elution Buffer gjennom kolonnen, for å frigjøre gjenværende myosin bundet til harpiksen i kolonnestrømmen. Denne gjennomstrømningen vil bli konsentrert i neste trinn. Påse at harpiksen deretter genereres på nytt for gjenbruk og lagres i henhold til produsentens instruksjoner.
   6. Samle de tre mest konsentrerte fraksjonene og konsentrer strømningen ytterligere i 50 ml-røret, samt de resterende 1 ml-fraksjonene ved hjelp av et 100 000 MWCO konsentrert rør. Legg den samlede prøven på konsentrerende rør og sentrifuge ved 750 x g i 15 min ved 4 °C og gjenta til alt utvunnet protein er konsentrert til et endelig volum på ca. 0,5-1 ml.
      MERK: Denne porestørrelsen gjør det mulig å beholde myosinmolekylene, som har masser flere ganger molekylvektkuttet. Lyskjedene forblir tett bundet til motordomenene i løpet av denne tiden, som verifisert ved å utføre SDS-PAGE geleelektroforese på sluttproduktet.
4. Dialyse og flash-frysing
   1. Lag 2 L dialysebuffer, som beskrevet i tabell 1. Legg prøven i en dialysepose eller et kammer og dialyse over natten i kjølerommet. Merk at sammensetningen av dialysebufferne er forskjellig for NM2b og M5a.
      MERK: Når det gjelder NM2b, er formålet med dette dialysetrinnet å danne myosinfilamenter i den lave ioniske styrkebufferen. Sedimentering av disse filamentene gir deretter et ekstra rensetrinn og gir mulighet for konsentrasjonen av prøven. Det vil derfor være et synlig hvitt bunnfall i dialysekammeret neste dag. Disse filamentene vil bli samlet inn ved sentrifugering og depolymerisert i trinn 5.1. Når det gjelder M5a-HMM, etter nattdialysen, vil proteinet være tilstrekkelig rent for bruk i etterfølgende analyser. Ytterligere rensetrinn som gelfiltrering eller ionisk utvekslingskromatografi kan utføres om nødvendig. For M5a-gjenoppretting etter dialyse, gå til trinn 5.2.
5. Gjenopprette myosin etter dialyse
   1. For NM2b, fjern forsiktig hele prøven fra dialyseposen eller kammeret og sentrifugen ved 4 °C i 15 minutter ved 49 000 x g for å samle myosinfilamentene. Kast supernatanten og legg lagringsbufferen trinnvis til pelletsen som beskrevet i tabell 1 til den er oppløst. Skånsom opp og ned pipettering bidrar til å løse pelletsen. Normalt krever dette ikke mer enn 500 μL per rør. Etter å ha sørget for at pellet er fullstendig oppløst i lagringsbufferen med høy ionisk styrke, kan et ekstra sentrifugeringstrinn (15 min ved 49 000 x g) utføres for å fjerne uønskede aggregater om nødvendig, siden myosinet nå vil bli uberørt og vil forbli i supernatanten.
   2. For M5a-HMM, samle nøye hele prøven fra dialysekammeret og sentrifugen ved 4 °C i 15 minutter ved 49 000 x g i tilfelle uønskede aggregater er til stede. Ta supernatanten.
6. Konsentrasjonsbestemmelse og blitsfrysing
   1. For å bestemme konsentrasjonen av produktet, mål absorbansen ved hjelp av et spektrofotometer ved bølgelengder 260, 280, 290 og 320 nm. Beregn konsentrasjonen i mg/ml (c_mg/ml) med ligning 1, der A₂₈₀ representerer absorpsjonen ved 280 nm og A₃₂₀ representerer absorpsjonen ved 320 nm. Den resulterende konsentrasjonen i mg / ml kan konverteres til μM av myosinmolekyler med ligning 2, hvor M er molekylvekten til hele proteinet (inkludert tunge kjeder, lyskjeder, fluoroforer og alle koder).
      c_mg/ml = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      μM molekyler = 1000c_mg/ml/M (2)
      MERK: Hvis en fortynning er nødvendig, må den gjøres i en høy ionisk styrkebuffer. Utryddelseskoeffisienten (ε) kan bestemmes ved å importere aminosyresekvensen av proteinet til et program som ExPASy. Typisk utbytte for M5a-HMM er ca. 0,5-1 ml 1-5 mg/ml protein og for NM2b i full lengde er 0,5-1 ml 0,5-2 mg/ml. Utryddelseskoeffisienten for M5a-HMM som ble brukt i dette papiret var 0,671. Utryddelseskoeffisienten for NM2b som ble brukt i dette papiret var 0,611.
   2. Oppbevar det rensede myosinet på en av de to måtene. Aliquot mellom 10-20 μL i et tynnvegget rør, for eksempel et polymerisasjonskjedereaksjonsrør, og slipp røret i en beholder med flytende nitrogen for flash-frysing. Alternativt kan du direkte pipette mellom 20-25 μL myosin i flytende nitrogen og lagre de frosne perlene av protein i sterile kryogenrør. I begge tilfeller kan de resulterende rørene lagres i -80 ° C eller flytende nitrogen for fremtidig bruk.
      MERK: Siden begge motilitetsanalysene beskrevet nedenfor krever svært små mengder protein, er lagring i små aliquots, som beskrevet, økonomisk.

