Summary
Bu çalışmanın amacı, nanopartikül izleme analizinin (NTA) sağlıklı yetişkinlerden gelen nanokristal içeren üriner kalsiyumu tespit edip ölçemediğini belirlemekti. Mevcut çalışmadan elde edilen bulgular, NTA'nın böbrek taşı hastalığı sırasında idrar nanokristallerini tahmin etmek için potansiyel bir araç olabileceğini göstermektedir.
Abstract
Böbrek taşları yetişkinlerde ve çocuklarda dünya çapında daha yaygın hale gelmektedir. En yaygın böbrek taşı türü kalsiyum oksalat (CaOx) kristallerinden oluşur. Kristalüri, idrarın minerallerle (örneğin kalsiyum, oksalat, fosfat) doymamış olması ve böbrek taşı oluşumundan önce gelmesiyle ortaya çıkar. Taş eskilerde kristalürisi değerlendirmek için standart yöntemler mikroskopi, filtrasyon ve santrifüjlemedir. Bununla birlikte, bu yöntemler öncelikle nanokristalleri değil mikrokristalleri tespit eder. Nanokristallerin böbrek epitel hücrelerine mikrokristal in vitrodan daha zararlı olduğu ileri sürülmüştür. Burada Nanopartikül Takip analizinin (NTA) insan üriner nanokristallerini tespit etme yeteneğini açıklıyoruz. Sağlıklı yetişkinler, idrar nanokristallerini uyarmak için oksalat yükü içmeden önce kontrollü bir oksalat diyeti ile beslendi. İdrar, oksalat yükünden önce ve sonra 24 saat boyunca toplandı. Numuneler işlendi ve numuneleri arındırmak için etanol ile yıkandı. Üriner nanokristaller kalsiyum bağlayıcı florofor, Fluo-4 ile boyandı. Lekelemeden sonra NTA kullanılarak nanokristallerin büyüklüğü ve sayısı belirlendi. Bu çalışmadan elde edilen bulgular, NTA'nın sağlıklı yetişkinlerde nanokristalüriyi verimli bir şekilde tespit dürebildiğini göstermektedir. Bu bulgular, böbrek taşı hastalığı olan hastalarda NTA'nın nanokristalürinin değerli bir erken teşhis yöntemi olabileceğini göstermektedir.
Introduction
İdrar minerallerle doymamış hale geldiğinde idrar kristalleri oluşur. Bu sağlıklı bireylerde ortaya çıkabilir, ancak böbrek taşı olan bireylerde daha yaygındır1. İdrar kristallerinin varlığı ve birikimi, kişinin böbrek taşı geliştirme riskini artırabilir. Özellikle, kristaller Randall'ın plağında bağlandığında, çekirdeklendiğinde, biriktiğinde ve zamanla büyüdüğünde ortaya çıkar2,3,4. Kristalüri böbrek taşı oluşumundan önce gelir ve kristalürinin değerlendirilmesi böbrek taşı eskilerinde tahmin değerine sahip olabilir3,5. Özellikle, kristalürinin taş içeren kalsiyum oksalat öyküsü olan hastalarda taş tekrarlama riskini tahmin etmek için yararlı olduğu öne sürülmemiştir6,7.
