Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הערכת Nanocrystals בדרכי השתן בבני אדם באמצעות סידן פלואורופור תיוג וניתוח מעקב חלקיקים

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62192
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Urology, University of Alabama at Birmingham

Summary

מטרת מחקר זה הייתה לקבוע אם ניתוח מעקב חלקיקים (NTA) יכול לזהות ולכמת סידן בדרכי השתן המכיל ננו-קריסטלים ממבוגרים בריאים. הממצאים מהמחקר הנוכחי מצביעים על כך ש-NTA יכול להיות כלי פוטנציאלי להערכת ננו-קריסטלים בדרכי השתן במהלך מחלת אבן כליה.

Abstract

אבנים בכליות הופכות שכיחות יותר ברחבי העולם אצל מבוגרים וילדים. הסוג הנפוץ ביותר של אבן כליות מורכב מגבישי סידן אוקסלט (CaOx). Crystalluria מתרחשת כאשר שתן הופך רווי עם מינרלים (למשל, סידן, אוקסלט, פוספט) ולפני היווצרות אבן כליה. שיטות סטנדרטיות להערכת קריסטלוריה באבן לשעבר כוללות מיקרוסקופיה, סינון וצנטריפוגה. עם זאת, שיטות אלה בעיקר לזהות microcrystals ולא nanocrystals. Nanocrystals הוצעו להיות מזיקים יותר לתאי אפיתל הכליות מאשר microcrystals במבחנה. כאן, אנו מתארים את היכולת של ניתוח מעקב חלקיקים (NTA) כדי לזהות nanocrystals השתן האנושי. מבוגרים בריאים הוזנו דיאטה אוקסלט מבוקר לפני שתיית עומס oxalate כדי לעורר nanocrystals השתן. שתן נאסף במשך 24 שעות לפני ואחרי עומס oxalate. דגימות עובדו ונשטפו עם אתנול כדי לטהר דגימות. ננו-קריסטלים בדרכי השתן היו מוכתמים בפלואורופור מחייב הסידן, Fluo-4 AM. לאחר הכתמת, הגודל והספירה של nanocrystals נקבעו באמצעות NTA. הממצאים ממחקר זה מראים NTA יכול לזהות ביעילות nanocrystalluria אצל מבוגרים בריאים. ממצאים אלה מראים NTA יכול להיות שיטת גילוי מוקדם בעל ערך של nanocrystalluria בחולים עם מחלת אבן כליות.

Introduction

גבישי שתן נוצרים כאשר השתן הופך רווי עם מינרלים. זה יכול להתרחש אצל אנשים בריאים אבל הוא נפוץ יותר אצל אנשים עם אבנים בכליות1. נוכחות והצטברות של גבישי שתן יכול להגביר את הסיכון לפתח אבן בכליה. באופן ספציפי, זה קורה כאשר גבישים להיקשר פלאק של רנדל, גרעין, לצבור, ולגדול לאורך זמן2,3,4. Crystalluria מקדים היווצרות אבן כליה והערכה של crystalluria עשוי להיות ערך חזוי לשעבר אבן כליות3,5. באופן ספציפי, קריסטלוריה הוצע להיות שימושי כדי לחזות את הסיכון להישנות אבן בחולים עם היסטוריה של סידן אוקסלט המכיל אבנים6,7.