2. Gliding actin filament analyse

1. Coverlip forberedelse
   1. Lag en 1% nitrocelluloseløsning i amylacetat.
   2. Få en vevskulturrett (150 x 25 mm) og legg til et sirkulært filterpapir (125 mm diameter) på bunnen av parabolen.
   3. Legg åtte nr. 1,5 tykkelse 22 mm firkantede deksler på et stativ og vask med ca. 2-5 ml 200-bevis etanol etterfulgt av 2-5 ml destillert vann (dH₂O). Gjenta dette vasketrinnet, og avslutt med vann. Tørk deretter dekslene helt med en filtrert luftledning eller N₂-linje.
   4. Ta ett deksle og rør sakte 10 μL av den 1% nitrocelluloseoppløsningen langs den ene kanten av gliden. Smør den deretter over resten av dekslene i en jevn bevegelse ved hjelp av siden av en glattsidig pipettespiss på 200 μL. Legg denne dekslen på vevskulturretten med nitrocellulosesiden opp. Gjenta for de resterende dekslene og la dem tørke mens du forbereder de resterende reagensene og bruk deksler innen 24 timer etter belegg.
2. Kammer forberedelse
   1. Tørk av et mikroskop med et optisk linsepapir for å rense av store rusk. Klipp to stykker dobbeltsidig tape, ca 2 cm i lengde.
   2. Plasser ett stykke langs midten av den lange kanten av mikroskopet. Kontroller at kanten på båndet er på linje med kanten på lysbildet. Plasser det andre tapestykket omtrent 2 mm under det første tapestykket slik at de to er parallelle og justerte. Dette skaper et strømningskammer som kan inneholde ca. 10 μL oppløsning (se figur 1).
   3. Ta en av de nitrocellulosebelagte dekslene fra del 1. Fest forsiktig dekslene på båndet slik at siden belagt med nitrocellulose kommer i direkte kontakt med båndet (se figur 1). Bruk en pipettespiss til å trykke forsiktig ned på skyvbåndgrensesnittet for å sikre at dekslene er ordentlig festet til lysbildet. Klipp overflødig tape hengende over kanten av lysbildet med et barberblad.
3. Actin forberedelse
   1. Lag 20 μM F-aktin ved å polymerisere kuleformet aktin (G-aktin) i polymerisasjonsbuffer (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0)) ved 4 °C over natten.
   2. Fortynn F-aktin til 5 μM i motilitetsbuffer (20 mM MOPS, 5 mM MgCl_2,0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Etikett med minst 1,2x molar overskudd av rhodamin-falloidin. La (dekket av aluminiumsfolie) stå i minst 2 timer på is. Dette kan brukes i opptil 1-2 måneder, lagret på is.
4. Utføre myosin 5a glidende actin filament analyse
   MERK: I denne delen er detaljene i myosin 5a (HMM) glidende analyse gitt.
   1. Forbered løsningene for myosin 5a beskrevet i tabell 2 og hold dem på is.
   2. Strømning i 10 μL av myosin 5a (50-100 nM) gjennom strømningskammeret og vent i 1 min.
   3. Strømning i 10 μL av 1 mg/ml BSA i 50 mM MB med 1 mM DTT ("lavt salt"-buffer). Gjenta denne vasken to ganger til og vent i 1 min etter den tredje vasken. Bruk hjørnet av et silkepapir eller filterpapir for å transportere løsningen gjennom kanalen ved å plassere hjørnet av papiret forsiktig ved strømningskammerets utgang.
   4. Vask med 10 μL 50 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til.
   5. Strømning i 10 μL av den svarte aktinoppløsningen (5 μM F-aktin, 1 μM calmodulin og 1 mM ATP i 50 mM MB med 1 mM DTT) for å eliminere "døde hoder", som beskrevet i diskusjonsdelen.
      1. Pipette oppløsningen med en 1 ml sprøyte og 27 G nål for å skjære aktinfilamentene før løsningen introduseres i kammeret. Gjenta dette trinnet to ganger til og vent i 1 min etter tredje gang. Omtrent 20 pipetteringshendelser er tilstrekkelige.
      2. For å utføre det "døde hodet" spinnet, legg til en stoichiometrisk mengde F-aktin til myosin i nærvær av 1 mM ATP og 1 mM MgCl₂ ved en saltkonsentrasjon på 500 mM. Deretter ultracentrifuge ved 480,000 x g i 15 min ved 4 °C. Den døde myosin vil være i pellets.
   6. Strømning i 50 μL 50 mM MB med 1 mM DTT og 1 mM ATP for å tømme kammeret for frie aktinfilamenter.
   7. Vask med 10 μL 50 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til for å tømme kammeret til en atp.
   8. Strømning i 10 μL 20 nM rhodamin actin (Rh-Actin) løsning som inneholder 1 mM DTT i 50 mM MB og vent i 1 min for å tillate streng binding av aktinfilamenter til myosin 5a festet til overflaten av dekslene.
   9. Vask med 10 μL 50 mM MB med 1 mM DTT for å vaske bort Rh-Actin-filamenter som ikke er bundet til overflaten. Gjenta denne vasken to ganger til.
   10. Strømning i 30 μL endelig buffer.
   11. Ta opp bilder på et fluorescensmikroskop ved hjelp av en eksitasjonsbølgelengde på 561 nm for å visualisere Rh-Actin. En passende eksponeringstid er 200 ms ved 1,4 mW lasereffekt for en total anskaffelsesvarighet på 0,5-1 min.
       MERK: Forsikre deg om at anskaffelsesraten skaleres riktig til hastigheten på de bevegelige filamentene. En viktig vurdering før du samler inn data for bruk med sporingsprogrammer, er innhentingsfrekvensen. Subpikselbevegelser mellom rammer vil resultere i en overestimering av hastigheten, og bevegelser på flere hundre nanometer er nødvendig for å oppnå nøyaktige verdier. En optimal anskaffelsesrate har aktingliding for minst en pikselavstand mellom rammer. Når det gjelder TIRF-mikroskopet som brukes til avbildningen her, oversettes denne terskelen til 130 nm; Derfor må en myosin som forventes å reise 1 μm/s, avbildes med en hastighet på 5 bilder/s (0,2 s intervall) for å oppnå 200 nm bevegelse, mens en myosin som forventes å reise 10 nm/s krever 0,05 bilder/s (20 s intervaller). Data kan derfor reduseres på dette stadiet om nødvendig (se Diskusjon for mer informasjon).
5. Utføre nonmuscle myosin 2b glidende actin filament analyse
   MERK: I denne delen er detaljene i den ikke-muskle myosin 2b glideanalysen i full lengde gitt. Den nonmuscle myosin 2b glidende actin filament analyse protokollen er forskjellig fra myosin 5a protokollen på visse trinn. Kontroller at de riktige bufferne brukes for hvert av disse trinnene. Nm2b-analysen krever for eksempel at myosin festes til dekslene i høy saltbuffer, mens M5a kan festes til dekslene i høye eller lave saltbuffere. I tillegg bruker M5a glidende aktinfilamentanalyse en lavere konsentrasjon av myosin for å redusere hyppigheten av aktinfilamenter som bryter sammen under oppkjøpet.
   1. Klargjør løsningene for NM2b som beskrevet i tabell 2 og hold dem på is.
   2. Strømning i 10 μL av nonmuscle myosin 2b (0,2 μM) i 500 mM motilitetsbuffer (MB) ("høy salt" buffer) og 1 mM dithiothreitol (DTT) gjennom strømningskammeret og vent i 1 min.
      MERK: De høye saltbufferne tar avstand fra myosinfilamenter og tillater festing av enkelt myosinmolekyler til overflaten, da nonmuscle myosin 2b kan polymerisere til filamenter ved ionisk konsentrasjon <150 mM.
   3. Strømning i 10 μL av 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) i 500 mM MB med 1 mM DTT ("høy salt"-buffer) som beskrevet i tabell 2. Gjenta denne vasken to ganger til og vent i 1 min etter den tredje vasken. Bruk hjørnet av et silkepapir eller filterpapir for å transportere løsningen gjennom kanalen.
   4. Vask med 10 μL 500 mM MB med 1 mM DTT som beskrevet i tabell 2. Gjenta denne vasken to ganger til.
   5. Strømning i 10 μL av den svarte aktinløsningen som beskrevet i tabell 2 for å eliminere "døde hoder", som diskutert videre i diskusjonsdelen. Den svarte aktinløsningen inneholder 5 μM umerket F-aktin, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl₂, 1 μM CaM og 1 mM DTT i 50 mM NaCl motilitetsbuffer for å fosforyle den ikkemuskle myosin 2b på overflaten av kammeret.
      1. Pipette oppløsningen med en 1 ml sprøyte og 27 G nål for å skjære aktinfilamentene før løsningen introduseres i kammeret. Gjenta dette trinnet to ganger til og vent i 1 min etter tredje gang. Omtrent 20 pipetteringshendelser er tilstrekkelige.
   6. Strømning i 50 μL 50 mM MB med 1 mM DTT og 1 mM ATP for å tømme kammeret for frie aktinfilamenter.
   7. Vask med 10 μL 50 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til for å tømme kammeret til en atp.
   8. Strømning i 10 μL 20 nM Rh-Actin-oppløsning som inneholder 1 mM DTT i 50 mM MB og vent i 1 min for å tillate streng binding av aktinfilamenter til den ikke-muskle myosin 2b festet til overflaten av dekslene.
   9. Vask med 10 μL 50 mM MB med 1 mM DTT for å vaske bort Rh-Actin-filamenter som ikke er bundet til overflaten. Gjenta denne vasken to ganger til.
   10. Strømning i 30 μL endelig buffer. For nonmuscle myosin 2b glidende aktinfilamentanalyse inkluderer den endelige bufferen også calmodulin, CaCl₂og myosin lyskjede kinase for å gi full fosforylering av den ikkemuskle myosin 2b under videoavbildning. 0,7% metylcellulose kan også inkluderes i sluttbufferen hvis aktinfilamenter bare er løst bundet eller ikke er bundet til overflaten. Dette drøfter videre i diskusjonsdelen.
   11. Ta opp bilder på et fluorescensmikroskop ved hjelp av en eksitasjonsbølgelengde på 561 nm. En passende eksponeringstid er 200 ms ved 1,4 mW lasereffekt for en total anskaffelsesvarighet på 0,5 -3 min.
       MERK: Forsikre deg om at anskaffelsesraten skaleres riktig til hastigheten på de bevegelige filamentene. En viktig vurdering før du samler inn data for bruk med sporingsprogrammer, er innhentingsfrekvensen. Subpikselbevegelser mellom rammer vil resultere i en overestimering av hastigheten, og bevegelser på flere hundre nanometer er nødvendig for å oppnå nøyaktige verdier. En optimal anskaffelsesrate har aktingliding for minst en pikselavstand mellom rammer. Når det gjelder TIRF-mikroskopet som brukes til avbildningen her, oversettes denne terskelen til 130 nm; Derfor må en myosin som forventes å reise 1 μm/s, avbildes med en hastighet på 5 bilder/s (0,2 s intervall) for å oppnå 200 nm bevegelse, mens en myosin som forventes å reise 10 nm/s krever 0,05 bilder/s (20 s intervaller). Data kan derfor tas ned på dette stadiet, om nødvendig (se Diskusjon for mer informasjon).