Kristallerin renal epitel ve dolaşımdaki immün hücre fonksiyonu8, 9,10,11,12,13'üolumsuz etkilediği bildirilmiştir. Kalsiyum oksalat (CaOx) böbrek taşı eskilerinden dolaşımdaki monositlerin sağlıklı bireylere kıyasla hücresel biyoenergetikleri baskılatıldığı daha önce bildirilmiştir14. Ek olarak, CaOx kristalleri hücresel biyoenergetikleri azaltır ve monositlerde redoks homeostazını bozar8. Oksalat bakımından zengin öğünlerin tüketimi, böbrek tübül hasarına yol açabilecek ve böbrek taşı oluşumuna karşı koruyucu olan üriner makromoleküllerin üretimini ve işlevini değiştirebilecek kristalüre neden olabilir15,16. Çeşitli çalışmalar idrar kristallerinin idrarın pH'ına ve sıcaklığına bağlı olarak şekil ve boyut olarak değişebileceğini göstermiştir17,18,19. Ayrıca, üriner proteinlerin kristal davranışını modüle etmesi gösterilmiştir20. Daudon ve ark.19, kristalüri analizinin böbrek taşı hastalığı olan hastaların yönetiminde ve tedavilere yanıtlarını değerlendirmede yardımcı olabileceğini önerdi. Kristallerin varlığını değerlendirmek için şu anda mevcut olan birkaç geleneksel yöntem polarize mikroskopi21,22,elektron mikroskopisi23, parçacık sayaçları3, idrar filtrasyonu 24 , buharlaşma3,5 veya santrifüjleme21'dir. Bu çalışmalar kristalürür ile ilgili böbrek taşı alanına değerli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin bir sınırlaması, 1 μm'den küçük kristallerin görselleştirilememiş ve ölçülememesi olmuştur. Bu büyüklükteki kristaller Randall'ın plaketine bağlanarak CaOx taşlarının büyümesini etkileyebilir.
Nanokristallerin daha büyük mikrokristallere kıyasla renal hücrelerde geniş çaplı yaralanmaya neden olduğu gösterilmiştir25. Nanokristallerin varlığı bir nanopartikül analizörü kullanılarak idrarda bildirilmiştir26,27. Son çalışmalar nano ölçekli akış sitometrisi kullanarak nanokristalleri incelemek için floresan etiketli bifosfat probları (alendronat-floresan/ alendronat-Cy5)kullanmıştır. Bu boyanın sınırlaması, spesifik olmaması ve sistein hariç hemen hemen her tür taşa bağlanacak olmasıdır. Bu nedenle, bireylerde nanokristallerin varlığını doğru bir şekilde değerlendirmek, kristalürür teşhisi koymak ve / veya taş riskini tahmin etmek için etkili bir araç olabilir. Bu çalışmanın amacı nanokristal izleme analizi (NTA) kullanarak nanokristal içeren kalsiyumun (<1 μm boyutunda) tespit ve ölçülmesiydi. Bunu başarmak için, NTA teknolojisi, sağlıklı yetişkinlerin idrarında nanokristal içeren kalsiyumu tespit etmek ve ölçmek için fluo-4 AM kalsiyum bağlayıcı bir florofor ile birlikte kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada özetlenen tüm deneyler Birmingham'daki Alabama Üniversitesi (UAB) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Sağlıklı yetişkinler (33,6 ± 3,3 yaşında; n=10) normal kan kapsamlı metabolik paneli, tütün dışı kullanıcıları, hamile olmayanları, 20-30 kg/m2arasında bir VKİ'leri varsa ve kronik tıbbi rahatsızlıkları veya akut hastalıkları yoksa çalışmaya alındı. Sağlıklı katılımcılar, çalışmaya başlamadan önce yazılı bir bilgilendirilmiş onay formu imzaladılar.
1. Klinik protokol ve idrar toplama
- Katılımcılar, idrarlarını toplamadan önce UAB Klinik ve Çeviri Bilimleri Biyo besin çekirdeği tarafından hazırlanan düşük oksalat diyetini 3 gün boyunca ve bir gecede hızlı bir şekilde tüketirler (24 saatlik örnek).
- Ertesi gün, katılımcılar bir oksalat yükü (meyve ve sebze içeren smoothie, ~8 mM oksalat) tüketmeden önce 24 saatlik idrar örneklerini (ön oksalat) iade edin. Katılımcıların daha sonra idrarlarını 24 saat boyunca (post-oksalat örneği) toplamalarını ve ertesi gün idrarlarını iade etmelerini sağlayın.
- Aşağıda açıklandığı ve Şekil 1'degösterildiği gibi işlemeden önce tüm idrar örneklerini oda sıcaklığında (RT) koruyun.