גבישים דווחו להשפיע לרעה על אפיתל הכליות ואת תפקוד תא החיסון במחזור8,9,10,11,12,13. דווח בעבר כי במחזור מונוציטים מסידן אוקסלט (CaOx) אבן כליה לשעבר דיכאו bioenergetics הסלולר לעומת אנשים בריאים14. בנוסף, גבישי CaOx מפחיתים ביו-אנרגיה תאית ומשבשים הומאוסטזיס של Redox במונוציטים8. צריכת ארוחות עשירות באוקסלט עלולה לגרום לקריסטלוריה שעלולה להוביל לנזק ל tubule הכליות ולשנות את הייצור והתפקוד של מקרומולקולות בדרכי השתן המגנות מפני היווצרות אבן כליות15,16. מספר מחקרים הראו כי גבישי השתן יכולים להשתנות בצורה ובגודל בהתאם ל- pH ולטמפרטורה של השתן17,18,19. יתר על כן, חלבונים בדרכי השתן הוכחו לווסת התנהגות גביש20. Daudon et al.19, הציע כי ניתוח crystalluria יכול להיות מועיל בניהול של חולים עם מחלת אבן כליות בהערכת תגובתם לטיפולים. כמה שיטות קונבנציונליות הזמינות כיום כדי להעריך את נוכחותם של גבישים כוללים מיקרוסקופיה מקוטבת21,22, מיקרוסקופ אלקטרונים23, דלפקי חלקיקים3, סינון שתן24, אידוי3,5 אוצנטריפוגה 21. מחקרים אלה סיפקו תובנה חשובה לשדה אבן הכליה לגבי קריסטלוריה. עם זאת, מגבלה של שיטות אלה כבר חוסר היכולת לדמיין ולכמת גבישים פחות מ 1 מיקרומטר בגודל. גבישים בגודל זה עשויים להשפיע על הצמיחה של אבני CaOx על ידי הצמדה ללוח של רנדל.

Nanocrystals הוכחו לגרום לפציעה נרחבת לתאי הכליה לעומת microcrystals גדול25. נוכחות של nanocrystals דווח בשתן באמצעות מנתח חלקיקים26,27. מחקרים אחרונים השתמשו בבדיקות ביספוספט בעלות תווית פלואורסצנטית (alendronate-fluorescein/alendronate-Cy5) כדי לבחון ננו-קריסטלים באמצעות ציטומטריית זרימה ננומטרית28. המגבלה של צבע זה היא שזה לא ספציפי ייקשר כמעט לכל סוגי האבנים למעט ציסטאין. לכן, הערכה מדויקת של נוכחותם של nanocrystals אצל אנשים עשוי להיות כלי יעיל כדי לאבחן crystalluria ו / או לחזות סיכון אבן. מטרת מחקר זה הייתה לזהות ולכמת סידן המכיל ננו-קריסטלים (גודל של <1 מיקרומטר) באמצעות ניתוח מעקב חלקיקים (NTA). כדי להשיג זאת, נעשה שימוש בטכנולוגיית NTA בשילוב עם פלואורופור מחייב סידן, Fluo-4 AM כדי לזהות ולכמת סידן המכיל nanocrystals בשתן של מבוגרים בריאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים המתוארים בעבודה זו אושרו על ידי אוניברסיטת אלבמה ב ברמינגהאם (UAB) הוועדה לבדיקה מוסדית. מבוגרים בריאים (33.6 ± 3.3 שנים; n = 10) נרשמו למחקר אם היה להם פאנל מטבולי מקיף דם נורמלי, משתמשים שאינם טבק, לא בהריון, BMI בין 20-30 ק"ג / מ'2, וללא מצבים רפואיים כרוניים או מחלות חריפות. משתתפים בריאים חתמו על טופס הסכמה מדעת בכתב לפני תחילת המחקר.

1. פרוטוקול קליני ואיסוף שתן

  1. יש למשתתפים לצרוך דיאטה אוקסלט נמוך שהוכן על ידי מרכז UAB עבור קלינית ותרגום מדעים Bionutrition Core במשך 3 ימים וצום לילה לפני איסוף השתן שלהם (מדגם 24 שעות ביממה).
  2. למחרת, יש למשתתפים להחזיר דגימת שתן 24 שעות ביממה שלהם (טרום אוקסלט) לפני צריכת עומס אוקסלט (שייק המכיל פירות וירקות, ~ 8 מ"מ אוקסלט). יש המשתתפים לאחר מכן לאסוף את השתן שלהם במשך 24 שעות (דגימת פוסט אוקסלט) ולהחזיר את השתן שלהם למחרת.
  3. שמרו על כל דגימות השתן בטמפרטורת החדר (RT) לפני העיבוד כמתואר להלן ומוצג באיור 1.

2. עיבוד שתן

הערה: כל החומרים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.
התראה: יש ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת תוך טיפול בדגימות קליניות ובריאגנטים. באופן ספציפי, כפפות, מגיני פנים ועין, הגנה נשימתית ובגדי מגן.