3. Enkeltmolekyl TIRF-analyse

1. Coverlip forberedelse
   1. Del lagerpulveret i 10 mg aliquots (i 1,5 ml rør) metoksy-Peg-silan (mPEG) og 10 mg aliquots biotin-Peg-silan (bPEG). Oppbevares ved -20 °C i en forseglet, fuktfri beholder og brukes innen 6 måneder.
   2. Last åtte No. 1,5H (høy presisjon) tykkelse 22 mm firkantede deksler på et stativ og vask med 2-5 ml 200-bevis etanol etterfulgt av 2-5 ml destillert vann. Gjenta dette vasketrinnet, og avslutt med vann. Tørk deretter dekslene helt ved hjelp av en luftledning eller N₂ og plasma-ren med argon i 3 min.
   3. Plasser de rene dekslene på filterpapir (90 mm) i en vevskulturfat (100 x 20 mm) og inkuber i en 70 °C ovn mens du utfører følgende trinn.
      MERK: Plasmarengjøringen kan erstattes med andre kjemiske rengjøringsmetoder⁴⁹.
   4. Forbered 80% etanoloppløsning med dH₂O og juster pH til 2.0 ved hjelp av HCl. Tilsett 1 ml av dette til en 10 mg aliquot mPEG og 1 ml til en 10 mg aliquot av bPEG. Vortex å oppløse, som ikke bør ta mer enn 30 s.
   5. Ta 100 μL av bPEG-oppløsningen og tilsett 900 μL 80% etanol (pH 2.0). Denne oppløsningen er 1 mg/ml bPEG. Lag deretter en løsning av begge PEG-ene som følger, bland grundig.
      1. 200 μL 10 mg/ml mPEG (sluttkonsentrasjon: 2 mg/ml).
      2. 10 μL av 1 mg/ml bPEG (sluttkonsentrasjon: 10 μg/ml).
      3. 790 μL av 80% etanol (pH 2.0) oppløsning.
   6. Ta dekslene ut av ovnen. Dispenser forsiktig 100 μL av PEG-oppløsningen på midten av hvert deksle, og sørg for at bare toppoverflaten er våt. Plasser deretter glidene tilbake i ovnen og inkuber i 20 til 30 minutter.
   7. Når dekslene begynner å ta på seg et hullete utseende, med små sirkler som er tydelige over overflaten, fjern dem fra ovnen.
   8. Vask hvert deksle med 100% etanol, tørk med en luftlinje, og legg tilbake i ovnen. Inkuber bare for tiden som kreves for å lage kamre i trinn 2.
2. Kammer forberedelse
   1. Rengjør et mikroskopsklie for bruk i kammeret. Klipp to stykker dobbeltsidig tape, ca 2 cm i lengde.
   2. Plasser ett stykke langs midten av den lange kanten av mikroskopet. Kontroller at kanten på båndet er på linje med kanten på lysbildet. Plasser det andre tapestykket omtrent 2 mm under det første tapestykket slik at de to er parallelle og justerte.
   3. Ta en av de funksjonaliserte dekslene fra ovnen (opprettet i 3.1). Fest forsiktig dekslene på tapen slik at siden belagt med PEG er med forsiden ned og direkte kontakt med båndet, som vist i figur 1. Bruk en pipettespiss til å trykke forsiktig ned på skyvbåndgrensesnittet for å sikre at dekslene er ordentlig festet til lysbildet.
   4. Klipp overflødig tape hengende over lysbildet med et barberblad. Disse kamrene kan brukes umiddelbart eller plasseres parvis i et 50 ml rør og lagres i en -80 °C fryser for fremtidig bruk. Det er viktig å lagre umiddelbart eller overflaten vil forringes.
3. Utføre myosin 5a TIRF mikroskopianalyse
   1. Forbered løsningene for myosin 5a invertert motilitetsanalyse beskrevet i tabell 3 og hold dem på is.
   2. Vask kammeret med 10 μL 50 mM MB med 1 mM DTT.
   3. Strømning i 10 μL av 1 mg/ml BSA i 50 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til og vent i 1 min etter den tredje vasken. Bruk hjørnet av et silkepapir eller filterpapir for å transportere løsningen gjennom kanalen.
   4. Vask med 10 μL 50 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til.
   5. Strømning i 10 μL av NeutrAvidin-oppløsningen i 50 mM MB med 1 mM DTT og vent i 1 min.
   6. Vask med 10 μL 50 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til.
   7. Strømning i 10 μL biotinylert rhodamin actin (bRh-Actin) som inneholder 1 mM DTT i 50 mM MB og vent i 1 min. For dette trinnet, bruk en stor kjedelig pipettespiss og unngå pipettering opp og ned for å minimere skjæring av fluorescerende aktinfilamenter for å sikre at lange aktinfilamenter kan festes til overflaten (20-30 μm eller lenger). Et effektivt alternativ er å kutte kjeglen til en standard pipettespiss (med en åpning på ≈1-1,5 mm).
   8. Vask med 10 μL 50 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til.
   9. Strømning i 30 μL endelig buffer med 10 nM myosin 5a lagt til, last deretter umiddelbart på TIRF-mikroskopet og registrer etter å ha funnet det optimale fokuset for TIRF-avbildningsmodalitet. Eksponeringstider mellom 100-200 ms er passende ved 1,4 mW lasereffekt for aktin og GFP-merket myosin. En passende anskaffelsestid for hastighetsanalyse er 3 min.
4. Utføre nonmuscle myosin 2b TIRF mikroskopianalyse
   MERK: I denne delen er detaljene i nonmuscle myosin 2b TIRF-analysen ved bruk av polymeriserte og fosforylaterte filamenter gitt. Detaljert protokoll (avsnitt 4.1-4.3) for fosforylering og polymerisering av nonmuscle myosin-2b i et rør er inkludert.
   1. For å fosforrylat den rensede NM2b, lage en 10x kinase blanding med følgende forhold: 2 mM CaCl₂, 1 μM CaM, 1-10 nM MLCK og 0,1 mM ATP. Dette kan bringes i volum med 500 mM MB med 10 mM DTT. Tilsett 10x kinase blanding til myosin med et volumetrisk forhold på 1:10 og la dette inkubere i 20-30 min ved romtemperatur. Vanligvis er myosinkonsentrasjonen for dette trinnet 1 μM.
   2. For å polymerisere fosforet myosin i filamenter, senk saltkonsentrasjonen av NM2b til 150 mM NaCl. For å gjøre dette, lag en 1x motility buffer (1x MB) uten salt ved å fortynne 4x MB fire ganger i dH₂O. Denne 1x MB kan brukes til å senke saltkonsentrasjonen fordi NM2b ble frosset i en 500 mM saltbuffer.
   3. For hver 3 μL av lager NM2b, tilsett 7 μL 1x MB for å senke saltkonsentrasjonen til 150 mM NaCl og inkubere på is i 20-30 min for å danne NM2b filamenter.
      MERK: Rekkefølgen i pkt. 4.1-4.3 er ikke avgjørende så lenge NM2b er fosforilert og den endelige saltkonsentrasjonen er 150 mM. Inkubasjon i rekkefølgen 30 min-1 h gir nok tid til fullstendig fosforylering og polymerisering.
   4. Forbered løsningene for nonmuscle myosin 2b invertert motilitetsanalyse beskrevet i tabell 3 og hold dem på is.
   5. Vask kammeret med 10 μL 150 mM MB med 1 mM DTT.
   6. Strømning i 10 μL av 1 mg/ml BSA i 150 mM MB med 1 mM DTT Gjenta denne vasken to ganger til og vent i 1 min etter den tredje vasken. Bruk hjørnet av et silkepapir eller filterpapir for å transportere løsningen gjennom kanalen.
   7. Vask med 10 μL 150 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til.
   8. Strømning i 10 μL av NeutrAvidin-løsningen i 150 mM MB med 1 mM DTT og vent i 1 min.
   9. Vask med 10 μL 150 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til.
   10. Strømning i 10 μL bRh-Actin og vent i 1 min. For dette trinnet, bruk en stor kjedelig pipettespiss og unngå pipettering opp og ned for å minimere skjæring av fluorescerende aktinfilamenter, for å sikre at lange aktinfilamenter kan festes til overflaten (20-30 μm eller lenger). Et effektivt alternativ er å kutte kjeglen til en standard pipettespiss.
   11. Vask med 10 μL 150 mM MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til.
   12. Strømning i 10 μL av den ikke-muskle myosin 2b-løsningen (ca. 30 nM) og vent i 1 min.
   13. Vask med 10 μL 150 MB med 1 mM DTT. Gjenta denne vasken to ganger til.
   14. Strømning i 30 μL endelig buffer, last deretter umiddelbart inn på TIRF-mikroskopet og registrer etter å ha funnet det optimale fokuset for TIRF-avbildningsmodalitet. Eksponeringstider mellom 100-200 ms er passende ved 1,4 mW lasereffekt for aktin og GFP-merket myosin. En passende anskaffelsestid for hastighetsanalyse er 3 min.