2. İdrar İşleme
NOT: Kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlar Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
DİkKAT: Klinik numuneleri ve reaktifleri kullanırken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyin. Özellikle eldivenler, yüz ve göz kalkanları, solunum koruması ve koruyucu giysiler.
- İdrar pH'ını ve hacmini ölçün ve kaydedin. Etiketli steril 50 mL konik tüpe 50 mL idrar eklemeden önce iyice karıştırın.
- Bir tezgah üstü santrifüj kullanarak RT'de 10 dakika boyunca 1200 x g'da santrifüj örneği.
NOT: Daha soğuk sıcaklıklar kristalleşmeyi teşvik edebileceğinden, daha fazla kristal oluşumunu önlemek için numuneyi RT'de tutun. - Süpernatant atın ve yıkayın ve peletin% 100 etanol 5 mL ile tekrar yeniden ıslatır. Örneği 1200 x g'da, tezgah üstü santrifüj kullanarak RT'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatant atın ve peletin 1 mL%100 etanol içinde yeniden dürt. Numuneyi daha sonra işlemek veya aşağıda açıklandığı gibi lekelenmek üzere -20 °C'de saklayın.
NOT: Saklanan veya yeni boyanmış numuneler arasında veri noktalarında (yani parçacık boyutu/konsantrasyonu) önemli bir fark yoktur.
3. Nanopartikül Takip Analizi (NTA)
- Numune Hazırlama
- Altın nanopartiküller: Cihazdaki ayarları optimize etmek için altın nanopartikülleri kullanın. Ultra saf suda 100 nm büyüklüğünde altın nanopartikülleri 1:1000 seyreltin.
- İnsan İdrarı: İdrar örneklerini lekelenmeden önce suda 20 kez 5 mM Fluo-4 AM (kalsiyum floresan boyası) ile karanlıkta 30 dakika seyreltin. NTA kullanarak örnekleri analiz edin.
- Daha önce açıklandığı gibi Kalsiyum Oksalat (CaOx) kristalleri hazırlayın29. 10 mM stok çözeltisini (10 mL suda 14,6 mg) suda 50 μM'ye seyreltin ve seyreltilmiş numuneleri analizden önce 30 dakika karanlıkta 5 mM Fluo-4 kullanarak lekelayın.
- Kalsiyum Fosfat (CaP) kristalleri: 10 mM stok çözeltisini (10 mL suda 50,4 mg) suda 50 μM'ye seyreltin ve NTA analizinden önce 30 dakika boyunca 5 mM Fluo-4 kullanarak seyreltilmiş numuneleri lekelayın.
- Enstrüman Kurulumu, Kamera Ayarları ve Veri Toplama
NOT: Bu yöntem için kullanılan bilgisayar ve cihaz kurulumu Şekil 2'de gösterilmiştir.- Önce bilgisayarı sonra da aleti aç. Yazılımı açın ve kamerayı açın.
- Yazılım penceresi açıldıktan sonra, yakalama modunu başlatmak için pencerenin sol üst köşesindeki yakalama simgesini tıklatın. Kameranın başlatılması birkaç saniye sürer.
- Platform temiz görünene kadar önce 1 mL şırınç kullanarak içine hava pompalayarak platformu temizleyin. Hava kabarcıklarını gidermek için başka bir 1 mL şırınna kullanarak cihaza 2-3 kez yavaşça su ekleyin.
NOT: Platformda ve boruda hava kabarcıkları arayın. Numuneleri çalıştırmadan önce ve çalıştırırken cihaz boyunca kabarcıkların olmaması önemlidir. Kabarcıklar varsa, platformu tekrar hava ve suyla temizleyin. - Platform temizlendikten sonra, kamerayı görüntüleyerek yüzeydeki kirlenme olup olmadığını kontrol etmek için su ekleyin. Ardından, aleti kurmak için numune yükleme pompası enjektörüne kontrol olarak altın nanopartiküller ekleyin.