  1. למדוד ולתעד pH שתן ונפח. מערבבים ביסודיות לפני הוספת 50 מ"ל שתן לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל חרוט.
  2. דגימת צנטריפוגה ב 1200 x g במשך 10 דקות ב RT באמצעות צנטריפוגה ספסל.
    הערה: שמור את המדגם ב- RT כדי למנוע היווצרות גביש נוסף כמו טמפרטורות קרירות יותר יכול לקדם התגבשות.
  3. להשליך את supernatant ולשטוף מחדש את גלולה שוב עם 5 מ"ל של 100% אתנול. צנטריפוגה המדגם ב 1200 x g במשך 10 דקות ב RT באמצעות צנטריפוגה ספסל.
  4. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של 100% אתנול. אחסן את המדגם ב -20 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר או הכתים את הדגימה כמתואר להלן.
    הערה: אין הבדל משמעותי בנקודות נתונים (כלומר, גודל/ריכוז חלקיקים) בין דגימות מאוחסנות או מוכתמות טריות.

3. ניתוח מעקב חלקיקים (NTA)

  1. הכנה לדוגמה
    1. חלקיקי זהב: השתמש חלקיקי זהב כדי לייעל את ההגדרות על המכשיר. לדלל 100 ננומטר זהב בגודל ננומטרי 1:1000 במים אולטרה-דקים.
    2. שתן אנושי: לדלל דגימות שתן 20 פעמים במים לפני הכתמת עם 5 מ"מ Fluo-4 AM (צבע פלואורסצנטי סידן) במשך 30 דקות בחושך. נתח את הדגימות באמצעות NTA.
    3. הכן סידן אוקסלט (CaOx) גבישים כפי שתואר קודם לכן29. לדלל 10 מ"מ מלאי פתרון (14.6 מ"ג ב 10 מ"ל של מים) כדי 50 מיקרומטר במים ולהכתים את הדגימות מדוללת באמצעות 5 mM Fluo-4 AM במשך 30 דקות בחושך לפני הניתוח.
    4. סידן פוספט (CaP) גבישים: לדלל 10 מ"מ מלאי פתרון (50.4 מ"ג ב 10 מ"ל של מים) כדי 50 מיקרומטר במים ולהכתים את הדגימות מדוללת באמצעות 5 mM Fluo-4 AM במשך 30 דקות בחושך לפני ניתוח NTA.
  2. הגדרת מכשירים, הגדרות מצלמה ואיסוף נתונים
    הערה: הגדרת המחשב והמכשיר המשמשת לשיטה זו מוצגת באיור 2.
    1. הפעל את המחשב ולאחר מכן את המכשיר. פתח את התוכנה והפעל את המצלמה.
    2. לאחר פתיחת חלון התוכנה, לחץ על סמל הלכידה בפינה הימנית העליונה בחלון כדי להפעיל את מצב הלכידה. אתחול המצלמה אורך מספר שניות.
    3. נקה את הפלטפורמה על ידי שאיבת אוויר לתוכה תחילה באמצעות מזרק 1 מ"ל עד שהפלטפורמה נראית נקייה. בעדינות להוסיף מים למנגנון 2-3 פעמים באמצעות מזרק 1 מ"ל נוסף כדי להסיר את כל בועות האוויר.
      הערה: חפשו בועות אוויר בפלטפורמה כמו גם בצינורות. חשוב לא להיות בועות ברחבי המנגנון לפני ובזמן הפעלת דגימות. אם בועות נמצאות, לנקות את הרציף שוב עם אוויר ומים.
    4. לאחר שהפלטפורמה נקייה, הוסיפו מים כדי לבדוק אם יש זיהום על פני השטח על ידי צפייה במצלמה. לאחר מכן, להוסיף חלקיקי זהב כפקד למזרק משאבת טעינה מדגם כדי להגדיר את המכשיר.
    5. כוונן את רמת המצלמה על המסך או על הידית לצד ימין של המכשיר עד שהתמונה תתחיל להציג פיקסלים צבעוניים ולאחר מכן הקטן את רמת המצלמה.
    6. לאחר מכן כוונן את המסך כדי למטב את התמונה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תמונת הווידאו. החזק את לחצן העכבר השמאלי לחוץ וגרור את התמונה למעלה ולמטה כדי לקבל את התצוגה כולה.
      הערה: עדשת המצלמה הרגילה והמסנן משמשים להערכת חלקיקי זהב ודגימות לא מוכתמות.