4. Bildeanalyse

1. Bildeanalyse for glidende aktinfilamentanalyse
   MERK: Bildene kan analyseres ved hjelp av programvaren og håndbøkene som er lenket i materiallisten. Det er viktig å merke seg at programmet som er beskrevet her krever TIFF-stabler for analyse. Prosessen for å analysere glidende actin filamentanalyse er som følger⁵⁰.
   1. Last opp raw-filmstakker til en angitt mappestruktur, og skriv inn den øverste katalogen i filmmappene i programmet.
      MERK: Programmet analyserer filene gjennom denne katalogen og underkatalogene, og behandler katalogene på laveste nivå som replikerer. Gjennomsnittlig statistikk for hver gruppe replikeringer vil bli produsert. I dette tilfellet ble en enkelt film brukt for hver myosin. Når du karakteriserer en ny myosin eller undersøker en ny eksperimentell tilstand, anbefales det å analysere filmer fra tre synsfelt (FOV) per kammer for totalt tre kamre og å gjenta denne arbeidsflyten for tre forberedelser av myosin som undersøkes.
   2. Bruk skriptet "stack2tifs" sammen med den brukerinndelte bildefrekvensen til å konvertere hver TIFF-stakk til en mappe som inneholder en serie individuelle TIFF-filer og en tilsvarende metadata.txt fil som inneholder starttidspunktet for hver ramme. For data som ikke er i TIFF-stakkformatet, må en konvertering først brukes ved hjelp av programvare som de som er oppført i Materialfortegnelser.
      MERK: Dette skriptet er den delen av programvarepakken. Informasjonen i skriptet finner du her: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
   3. Bruk parameteren -px , som er pikselstørrelsen (i nm) under anskaffelsen. I dette tilfellet er pikselstørrelsen 130 nm. Bruk parameterne -xmax og -ymax til å skalere aksene for scatter-plottutgangene. Disse tilsvarer den lengste plottede filamentlengden og maksimal plottet hastighet (i nm/s).
      MERK: Dette er estimerte verdier og kan settes til høyere verdier enn forventet for å sikre at data finnes i plottet. Etter analyse kan rådataene også eksporteres for bruk i annen statistisk programvare eller grafer for visning og analyse.
   4. Bruk -minv -parameteren, som er en parameter for minimumshastighetskutt, til å definere filamentene som ikke beveger seg, og kan derfor utelates fra analysen. For en langsom myosin som NM2b må denne parameteren være lav (i dette eksemplet 5 nm/s) for å unngå å kutte ut ekte glidebevegelser. For en rask myosin som M5a kan denne parameteren være høyere (i dette eksemplet 100 nm/s) for å bruke et strengere filter, samtidig som den beholder den sanne glidehastighetsfordelingen.
   5. Bruk -pt cutoff-parameteren til å identifisere jevn bevegelse. For hvert prøvevindu beregnes en verdi som tilsvarer 100 x hastighetsstandardavvik/gjennomsnittlig hastighet. Spor med høyere verdier enn cutoff, har mer variabel hastighet og er ekskludert fra videre analyse. I dette eksemplet ble det brukt en avskjæringsverdi på 33. Spor med høyere verdier har mer variabel hastighet og er ekskludert fra videre analyse.
   6. Bruk -maxd for å angi en maksimal tillatt koblingsavstand mellom rammer. Dette er en beregnet ramme-til-ramme avstand beveget av centroid av filament i enheter av NM. Det kan være nyttig for å ekskludere sporadiske bevegelser eller feil kobling mellom filamenter. I eksemplene her ble parameteren stående på standardverdien på 2000 nm.
2. Bildeanalyse for TIRF mikroskopianalyse
   MERK: Prosessen for å analysere tirf-analysen med enkeltmolekylet på bildebehandlingsprogramvaren som er spesifikt oppført i Tabell over materialer er som følger²⁹.
   1. Klikk og dra den innspilte mikroskopivideoen til programvarens arbeidsområde for å åpne den⁵¹. Deretter deler du oppkjøpskanalene. Klikk bilde > farge > delte kanaler.
      MERK: Ved merkbar scenedrift under oppkjøpet må bildene stabiliseres for å korrigere instrumentaldriften på bildeplanet. I dette tilfellet ble det ikke brukt kompensasjon for Z-aksedrift da mikroskopet som brukes til å skaffe disse dataene stabiliserer Z-fokusbrønnen. For å stabilisere bildet på bildeanalyseprogrammet, installer riktig stabilisator-plugin-modul som er koblet på materiallisten. Bildestabilisatoren antar faste posisjoner for objektene i bildet og bruker et rullende gjennomsnitt av de forrige delbildene som referanse. Den anbefalte prosedyren er derfor å begynne med kanalen som inneholder bilder av merket aktin, siden dette er i fast stilling.
   2. Klikk på Plugins, og finn deretter Bildestabilisator; kontroller at Oversetting er valgt, og behold standardinnstillingene. Merk av i boksen ved siden av Logg transformasjonskoeffisienter. Hvis du bruker dette loggtrinnet, kan de beregnede skiftparameterne brukes på den andre kanalen i neste trinn. Tillat at prosessen fullføres.
   3. Deretter åpner du kanalen med merket myosin og bruker stabiliseringen ved å klikke på Plugins > Image Stabilizer Log Applier. Hvis bilder av aktin ikke kan anskaffes under samme oppkjøp på grunn av et krav om høyere hastighetsavbildning i en enkelt kanal, stabiliserer driften bildestakken ved å velge en region som inneholder statiske objekter som en biotinylert fiducial markør eller fluoroforer bundet ikke-spesifikt til biotin-PEG-overflaten. Dette området kan beskjæres fra den opprinnelige stakken og stabiliseres, etterfulgt av bruk av de resulterende skiftverdiene til den opprinnelige stakken.
      MERK: I praksis vil driften observert i motilitetseksperimenter være ubetydelig i forhold til bevegelsen av myosiner som beveger seg på flere hundre nm / s, men for de tregeste myosinene blir dette en viktig vurdering.
   4. Åpne deretter TrackMate, klikk på Plugins; Deretter klikker du på Sporing i rullegardinmenyen og til slutt på TrackMate. På dette tidspunktet er bildeanalysen gjenstand for optimalisering basert på parametrene til fluorofor- og analyseforholdene. Imidlertid er ideelle startparametere som følger.
      1. Kalibreringsinnstillinger: Behold alle standardverdiene.
      2. Detektor: LoG-detektor.
      3. Estimert blob diameter: 0,5-1,0 mikron.
      4. Terskel: 25-200. (Dette kan bestemmes ved å klikke på Forhåndsvisning etter å ha valgt et tall for å se om de oppdagede flekkene samsvarer med filmen og justerer riktig.)
      5. Innledende terskelverdi: ikke angitt.
      6. Utsikt: HyperStack Displayer.
      7. Angi filtre på flekker: ikke angitt.
      8. Tracker: Enkel LAP tracker.
         MERK: Disse avhenger av bildefrekvens og myosinhastighet og må være store nok til å koble til påfølgende posisjoner mens du ekskluderer uønskede forbindelser mellom forskjellige partikler.
      9. Kobling maks avstand: 1,0 mikron.
      10. Gap-lukking maks avstand: 1,0 mikron.
      11. Gaplukking maks rammegap: 1.
      12. Angi filtre på spor: Sporforskyvning (>0.39- for å inkludere bare flekker som beveger seg mer enn 3 piksler), Flekker i spor (>3-for å inkludere bare spor med minst 3 flekker). Andre filtre som Minimal Hastighet kan innføres for å ekskludere flekker som stopper i lange perioder. Resultatene av filtrering må kontrolleres ved visuell inspeksjon av spor for å sikre at falske spor (dvs. myosinbevegelse i bakgrunnen som ikke er langs et aktinspor) fjernes samtidig som sporene som er knyttet til aktin beholdes.
   5. Når displayalternativer-skjermen kommer opp, klikker du på Analyse for de relevante utgangene. Lagre de tre tabellene som produseres (Spor statistikk, Koblinger i sporstatistikk og Plasser i sporstatistikk). Sporstatistikk-tabellen vil inneholde hastighets- og forskyvningsdata som deretter kan analyseres for å karakterisere et nytt protein eller effekten av en bestemt eksperimentell tilstand, for eksempel.

Representative Results

Rensing av myosin kan evalueres ved å redusere natriumdidesulfat-polyakrylamid (SDS-PAGE) geleelektroforese som vist i figur 2. Mens denne figuren representerer den endelige, post-dialyzed myosin, kan SDS-PAGE utføres på aliquots fra de ulike stadiene av renseprosedyren for å identifisere produkter som går tapt til supernatanten. Myosin 5a HMM har et bånd i 120-130 kDa-serien, og nonmuscle myosin 2b i full lengde har et bånd i 200-230 kDa-serien, tilsvarende tunge^{kjeder 29,44}. Myosin 5a har også et band nær 17 kDa-merket, som markerer calmodulin. Den nonmuscle myosin 2b har et band på ca 17 kDa, betegner ELC. Fordi en GFP-merket RLC er til stede i dette NM2b-preparatet, vises RLC på ca. 47 kDa; Imidlertid vil en umerket RLC være til stede på omtrent 20 kDa hvis den ikke er merket med en GFP.

Glidende aktinfilamentanalyse vist i video 1 og figur 3 representerer egenskapene til en ideell og sporbar film. Denne glidende aktinfilamentanalysen har den glatte bevegelsen av merkede aktinfilamenter. Den svarte aktinvasken sikrer at de døde myosinhodene fjernes fra målefeltet, noe som ytterligere bidrar til den generelle glatte bevegelsen av aktinfilamentene. De fluorescerende merkede filamentene er korte nok til at en enkelt filament ikke krysser over på seg selv, noe som er mer optimalt for sporingsprogrammet. Aktinfilamenter som er for lange, vil krysse over andre filamenter, noe som kan gi vanskeligheter med å glide actin filament analysesporingsprogram. Dette problemet kan unngås ved å pipettere opp og ned 10-20 ganger for å skjære aktinfilamentene før de lastes på dekslene.