- Görüntü renkli pikselleri görüntülemeye başlayana kadar ekrandaki veya düğmedeki kamera düzeyini cihazın sağ tarafına ayarlayın ve ardından kamera düzeyini azaltın.
- Ardından görüntüyü optimize etmek için ekranı ayarlayın. Video görüntüsündeki fare düğmesini sol tıklatın. Sol fare düğmesini basılı tutun ve tüm görünümü elde etmek için görüntüyü yukarı ve aşağı sürükleyin.
NOT: Normal kamera lensi ve filtresi altın nanopartikülleri ve lekesiz örnekleri değerlendirmek için kullanılır. - İnfüzyon hızını ayarlayın ve altın nanopartiküllerin kamera ekranında görünmesi için kamerayı odakla. Altın nanopartiküllerin algılanmasını sağlamak için ilk kurulum için infüzyon hızını yüksek (yani 500 μL/dk) olarak ayarlayın. Tespit edildikten sonra hızı 50 μL/dak'a düşürün.
- Parçacıkları görselleştirmek için kamera seviyesini ayarlayın. Ulaşılmamış numuneler için kamera netlemesini elde etmek için ekran kazancını 5. Odak ayarlandıktan sonra, örneği kaydedin (yani, yalnızca 60 saniye boyunca 1 ölçüm).
NOT: Odak ve sürekli akış hızı, sayım için parçacıkların net ve keskin görüntülerini elde etmek için önemlidir. - Optimizasyondan sonra, numuneleri değerlendirmeden önce cihazı tekrar suyla temizleyin. Borunun temiz olduğundan ve parçacıkların bulunmadığından emin olmak için kamerayı görüntüleyin.
NOT: Kamera tarafından parçacık algılanınceye kadar her numune arasındaki hazneyi yıkayın. - Lekeli örnekleri analiz etmek için kamerayı uygun floresan filtreyi içeren filtre konumuna ayarlayın. Seyreltilmiş ve lekeli numuneleri numune yükleme pompası enjektörüne yükleyin ve numunenin analizi için hızı 20 μL/dk'ya düşürün.
- Daha sonra ekran kazancını ve kamera seviyesini ayarlayın, çünkü bunlar önemli parametrelerdir. Lekeli (floresan) numuneler için ekran kazancını 5'e ve kamera seviyesini 13.
NOT: Bu parametreler örnek türüne göre değişir ve odak kazanmak için her numunenin optimize edilmesi gerekir. - Bir yakalama süresinin 60 saniye olduğu numune başına 5 yakalama için numuneleri ölçmek için standart ölçümü kullanın.
- Her ölçümden sonra verileri kaydedin ve depolayın. Yazılım, her ölçüm için görüntü ve video dosyalarını kaydeder. Yazılım, hem excel hem de pdf formatlarında çıktı verileri (örneğin, kristal boyutu: 10 nM - 1000 nM ve konsantrasyon) sağlar.
- Her bir örnek için 5 okumanın tümü için ortalama nanopartikül sayısını hesaplayın. Ortalamanın standart sapması veya standart hatasını kullanarak verileri analiz edin ve eşleştirilmiş analiz için t testlerini kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmadan elde edilen bulgular, NTA'nın insan idrarında idrar nanokristalleri içeren kalsiyumun ortalama boyutunu ve konsantrasyonu olduğunu verimli bir şekilde tespit edebildiği göstermektedir. Bu, florofor, Fluo-4 ve nanopartikül izleme analizi kullanılarak elde edildi. Fluo-4 hem CaOx hem de CaP kristallerine bağlanabildi. Şekil 3A'dagösterildiği gibi, CaOx kristallerinin 50-270 nm arasında olduğu ve ortalama 1.26 x 109 parçacık/ mL konsantrasyona sahip olduğu belirlenmiştir. CaP kristalleri 30-225 nm arasındaydı ve ortalama 2.22 x 109 parçacık / mL konsantrasyonuna sahipti (Şekil 3B). NTA'nın insan idrarındaki nanokristalleri değerlendirip değerlendiremeyeceğini belirlemek için, sağlıklı yetişkinlerden kontrollü bir oksalat diyeti ve ardından yüksek oksalat yükü tüketmeleri istendi. İdrar nanokristal boyut ve konsantrasyonu değerlendirmek için yük öncesi ve sonrası 24 saatlik idrar örnekleri toplandı. Pre-oksalat idrar örnekleri 110-300 nm(Şekil 4)arasında bazı idrar nanokristalleri (1.65 x 108 ± 3.29 x 107 partikül/mL) içeriyordu. Buna karşılık, post-oksalat örneklerinde (7<05 x 10 8 ± 1.08 x 108 partikül/mL; 100-320nm) bulunan üriner nanokristallerde anlamlı bir artış (s<0.0001) vardı ( Şekil4). Yöntemin tekrarlanabilirliğini doğrulamak için, örnekler üç kez ölçtü ve teknik çoğaltmalarda önemli bir değişiklik olmadı (Şekil 5).