    7. הגדר את מהירות העירוי ומקד את המצלמה כך שננו-חלקיקי הזהב יהיו גלויים על מסך המצלמה. הגדר את מהירות העירוי לגבוהה (כלומר, 500 μL/min) עבור הגדרה ראשונית כדי להבטיח את חלקיקי הזהב מזוהים. לאחר שזוהה, להפחית את המהירות ל 50 μL / min.
    8. כוונן את רמת המצלמה כדי לדמיין את החלקיקים. לדגימות לא מוכתמות, כוונן את הגבר המסך ברמה 5 כדי להשיג את מוקד המצלמה והגדר את רמת המצלמה ל- 8. לאחר הגדרת המוקד, רשום את המדגם (כלומר, מדידה אחת למשך 60 שניות בלבד).
      הערה: המיקוד ומהירות הזרימה הרציפה חשובים להשגת תמונות ברורות וחדות של החלקיקים לספירה.
    9. לאחר אופטימיזציה, לנקות את המנגנון שוב עם מים לפני הערכת דגימות. הצג את המצלמה כדי להבטיח כי הצינור נקי וחלקיקים אינם נוכחים.
      הערה: שטפו את התא בין כל דגימה עד שהמצלמה לא תזהה חלקיקים.
    10. לניתוח דגימות מוכתמות, התאימו את המצלמה למיקום המסנן המכיל את מסנן הפלואורסצנט המתאים. לטעון דגימות מדולל ומוכתם על מזרק משאבת הטעינה מדגם ולהפחית את המהירות ל 20 μL / min לניתוח של המדגם.
    11. לאחר מכן התאם את הגבר למסך ואת רמת המצלמה מכיוון שאלה פרמטרים חשובים. לדגימות מוכתמות (פלואורסצנטיות), הגדר את הגבר המסך ל- 5 ואת רמת המצלמה ברמה 13.
      הערה: פרמטרים אלה ישתנו בהתאם לסוג הדגימה ויהיה צורך למטב כל מדגם כדי לקבל מיקוד.
    12. השתמש במדידה רגילה כדי למדוד את הדגימות עבור 5 לכידות לכל מדגם כאשר משך לכידה אחד הוא למשך 60 שניות.
    13. שמור ואחסן נתונים לאחר כל מדידה. התוכנה תשמור קבצי תמונה ווידאו עבור כל מדידה. התוכנה מספקת נתוני פלט (למשל, גודל גביש: 10 nM - 1000 nM וריכוז) בפורמטים של אקסל ו- PDF.
    14. חשב את המספר הממוצע של חלקיקים עבור כל 5 הקריאות עבור כל מדגם בנפרד. נתח את הנתונים באמצעות סטיית תקן או שגיאת תקן של הממוצע והשתמש בבדיקות t לניתוח משויך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הממצאים ממחקר זה מראים NTA יכול לזהות ביעילות את הגודל הממוצע ואת הריכוז של סידן המכיל nanocrystals בדרכי השתן בשתן האנושי. זה הושג באמצעות פלואורופור, Fluo-4 AM, וניתוח מעקב חלקיקים. Fluo-4 AM היה מסוגל להיקשר הן גבישי CaOx ו CaP. כפי שמוצג באיור 3A, גבישי CaOx נקבעו להיות בין 50-270 ננומטר בגודל ויש להם ריכוז ממוצע של 1.26 x 109 חלקיקים / מ"ל. גבישי CAP היו בגודל של בין 30-225 ננומטר והיה להם ריכוז ממוצע של 2.22 x 109 חלקיקים / מ"ל (איור 3B). כדי לקבוע אם NTA יכול להעריך nanocrystals בשתן אנושי, מבוגרים בריאים התבקשו לצרוך דיאטה אוקסלט מבוקר ואחריו עומס אוקסלט גבוה. דגימות שתן של 24 שעות לפני ואחרי העומס נאספו כדי להעריך את הגודל והריכוז של ננו-קריסטל השתן. דגימות שתן לפני אוקסלט הכילו כמה ננו-קריסטלים בדרכי השתן (1.65 x 108 ± 3.29 x 107 חלקיקים/מ"ל) בין 110-300 ננומטר(איור 4). לעומת זאת, חלה עלייה משמעותית (p<0.0001) בננו-קריסטלים בדרכי השתן הנמצאים בדגימות פוסט-אוקסלט (7.05 x 108 ± 1.08 x 108 חלקיקים/מ"ל; 100-320 ננומטר)(איור 4). כדי לאשר את השחזור של השיטה, הדגימות נמדדו שלוש פעמים ולא הייתה שונות משמעותית בשכפולים טכניים (איור 5).