Når det gjelder NM2b, kan bruken av metylcellulose forbedre kvaliteten på de innspilte filmene betydelig, da det reduserer spredningen av aktinet bort fra bildeflaten. Dette er ikke nødvendig for M5a fordi det høyere pliktforholdet gir mulighet for en sterkere festing av aktin til den myosinbelagte overflaten. Hvis metylcellulose brukes, er det nødvendig å transportere løsningen gjennom kammeret for å sikre at løsningen strømmer gjennom. Som vist i Video 2, når alle andre forhold er identiske bortsett fra utelukkelse av metylcellulose, forblir aktinfilamentene ikke så nært forbundet med den myosinbelagte overflaten.

Derimot er målet for den omvendte motilitetsanalysen vist i video 3 og figur 4 å introdusere overflate-tethered fluorescerende aktinfilamenter som myosinbevegelse kan observeres på. Et viktig krav til den omvendte analysen er å sikre at myosinbevegelsen konsekvent observeres på tvers av FOV, som vist. Bruken av en blanding av DTT, glukose, katalisase og glukoseoksidase kan minimere fotobleking for å muliggjøre lengre^{målinger 52}. Videre, hvis anskaffelsesraten for analysen er lav, kan det å lukke belysningslyset mellom å skaffe rammer hjelpe med overdreven fotobleaching. Lukking av eksitasjonslyset kan gjøres via en mekanisk lukker, eller et acoustooptisk justerbart filter (AOTF).

Figur 1: Fremstilling av funksjonaliserte strømningscellekamre. (A) Begynn med en rengjort mikroskopsklie, to stykker dobbeltsidig tape kuttet til ca. 2 cm, og en funksjonalisert deksle. (B) Legg båndet til midt på mikroskopet. (C) Fest dekslene til båndet med belegget (dvs. nitrocellulose) vendt ned og trykk forsiktig på de overlappende områdene med båndet ved hjelp av en pipettespiss i plast for å sikre at dekslene har festet seg til kammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: SDS polyakrylamidgelelektroforese av uttrykt NM2b og M5a-HMM. (A) Et representativt SDS PAGE gel-bilde for et NM2b tungt kjede i full lengde (≈230 kDa) og GFP-RLC (≈47 kDa) og ELC (≈17 kDa). Gelbilde gjengitt og modifisert fra Melli et al. (2018)²⁹. (B) Et representativt gelbilde av SDS PAGE for et M5a-HMM-lignende tungt kjede (≈120 kDa) og calmodulin (≈17 kDa). Vær oppmerksom på at gelen i dette bildet ikke har en GFP satt inn i C-terminalenden. En GFP satt inn i myosin tung kjeden øker molekylvekten med ≈27 kDa. Gelbilde reprodusert og modifisert ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry⁴⁴. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Glidende aktinfilamentanalyseresultater ervervet via TIRF-belysning. (A) Eksempelramme fra en film som viser translokasjon av rhodamin-falloidin merket aktinfilamenter (i rødt) på 0,2 μM NM2b i nærvær av 0,7% metylcellulose ved 30 °C. Skalalinje = 10 μm. (B) Filament sporingsbildeutgang fra FASTrack-programmet for NM2b for samme FOV som vist i (A) Skalalinje = 10 μm. (C) Representativt histogram av acto-NM2b glidehastighet, som viser at denne prøven av NM2b kan generere en aktin glidehastighet på 77 ± 15 nm/s (gjennomsnittlig ± standardavvik; antall spor = 550). (D) Eksempelramme fra en film som viser translokasjon av rhodamin-falloidin merket aktinfilamenter (i rødt) på 75 nM M5a-HMM. Skalalinje = 10 μm. (E) Filament sporingsbildeutgang av FASTrack-programmet for M5a-HMM for samme FOV som vist i (D) Skalalinje = 10 μm. (F) Et representativt histogram av acto-M5a-HMM glidehastighet, som viser at dette utvalget av M5a kan generere en aktinglidinghastighet på 515 ± 165 nm/s (gjennomsnittlig ± standardavvik; antall spor = 25098). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Inverterte analyseresultater innhentet via TIRF-belysning. (A) En representativ FOV fra en tokanals sammenslått bildestakk som viser bevegelsen av NM2b-filamenter (vist i grønt) på biotinylerte aktinfilamenter merket med AF647-falloidin (vist i blått) ved 30 °C. Polymeriserte filamenter av rekombinant uttrykt og renset NM2b co-uttrykt med ELC og GFP-RLC observeres som de grønne, langstrakte partiklene i FOV. Skalastang = 10 μm. (B) Representativt histogram for hastigheten til NM2b-filamenter. Analyse ble utført ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren som er beskrevet i Materialfortegnelser. Enkelt NM2b filamenter har en hastighet på 84 ± 22 nm/s (gjennomsnittlig ± standardavvik; antall partikler sporet = 133), når du beveger deg langs enkelt aktinfilamenter. (C) Eksempel kymografi av NM2b filament bevegelse langs en enkelt aktin filament. Legg merke til at noen av partikkelområdene viser en "rotasjon" av NM2b-filamentet, langs aktinfilamentet, som mest sannsynlig representerer tiden da den ene siden av den bipolare NM2b filament løsner fra aktinfilamentet, som vist tidligere i Melli et al.²⁹. (D) En representativ FOV av enkeltmolekylbevegelsen M5a-HMM (vist i grønt) på biotinylerte aktinfilamenter merket med rhodamin-falloidin (vist i rødt). Skalastang = 10 μm. (E) Representativt histogram for løpelengde på M5a-HMM, passer til en enkelt eksponentiell. Analyse ble utført ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren som er beskrevet i Materiallisten. Den karakteristiske løpelengden er 1,3 μm med et konfidensintervall på 95% på 1,23-1,42 μm i dette eksemplet. (F) Representativt histogram av enkeltmolekyl M5a-HMM hastighet på enkelt aktinfilamenter. Analysert datautgang fra bildeanalyse viser en gjennomsnittlig hastighet på 668 ± 258 nm/s (gjennomsnittlig ± standardavvik; antall partikler sporet = 684). (G) Eksempel kymografi av enkeltmolekyler av M5a-HMM bevegelse langs en enkelt aktinfilament. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Sammenligning av NM2b og M5a-HMM glidende aktinfilamentanalyse. NM2b glidende aktinfilamentanalyse ble utført i nærvær av metylcellulose (venstre, videopanel A) og M5a-HMM i fravær av metylcellulose (høyre; videopanel B) ved 30 °C. Vær oppmerksom på at tidsstempelet utvikler seg raskere i NM2b-videopanelet, sammenlignet med M5a-HMM-videopanelet for å vise bevegelsen til de rhodaminmerkede aktinfilamentene (rødt) som er omtrent det samme. Dette er siden den faktiske aktintranslokasjonshastigheten til NM2b er nær 7 ganger langsommere enn for M5a-HMM (77 nm/s, mot henholdsvis 515 nm/s, hentet fra den gaussiske toppen som passer til histogrammet i figur 3). Skalalinje = 10 μm i begge videopanelene. NM2b-data innhentet med 0,33 bilder per sekund med 200 ms eksponering. M5a-HMM-data samlet inn med 5 bilder per sekund med 200 ms eksponering (kontinuerlig) og deretter ned samplet til 1 bilde per sekund. Tidsstempler ble lagt til ved hjelp av plugin-modulen som er beskrevet i Materiallisten. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Gliding actin filament analyse av NM2b i fravær av metylcellulose. Når alle andre forhold er de samme bortsett fra fravær av metylcellulose, holder aktinfilamentene seg noen ganger ikke godt til dekslene med 0,2 μM NM2b, noe som fører til filmer av lavere kvalitet med aktinfilamenter "flopping" nær overflaten av NM2b-belagte deksler. Skalastang = 10 μm. Dette kan løses ved å introdusere metylcellulose for å vise den glatte bevegelsen til aktinfilamentene, som vist i venstre videopanel i Video 1 (NM2b glidende aktinfilamentanalyse). Et annet alternativ er å øke NM2b-konsentrasjonen til ≈1 μM. Denne filmen ble anskaffet med 0,33 bilder per sekund med 200 ms eksponering. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3: Sammenligning av NM2b og M5a-HMM invertert motilitetsanalyse. NM2b invertert motilitetsanalyse ble utført i nærvær av metylcellulose og registrert med en hastighet på 0,33 bilder per sekund ved bruk av en lukker (venstre; videopanel A), Videopanel C viser samme FOV som A, men med partikler identifiseres og spores ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. På samme måte ble den omvendte motilitetsanalysen for M5a-HMM i fravær av metylcellulose registrert med en hastighet på 5 bilder per sekund (høyre; videopanel B). Videopanel D viser samme FOV som B, men med partikler identifisert og sporet ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Skalastolper = 10 μm i alle videopaneler. De to laserne ble vekslet frem og tilbake ved bruk av et enkelt kamera for oppkjøp. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Navn på buffer	Komposisjon	Trinn(er) brukt	Kommentarer
M5a-ekstraksjonsbuffer	0,3 M NaCl	1.1	Hold deg på isen.
	15 mM MOPS, pH 7,2
	15 mM MgCl2
	1,5 mM EGTA
	4,5 mM NaN3
NM2b utvinningsbuffer	0,5 M NaCl	1.1	Hold deg på isen.
	15 mM MOPS, pH 7,2
	15 mM MgCl2
	1,5 mM EGTA
	4,5 mM NaN3
Buffer A	0,5 M NaCl	2.2	Hold deg på isen.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM ATP
	1 mM DTT
	5 mM MgCl2
Buffer B	0,5 M NaCl	2.3	Hold deg på isen.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM DTT
Elution-buffer	0,5 M NaCl	3.1	Hold deg på isen.
	0,5 mg/ml FLAGG peptid
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	pH 7,2
M5a dialysebuffer	500 mM KCl	4.1	Bruk kald dH2O for å få volum.
	10 mM MgCl2
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	1 mM DTT
NM2b dialysebuffer	25 mM NaCl	4.1	Bruk kald dH2O for å få volum.
	10 mM MgCl2
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	1 mM DTT
NM2b-lagringsbuffer	0,5 M NaCl	5.1	Hold deg på isen.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3