Şekil 1: İnsan üriner nanokristalleri izole etme ve lekeleme protokolü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nanopartikül Takip Analizinin (NTA) tanımı( A) Bu çalışmalar için kullanılan bilgisayar ve enstrüman kurulumu. (B) Numuneler, optik yüzeyi doldurmadan önce sürekli bir şırınna pompası kullanılarak giriş tüpüne enjekte edilir. Numuneler daha sonra objektif lens tarafından gözlemlenir ve numuneler atılmak üzere çıkış tüpünden çıkmadan önce platformdan akarken kamera tarafından yakalanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NTA Fluo-4 etiketli kalsiyum oksalat (CaOx) ve kalsiyum fosfat (CaP) kristallerini tespit eder. Boyut dağılımını ve konsantrasyonu gösteren (A) CaOx ve (B) CaP kristallerinin temsili grafikleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: NTA, Fluo-4 etiketli 24 saatlik insan üriner nanokristallerini tespit eder. Fluo-4 AM'nin temsili grafiği, kontrollü bir oksalat diyetinde sağlıklı bir yetişkinden alınan 24 saatlik ön oksalat ve post-oksalat örneklerinde idrar nanokristali etiketli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: NTA kullanılarak 24 saat idrar koleksiyonlarında insan nanokristallerinin teknik kopyaları. Fluo-4 etiketli üriner nanokristallerin teknik kopyaları, kontrollü bir oksalat diyetinde sağlıklı bir yetişkinden 24 saat(A) pre-oksalat ve (B) post-oksalat örneklerinde. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NTA, bu çalışmada insan idrarındaki nanokristalleri kalsiyum bağlayıcı bir prob olan Fluo-4 AM kullanarak değerlendirmek için kullanılmıştır. İdrardaki nanokristalleri tespit etmek için standart bir yöntem yoktur. Bazı araştırma grupları idrarda nanokristaller tespit etmiş ve örnekleri ölçme yetenekleri sınırlı olan kapsamlı protokollerin veya yöntemlerin kullanılmasına güvenmektedir27,28. Bu çalışma, yüksek oksalat yükünden oluşan bir diyet besleme çalışmasına katılan insanların idrarında nanokristal içeren kalsiyumun tespiti için spesifik ve hassas bir yöntem göstermektedir. Tüketilen oksalat miktarı gerçek dünya oksalat tüketimine eşdeğerdi (örneğin, 1/2 ıspanak salatası).
NTA, çözelti30'dakiparçacıkları ölçmek için Brownian hareketini kullanan iyi karakterize edilmiş bir yüksek çözünürlüklü araçtır. Çeşitli biyolojik numunelerde biyolojik nanopartikülleri değerlendirmek için kullanılmıştır31,32,33. Ek olarak, NTA her türlü biyolojik numunedeki parçacıkların konsantrasyonunun yanı sıra boyutunu da doğru bir şekilde tahmin edebilir. Bu yöntem herhangi bir etiketleme gerektirmez; ancak, etiketleme belirli parçacıkları tespit etmek için kullanılabilir. Fluo-4 AM bu çalışmada idrar örneklerinde nanokristal içeren kalsiyumları verimli ve özel olarak tespit etmek için kullanılmıştır. Kalsiyum floresan problar başlangıçta serbest sitozolizik kalsiyum34ölçmek için kullanılmıştır. Fluo-4, serbest kalsiyum 35'e bağlandığında floresan >100 kat artanFluo-3'ünbir analogudur. Ek olarak, Fluo-4'ün akış sitometrisi36kullanarak artritli hastaların sinovyal sıvısındaki kalsiyum parçacıklarını değerlendirdiği gösterilmiştir. Böylece bu çalışmalar için Fluo-4 AM'yi kullandık.
Tüm numuneler doğru tespit için sürekli olarak platforma enjekte edildi. Konsantrasyonun ve partikül boyutunun belirlenmesi akış hızına bağlıdır, çünkü yüksek bir akış hızı (yani, 50 μL / dk) konsantrasyonun doğru değerlendirilmesini ve statik bir ayara ve daha düşük bir akış hızına (yani 20 μL / dk) kıyasla parçacık boyutunu etkileyebilir37. Böylece, sabit bir yavaş akış hızı, numunelerde bulunan partikül sayısının doğru bir şekilde ölçülenliğini sağlar. Parçacık sayısını ve boyutunu etkileyebilecek diğer önemli parametreler arasında kamera seviyesi, algılama eşiği ve odak38,39,40 bulunur. Numunelerde tutarlı bir parçacık ölçümü (CV yaklaşık %20) başka bir çalışmadan elde edilen bulgularla tutarlı olan mevcut çalışmada gözlenmiştir39. Son olarak, insan idrarında nanokristallerin varlığı elektron mikroskopisi kullanılarak doğrulanmıştır29. Bu araştırma, NTA'nın insanlardan gelen üriner nanokristalleri başarıyla ölçebileceğini göstermektedir.
Bu protokolün bir avantajı, çözeltideki parçacıkları içeren kalsiyumun değerlendirilmesi için Fluo-4 AM'nin kullanılmasıdır. Diğer bir avantaj, numunelerdeki nanokristallerin tespitinde gözlenen minimum değişkenliktir. Bu ayarda NTA'nın bir sınırlaması, nanokristallerin morfolojisini ayırt edememektir. Bununla birlikte, bu yöntem böbrek taşı içeren kalsiyum öyküsü olan bireylerde taş riskini tahmin etmek için kristalüri tespit etmek için yararlı olabilir. Bu protokol mevcut metodolojilerin yerini alamaz, ancak üriner nanokristaller hakkında yeni bilgiler sağlayabilir. Kristal içeren üriner kalsiyumu değerlendirmek için NTA kullanımı, nanokristalürinin standart mikroskopi ve yukarıda belirtilen yöntemlerin ötesinde önemini vurgulaması gereken yeni bir yaklaşımdır. Bu yöntemin böbrek taşı popülasyonunda güvenilirliğini araştırmak için ek araştırmalara izin verilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Yazarlar tüm çalışma katılımcılarına ve UAB CCTS Bionutrition Core ve UAB Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Servis Merkezi'ne katkılarından dolayı teşekkür eder. Bu çalışma NIH tarafından DK106284 ve DK123542 (TM) ve UL1TR003096 (Ulusal Çeviri Bilimleri İlerleyen Merkez) hibeleri ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
References
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
- Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
- Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
- Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone "activity". British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
- Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
- Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
- Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
- Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
- Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
- Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
- Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
- Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
- Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
- Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
- Khan, S. R., Kok, D. J.
- Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
- Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
- Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, London, England. Pt D 624-632 (2016).
- Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
- Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
- Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , Shaker Publishing. Maastricht. 261-263 (2001).
- Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H.
- Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
- Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
- He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
- Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
- Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
- Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
- Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
- Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
- Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
- Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).