Figure 1
איור 1: פרוטוקול בידוד והכתמת ננו-קריסטלים של שתן אנושי.

Figure 2
איור 2: תיאור ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA) (A) מחשב ומכשירים שהוקמו המשמשים למחקרים אלה. (B)דגימות מוזרקות לתוך צינורות כניסה באמצעות משאבת מזרק בקצב רציף לפני מילוי המשטח האופטי. דגימות נצפות לאחר מכן על ידי העדשה האובייקטיבית ונלכדות על ידי המצלמה כאשר דגימות זורמות דרך הפלטפורמה לפני היציאה דרך צינורות היציאה שיש להשליך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: NTA מזהה גבישי פלואו-4 AM המסומנים בסידן אוקסלט (CaOx) וסידן פוספט (CaP). גרפים מייצגים של (A) CaOx ו - (B) גבישי CAP המציגים התפלגות גודל וריכוז. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: NTA מזהה Fluo-4 AM שכותרתו 24 שעות ביממה ננו-קריסטלים אנושיים בדרכי השתן. גרף מייצג של Fluo-4 AM שכותרתו nanocrystals בדרכי השתן בדגימות טרום אוקסלט 24 שעות ביממה פוסט אוקסלט ממבוגר בריא על דיאטה אוקסלט מבוקרת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שכפולים טכניים של ננו-קריסטלים אנושיים באוספי שתן 24 שעות ביממה באמצעות NTA. שכפולים טכניים של Fluo-4 AM שכותרתו nanocrystals בדרכי השתן ב 24 שעותביממה( A ) טרום אוקסלט ו -( B) דגימות פוסט אוקסלט ממבוגר בריא על דיאטה אוקסלט מבוקרת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NTA שימש במחקר הנוכחי כדי להעריך nanocrystals בשתן אנושי באמצעות בדיקה מחייב סידן, Fluo-4 AM. אין שיטה סטנדרטית זמינה כדי לזהות nanocrystals בשתן. כמה קבוצות מחקר זיהו nanocrystals בשתן והסתמכו על שימוש בפרוטוקולים נרחבים או שיטות מוגבלות ביכולתם לכמת את הדגימות27,28. מחקר זה מראה שיטה ספציפית ורגישה לגילוי סידן המכיל ננו-קריסטלים בשתן של בני אדם שהשתתפו במחקר הזנה תזונתי שכלל בליעת עומס אוקסלט גבוה. כמות אוקסלט הנצרכת הייתה שקולה לצריכה בעולם האמיתי של אוקסלט (למשל, 1/2 סלט תרד).

NTA הוא כלי ברזולוציה גבוהה מאופיין היטב המשתמש בתנועה בראונית כדי למדוד חלקיקים בתמיסה30. זה שימש להערכת חלקיקים ביולוגיים במגוון של דגימות ביולוגיות31,32,33. בנוסף, NTA יכול לחזות במדויק את הגודל, כמו גם ריכוז של חלקיקים בכל סוג של מדגם ביולוגי. שיטה זו אינה דורשת תיוג; עם זאת, תיוג עשוי לשמש לגילוי חלקיקים ספציפיים. Fluo-4 AM שימש במחקר זה כדי לזהות ביעילות ובאופן ספציפי סידן המכיל nanocrystals בדגימות שתן. בדיקות פלואורסצנטיות סידן שימשו בתחילה למדידת סידן ציטוסולי חופשי34. Fluo-4 הוא אנלוגי של Fluo-3 אשר פלואורסצנטיות מגבירה >100-פי על מחייב סידןחינם 35. בנוסף, Fluo-4 הוכח להעריך חלקיקי סידן בנוזל הסינוביאלי של חולים עם דלקת פרקים באמצעות cytometry זרימה36. לכן, השתמשנו Fluo-4 AM למחקרים אלה.