Tabell 1: Buffere som brukes ved proteinrensing.

Navn på buffer	Sammensetning (M5a)	Sammensetning (NM2b)	Trinn(er) brukt (M5a/NM2b)	Kommentarer
4X motilitetsbuffer (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2	80 mM MOPS, pH 7,2		Vakuumfilter og oppbevares i 4 °C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	pH 7,4	pH 7,4
50 mM saltmotilitet buffer (50 mM MB)	25 % v/v 4X MB	25 % v/v 4X MB		Vakuumfilter og oppbevares i 4 °C
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	Hev til volum med dH2O	Hev til volum med dH2O
500 mM saltmotilitet buffer (500 mM MB)	N/A	25 % v/v 4X MB		Vakuumfilter og oppbevares i 4 °C
		500 mM NaCl
		Hev til volum med dH2O
Myosin	0,05-0,1 μM myosin	0,2 μM myosin	4.2/5.2	Hold deg på isen.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Fortynn i 50 mM MB	Fortynn i 500 mM MB
1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA)	1 mg/ml BSA	1 mg/ml BSA	4.3/5.3	Hold deg på isen.
	Fortynn i 50 mM MB	Fortynn i 500 mM MB
	1 mM DTT	1 mM DTT
5 μM umerket F-aktin i 50 mM MB (svart aktin)	5 μM umerket F-aktin	5 μM umerket F-aktin	4.5/5.5	Hold deg på isen. Skjær aktin ved pipettering opp og ned 5-10 ganger, eller ved hjelp av en sprøyte.
	1 μM calmodulin (CaM)	1 mM ATP
	1 mM ATP	0,2 mM CaCl2
	Fortynn i 50 mM MB	1 μM cam
		1–10 nM myosin lyskjede kinase (MLCK)
		Fortynn i 50 mM MB
MB med 1 mM DTT og 1 mM ATP	1 mM DTT	1 mM DTT	4.6/5.6	Hold deg på isen.
	1 mM ATP	1 mM ATP
	Fortynn i 50 mM MB	Fortynn i 50 mM MB
MB med DTT	1 mM DTT	1 mM DTT	4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9	Hold deg på isen.
	Fortynn i 50 mM MB	Fortynn i 50 mM MB
20 nM Rhodamine-Phalloidin F-aktin (Rh-Actin)	20 nM Rhodamin-falloidin F-aktin	20 nM Rhodamin-falloidin F-aktin	4.8/5.8	Hold deg på isen. Ikke virvel.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Fortynn i 50 mM MB	Fortynn i 50 mM MB
Endelig buffer	50 mM KCl	0,7 % metylcellulose (valgfritt)	4.10/5.10	Tilsett glukose, glukoseoksidase og katasase umiddelbart før du utfører eksperimentet. Hold deg på isen.
	20 mM MOPS, pH 7,2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	20 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	1 mM ATP	0,1 mM EGTA
	50 mM DTT	1 mM ATP
	1 μM calmodulin	50 mM DTT
	2,5 mg/ml glukose	1–10 nM MLCK
	100 μg/ml glukoseoksidase	0,2 mM CaCl2
	40 μg/ml katarase	1 μM calmodulin
		2,5 mg/ml glukose
		100 μg/ml glukoseoksidase
		40 μg/ml katarase

Tabell 2: Buffere brukt i glideanalyse.

Navn på buffer	Sammensetning (M5a)	Sammensetning (NM2b)	Trinn(er) brukt (M5a/NM2b)	Kommentarer
4X motilitetsbuffer (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2	80 mM MOPS, pH 7,2		Vakuumfilter og oppbevares i 4 °C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	pH 7,4	pH 7,4
50 mM saltmotilitet Buffer (50 mM MB)	25 % v/v 4X MB	25 % v/v 4X MB		Vakuumfilter og oppbevares i 4 °C
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	Hev til volum med dH2O	Hev til volum med dH2O
150 mM saltmotilitetsbuffer (150 mM MB)		25 % v/v 4X MB		Vakuumfilter og oppbevares i 4 °C
		150 mM NaCl
		Hev til volum med dH2O
Myosin		30 nM myosin	Se "Endelig buffer" Oppskrift/4.12	Hold deg på isen.
		1 mM DTT
		Fortynn i 150 mM MB
2 mg/ml NeutrAvidin	2 mg/ml NeutrAvidin	2 mg/ml NeutrAvidin	3.5/4.8	Hold deg på isen.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Fortynn i 50 mM MB	Fortynn i 150 mM MB
1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA)	1 mg/ml BSA	1 mg/ml BSA	3.3/4.6	Hold deg på isen.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Fortynn i 50 mM MB	Fortynn i 150 mM MB
200 nM rhodamin-falloidin biotinylert F-aktin (bRh-Actin)	200 nM rhodamin-falloidin biotinylert F-aktin	200 nM rhodamin-falloidin biotinylert F-aktin	3.7/4.10	Unngå skjæring ved ikke å virvelere eller pipettere opp og ned. For å blande, inverter forsiktig.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Fortynn i 50 mM MB	Fortynn i 150 mM MB
MB med DTT	50 mM DTT	50 mM DTT	3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13	Hold deg på isen.
	Fortynn i 50 mM MB	Fortynn i 150 mM MB
Endelig buffer	50 mM KCl	0,7 % metylcellulose (valgfritt)	3.9/4.14	Tilsett glukose, glukoseoksidase og katasase umiddelbart før du utfører eksperimentet. Hold deg på isen.
	20 mM MOPS, pH 7,2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	20 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	1 mM ATP	0,1 mM EGTA
	50 mM DTT	1 mM ATP
	1 μM calmodulin	50 mM DTT
	2,5 mg/ml glukose	1–10 nM MLCK
	100 μg/ml glukoseoksidase	0,2 mM CaCl2
	40 μg/ml katarase	1 μM calmodulin
	10 nM myosin	2,5 mg/ml glukose
		100 μg/ml glukoseoksidase
		40 μg/ml katarase

Tabell 3: Buffere brukt i TIRF-analyse.

Discussion

Presentert her er en arbeidsflyt for rensing og in vitro karakterisering av myosin 5a og nonmuscle myosin 2b. Dette settet med eksperimenter er nyttig for å kvantifisere de mekanokjemiske egenskapene til rensede myosinkonstruksjoner på en rask og reproduserbar måte. Selv om de to myosinene som vises her bare er to spesifikke eksempler av de mange mulighetene, kan forholdene og teknikkene brukes, med litt skreddersøm, til de fleste myosiner og til mange andre motorproteiner.

Protokollene som diskuteres her er gjenstand for variasjoner avhengig av laboratoriets individuelle behov og eksperimenter. For eksempel, som diskutert i delen Expression and Molecular Biology, ble proteinene som brukes i dette papiret generert fra en co-infeksjon av to eller flere virus; Vellykket proteinuttrykk kan imidlertid også oppnås med vektorer med flere uttrykk, for eksempel p-FastBac dual expression-vektoren eller BiGBac-uttrykkssystemet⁵³.

Flere faktorer kan hemme den vellykkede produksjonen av det rekombinante proteinet. For å forhindre proteinforringelse er det viktig at hvert trinn i proteinrensingen fullføres ved riktig temperatur, med alle sentrifugeringstrinn som forekommer ved 4 °C og alle andre trinn utføres på is. Overflødige bånd kan være tydelige i gelen til det dialyzed proteinproduktet. Dette kan være en indikasjon på nedbrytning eller forurensning. Etterfølgende rensing via størrelsesekskludering eller ionutvekslingskromatografi kan forbedre renheten til prøvene⁵⁴. Til den effekten anbefales det å lagre aliquots på hvert trinn i proteinrensingsprosessen for feilsøking, hvis det skulle være et lavt utbytte av myosin eller mistenkt proteinforurensning. Noen ganger kan det være utilstrekkelig binding av lysatet til harpiksen i trinn 1,8, noe som kan føre til tap av myosin til supernatanten i etterfølgende sentrifugeringer. Dette kan løses ved å variere varigheten av harpiksbinding i løpet av dette trinnet, til og med la det binde seg over natten, om nødvendig. Lengre inkubasjonstider medfører større risiko for proteinforringelse hvis forurensningsproteaser ikke er tilstrekkelig hemmet, og myosiner med proteolytisk følsomme regioner vil bli negativt påvirket. I tillegg kan feil vasking av harpiksen både før og etter bruk føre til elution av et uønsket proteinprodukt, så det er viktig at de riktige protokollene følges før og etter bruk av FLAG-affinitetharpiksen. Hvis harpiksen vaskes umiddelbart etter bruk og lagres på riktig måte, kan den gjenbrukes opptil 20 ganger.

Det er viktig å merke seg at proteinforringelse også oppstår i uttrykksstadiet, og forkorte uttrykkstider kan være fordelaktig når det gjelder nedbrytning, selv om dette kan være på bekostning av det totale utbyttet. Å følge prosedyrene som er skissert her for å overvåke proteinprøven på forskjellige stadier av protokollen (dvs. før, under og etter rensing) vil bidra til å bestemme stadiene som er nødvendige for optimalisering. For myosiner som gjentatte ganger motstår vellykket uttrykk og rensing, kan vanlige problemer være samuttrykk med utilstrekkelige eller upassende lyskjeder samt feil folding under overekspressering. Passende lyskjeder må velges basert på kjente interaksjoner når det er mulig, og tunge kjede-til-lyskjede baculovirusforhold må testes i småskala eksperimenter for å bestemme det optimale. For myosiner som aggregerer eller gir lite eller ingen løselig aktivt produkt, kan samuttrykk med anstander hjelpe til med å skaffe aktivt protein^54,55.

Rensede myosinprodukter inneholder uunngåelig en liten befolkning av skadet myosin, referert til som "døde hoder", som kan adresseres på to måter. En metode, skissert i denne protokollen, innebærer å flyte umerket, eller "svart", handle gjennom kammeret i glidende aktinfilamentanalyse. Deretter vaskes med ATP forårsaker funksjonelle myosiner å dissosiere fra den svarte aktin mens døde hoder vil forbli bundet til denne unlabeled actin på grunn av deres manglende evne til å hydrolysere ATP og på grunn av deres høye affinitet. Mens du utfører den svarte aktinvasken, kan en sprøyte brukes til å skjære aktin effektivt. Ytterligere skjæring kan oppnås ved virveling, forutsatt at eventuelle resulterende bobler fjernes ved sentrifugering. En alternativ metode er å selektivt pellet de døde hodene fra myosinprøven ved å blande myosin med F-aktin og Mg-ATP ved høye saltkonsentrasjoner (0,5 M) og sedimentering i en bordplate ultracentrifuge. Myosinene som er i stand til å hydrolysere ATP under disse forholdene, forblir ikke bundet til aktin på grunn av deres lave affinitet for aktin under disse høye saltforholdene og finnes i supernatanten, mens myosin døde hoder forblir bundet til aktin i pellet⁵⁶. På samme måte kan en sedimentering med aktin og resuspension av pellet også brukes til å fjerne myosiner som ikke er i stand til å binde seg til å handle i fravær av ATP. Legg merke til at en liten andel av denne typen døde hoder vil ha mindre innvirkning på denne typen analyser. Ved å gjøre en nukleotidfri sedimentering og resuspensjon etterfulgt av en ATP-bundet sentrifugering og resuspension, kan myosiner som er kompetente for både aktinbindende og ATP-avhengig frigjøring fra aktin isoleres.

Motilitetsanalyser kan også endres på flere måter. For eksempel, i glidende aktinfilamentanalyse for NM2b, er NM2b fosforert i kammeret via tilsetning av MLCK, calmodulin, kalsium og ATP i det svarte aktintrinnet, så vel som i den endelige bufferen. NM2b kan imidlertid også fosforyleres i et rør før analysen utføres. Ved å gjøre det kan prosentandelen av fosforylatert NM2b kvantifiseres ved å kjøre en innfødt gel med en ureaholdig prøvebuffer eller utføre massespektrometri^57,58. Effekten av temperatur på myosinaktivitet kan også undersøkes. Dette kan oppnås ved å bruke et objektivt varmesystem på mikroskopet eller et miljøkabinett, slik at strømningscellen opprettholdes ved konstant temperatur. Ionisk styrke er en annen viktig vurdering. For mange myosiner vil aktinaffinitet og enzymatisk aktivitet økes med lavere ionisk styrke; For andre er høyere ionstyrke nødvendig⁵⁹. I tillegg til å gi verdifull informasjon om myosinmekanismen, kan senking av ionstyrken forbedre motiliteten og gjøre myosin mer tilgjengelig for undersøkelse med mange analyser. I motsetning vil noen motorer vise elektrostatiske tethering effekter, noe som vil bremse motiliteten ved lavere ioniske styrker. Til slutt, når man ser på bevegelsen av NM2b-filamenter, er det avgjørende å opprettholde ionisk styrke innenfor et smalt område (150-200 mM ionisk styrke), og tilnærme seg de som finnes i de fleste celletyper. Bruken av lavere ioniske styrker resulterer i aggregering av myosinfilamentene, mens filamentene depolymererer ved høyere ioniske styrker.

Med mange myosiner, spesielt de med lave forhold, ville betingelsene for den endelige bufferen gitt for M5a resultere i at de fluorescerende merkede aktinfilamentene bare er løst bundet til overflaten eller dissosierer helt. Dette resulterer i uberegnelige bevegelser som kompliserer kvantifisering. Bedre kvalitetsbevegelse kan ofte oppnås ved hjelp av metylcellulose (0,7%) i sluttbufferen. Metylcellulose er et viskøs trengselmiddel og tvinger aktinfilamenter til å holde seg nær overflaten selv når tettheten av vedlagte myosinmotorer er sparsom⁶⁰. På samme måte har det blitt observert at inkludering av metylcellulose i den endelige bufferen til enkeltfilamentmotilitetsanalysen er nødvendig for å observere bevegelse med NM2a, og det samme fenomenet ble rapportert for glatte muskel myosinfilamenter^29,61. Dette øker også prosesjonen til NM2b-filamenter. En potensielt uønsket bivirkning av å bruke metylcellulose i denne analysen er at crowding agent egenskaper kan fremme lateral assosiasjon av myosin filaments i bunter. Alternativer til metylcellulose når du feilsøker mangel på bevegelse eller løst bundet aktinfilamenter i glidende aktinfilamentanalyse, er å senke saltkonsentrasjonen i motilitetsbufferne eller øke myosinoverflatetettheten. Som nevnt ovenfor har en høy ionisk styrke i motilitetsbufferne vist seg å redusere evnen til noen myosiner til å binde seg til actin^29,34,62.

En annen variant av glidende aktinfilamentanalyse er bruk av antistoffer for å forankre myosinet på glassdekslene. Hvis for eksempel en GFP er til stede i C-terminalenden av myosinkonstruksjonen, kan et anti-GFP-antistoff brukes til å fikse GFP-myosin til^{dekslene 36,63,64}. Dette kan hjelpe med å oppnå vellykket motilitet i situasjoner der systemets geometri ellers kan hemme aktintranslokasjon, for eksempel ved testing av kunstige eller korte spakarmer^54,64. I tillegg kan effekten av belastning på translokasjonshastigheter undersøkes i glidende aktinfilamentanalyse ved å bruke aktinbindende proteiner som α-aktinin eller utrophin^39,50,65. En slik måling kan være nyttig for å sammenligne effekten av belastning på et ensemble av myosiner kontra de lastavhengige kinetikkene til en enkelt myosin som kan måles ved hjelp av en optisk fangstanalyse^66,67. Dette kan oppnås ved å legge til økende mengder av et aktinbindende protein sammen med myosin i det første trinnet. Det aktinbindende proteinet binder seg til overflaten og utøver en friksjonsbelastning på aktinfilamentene som flyttes av myosiner, noe som resulterer i en gradert hastighet da konsentrasjonen av aktinbindende protein på overflaten økes³⁹.

Enkeltmolekylet/ensemblemotilitetsanalysen kan også tilpasses for å undersøke effekten av ulike aktinstrukturer på myosinbevegelse. For eksempel, i stedet for å observere myosinbevegelse på toppen av enkelt aktinfilamenter, kan fascin- eller α-aktinmedierte aktinbunter studeres som en in vitro-rekonstituering av aktinfilamentnettverket som finnes i cellene^68,69. Effekten av aktinbindende proteiner som tropomyosin kan også studeres^65,70,71,72.

Vær oppmerksom på at allsidigheten ved å velge en etikett for enkeltmolekylet / ensemblemotilitetsanalysen. I denne rapporten ble en GFP-etikett brukt på både M5a-HMM og NM2b; Mange andre etiketter kan imidlertid brukes. Eksempler er HaloTag eller SNAP-tag, som kan genetisk smeltes sammen til myosin og kovalent binder et syntetisk fargestoff. Fordelen med HaloTag-teknologi ligger i allsidigheten for flere eksperimentelle tilpasninger, for eksempel merkingmed forskjellige farger eller tilf. I tillegg kan bruk av kvanteprikkteknologi brukes til å forbedre oppløsningen av sporing av enkeltmolekylfluorescens, som også adresserer begrensningen av GFPs lave lysstyrke og tendensen til fotobleaching⁷⁴. Tagger kan festes til lette kjeder samt tungt kjede^11,75,76.

For å oppnå suksess i enkeltmolekylet TIRF motility analyse, en nøkkelfaktor bruker en godt blokkert og funksjonalisert overflate. En enkel metode for å oppnå moderat blokkering er å bruke biotinylert-BSA bundet til en nitrocellulose overflate. Selv om dette vil fungere godt nok til å karakterisere mange motorer, inkludert M5a, er nivået av ikke-spesifikk binding på en slik overflate forbudt for å reprodusere ren bevegelse med prøver som NM2b. Et viktig gjennombrudd i denne forbindelse var overgangen til PEGylated overflater dopet med biotin-PEG for funksjonalisering⁷⁷. PEG-overflatene gir et langt overlegent nivå av overflateblokkering, og en defektfri PEGylated overflate kan forbli fri for ikke-spesifikk binding i svært lange perioder. Den spesifikke protokollen som er beskrevet her tillater produksjon av biotinylerte PEG-overflater i løpet av få timer, og hvis de umiddelbart lagres som beskrevet, kan overflatene brukes i flere uker med bare en marginal nedgang i kvalitet.

En viktig vurdering før du samler inn data for sporing er innsamlingsrammefrekvensen. Bevegelsen mellom etterfølgende rammer må være stor nok til å unngå oversamplingsfeil. Høye samplingsfrekvenser vil gi overvurderte hastigheter på grunn av oppdeling av lokaliseringsfeil med et lite tidsintervall og øke den tilsynelatende feilen i målingen. I tilfeller der rådataene er for finprøvet, kan dataene tas ned ved å ta hvert Nth-delbilde for å opprette en ny stakk og vurdere endringen i bildefrekvensen som oppstår. Subpikselbevegelser mellom rammer må unngås og bevegelser på flere hundre nanometer kreves for å oppnå nøyaktige verdier. I alle tilfeller der et nytt utvalg karakteriseres, må resultatene generert av automatisert analyse sammenlignes med et lite datasett med manuelt sporede filamenter for konsistens.

Ved analyse av data fra enkeltmolekylets motilitetseksperimenter må det tas hensyn til når du velger hvilke parametere som skal måles, hvordan du filtrerer data og hvordan data skal tilpasses. Som nevnt ovenfor kan samplingsfrekvensen være en viktig faktor når du analyserer hastighetsdata. For mange myosiner vil prosesjonskjøringer være korte og godt tilnærmet av en rett linje. I slike tilfeller kan start-til-slutt-avstanden til sporet gi et godt mål på løpelengden, og dette kan deles på banens varighet for å gi et godt estimat av hastighet. I tilfeller der sporene er svært lange og følger buede stier rundt bøyde filamenter, vil denne typen analyser gi unøyaktige resultater, og en total tilbakelagt distanse må brukes, ved hjelp av en anskaffelsesgrad som gjør det mulig å få påfølgende lokaliseringspunkter tilstrekkelig god plass til å unngå oversamplingsfeil som beskrevet ovenfor, samtidig som den er nær nok sammen til at den rette linjeavstanden mellom dem forblir en god tilnærming av kurven mellom disse punktene. I tillegg, for motorproteiner med lange løpelengder i forhold til lengden på sporet, må ytterligere statistikk som Kaplan-Meier-estimatet gjøres ved beregning av løpelengder⁷⁸. Det samme gjelder situasjoner der fotobleaching er tilstrekkelig sannsynlig å oppstå før slutten av en prosesjonskjøring. Et annet fenomen som kan observeres i enkeltmolekyl fluorescensstudier er fotoblinking, der fluoroforer bytter raskt mellom på- og av-tilstand og ser ut til å blinke. Dette forekommer vanligvis ikke i disse motilitetseksperimentene; Men hvis dette skjer, kan laserintensiteten og eksponeringstiden reduseres, noe som bør minimere effekten. Flere kjemikalier, inkludert β-mercaptoetanol, Trolox, cyclooctateraene, n-propyl gallate, 4-nitrobenzylalkohol og 1,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan kan brukes til å redusere dette også⁷⁹.

Oppsummert presenterer denne artikkelen detaljerte protokoller som er robuste i deres evne til å kvantifisere mekanokjemiske egenskaper som aktintranslokasjonshastighet, myosintranslokasjonshastighet og myosin kjørelengde. Disse analysene er reproduserbare og kan brukes til å bestemme kvaliteten på renset myosin selv i situasjoner der motile egenskaper ikke er det spesifikke sluttmålet for studien. I tillegg kan endringer som pH, temperatur og kjemiske regulatorer innføres i disse analysene for å undersøke hvordan mekanokjemien til den studerte myosinen påvirkes. Samlet sett kan aktingliding og inverterte motilitetsanalyser gi en bedre forståelse av myosinensembleatferd og intermolekylære variasjoner i molekylærmotormekanikk og kinetikk. De fluorescensmikroskopibaserte analysene som er beskrevet her, støtter en reduksjonists tilnærming til cytoskeletal forskning og kan være et kraftig verktøy for å forstå proteinproteindynamikk in vitro. Sammen kan data samlet inn fra disse svært kontrollerte eksperimentene brukes til å gi råd til mekanobiologer om viktige actomyosin-atferd som kan være relevante på cellebiologiske nivå, og utover.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309628
2 M CaCl2 Solution	VWR	10128-558
2 M MgCl2 Solution	VWR	10128-298
27 Gauge Needle	Becton Dickinson	309623
5 M NaCl Solution	KD Medical	RGE-3270
Acetic Acid	ThermoFisher Scientific	984303
Amyl Acetate	Ladd Research Industries	10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	Millipore Sigma	A7699
Biotinylated G-Actin	Cytoskeleton, Inc.	AB07
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
bPEG-silane	Laysan Bio, Inc	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Calmodulin		PMID: 2985564
Catalase	Millipore Sigma	C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay	Millipore Sigma	WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay	Millipore Sigma	WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets	Millipore Sigma	5056489001	This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C.
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)	EMD Millipore Corporation	UFC910024	The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Coverslip Rack	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay	VWR International	48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay	Azer Scientific	ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)	Fischer Scientific	08-670-5A	The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D0632
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
DYKDDDDK Peptide	GenScript	RP10586	This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Elution Column	Bio-Rad	761-1550	These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol	Fischer Scientific	A4094
G-actin		PMID: 4254541	G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose	Millipore Sigma	G8270
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-295018
HaloTag	Promega	G100A
HCl	Millipore Sigma	320331
KCl	Fischer Scientific	P217-500
Large-Orifice Pipet Tips	Fischer Scientific	02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	78435
Mark12 Unstained Standard Ladder	ThermoFisher Scientific	LC5677
Methanol	Millipore Sigma	MX0482
Methylcellulose	Millipore Sigma	M0512
Microscope Slides	Fischer Scientific	12-553-10
MOPS	Fischer Scientific	BP308-100
mPEG-silane	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase		PMID: 23148220	FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein.
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientific	31050
Nitrocellulose	Ladd Research Industries	10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF	Millipore Sigma	78830	PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM.
Razor Blades	Office Depot	397492
Rhodamine-Phalloidin	ThermoFisher Scientific	R415	Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media	ThermoFisher Scientific	12658-027	This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay	Corning	353025	Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay	Corning	353003	Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips	Thomas Scientific	1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006590
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera	Andor	Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box	Tokai HIT	Custom Thermobox
Microscope Laser Unit	Nikon	LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Model: CR3i
Misonix Sonicator	Misonix	XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Plasma-Cleaner	Diener electronic GmbH + Co. KG	System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm)	Qsonica	4418
Standard Incubator	Binder	Model: 56
Waverly Tube Mixer	Waverly	TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements	FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin	https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate	https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software	NIS Elements (AR package)
	http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
	File:TrackMate-manual.pdf
	https://github.com/turalaksel/FASTrack
	https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md