כל הדגימות הוזרקו ללא הרף לפלטפורמה לגילוי מדויק. קביעת הריכוז וגודל החלקיקים תלויה בקצב הזרימה, שכן קצב זרימה גבוה (כלומר, 50 μL / min) יכול להשפיע על הערכה מדויקת של הריכוז, כמו גם על גודל החלקיקים בהשוואה להגדרה סטטית וקצב זרימה נמוך יותר (כלומר 20 μL / min)37. לפיכך, קצב זרימה איטי ויציב מספק מדידה מדויקת של מספר החלקיקים הקיימים בדגימות. פרמטרים חשובים אחרים שעשויים להשפיע על ספירת החלקיקים וגודלה כוללים את רמת המצלמה, סף הזיהוי והמיקוד38,39,40. מדידת חלקיקים עקבית בדגימות (CV כ- 20%) נצפתה במחקר הנוכחי, אשר עולה בקנה אחד עם ממצאים ממחקר אחר39. לבסוף, נוכחותם של nanocrystals בשתן אנושי אושרה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים29. מחקר זה מדגים NTA יכול למדוד בהצלחה nanocrystals בדרכי השתן מבני אדם.

אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא השימוש Fluo-4 AM כדי להעריך סידן המכיל חלקיקים בתמיסה. יתרון נוסף הוא השונות המינימלית שנצפתה באיתור nanocrystals בתוך דגימות. מגבלה אחת של NTA בהגדרה זו, היא חוסר היכולת להבחין במורפולוגיה של nanocrystals. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מועילה כדי לזהות crystalluria לחיזוי הסיכון לאבן אצל אנשים עם היסטוריה של סידן המכיל אבנים בכליות. פרוטוקול זה אינו יכול להחליף את המתודולוגיות הנוכחיות, אך עשוי לספק תובנה חדשה על ננו-קריסטלים בדרכי השתן. השימוש NTA כדי להעריך סידן בדרכי השתן המכיל גבישים היא גישה חדשנית כי צריך להדגיש את החשיבות של nanocrystalluria מעבר מיקרוסקופיה סטנדרטית ושיטות שהוזכרו לעיל. חקירות נוספות מוצדקות כדי לחקור את האמינות של שיטה זו באוכלוסיית אבן הכליה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

המחברים מודים לכל משתתפי המחקר ולגרעין הביונוטריון UAB CCTS ולמרכז שירות ההדמיה ברזולוציה גבוהה של UAB על תרומתם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DK106284 ו DK123542 (TM), ו UL1TR003096 (המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Centrifuge Jouan Centrifuge CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate Synthesized in the lab as previously described29. Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) Sigma 677418 Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol Fischer Scientific AC615095000 Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM* AAT Bioquest, Inc. 20550 Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles Sigma 742031 Store at 2-8°C
NanoSight Instrument Malvern Instruments, UK NS300
Syringe pump Harvard Apparatus 98-4730
Virkon Disinfectant LanXESS Energizing Company, Germany LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
  2. Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
  3. Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
  4. Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
  5. Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone "activity". British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
  6. Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
  7. Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
  8. Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
  9. Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
  10. Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
  11. Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
  12. Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
  13. Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
  14. Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
  15. Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
  16. Khan, S. R., Kok, D. J. Modulators of urinary stone formation. Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).
  17. Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
  18. Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
  19. Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, London, England. Pt D 624-632 (2016).
  20. Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
  21. Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
  22. Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , Shaker Publishing. Maastricht. 261-263 (2001).
  23. Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. Crystalluria. Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).
  24. Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
  25. Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
  26. He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
  27. Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
  28. Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
  29. Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
  30. Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
  31. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  32. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
  33. Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
  34. Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
  35. Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
  36. Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
  37. Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
  38. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  39. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
  40. Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).

Tags

רפואה בעיה 168 אוקסלט אבנים בכליות ננו-קריסטלוריה ניתוח מעקב חלקיקים סידן
הערכת Nanocrystals בדרכי השתן בבני אדם באמצעות סידן פלואורופור תיוג וניתוח מעקב חלקיקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T.… More

Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T. Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis. J. Vis. Exp. (168), e62192, doi:10.3791/62192 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter