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Test di attivazione dei basofili per la diagnosi di allergia

Published: May 31, 2021 doi: 10.3791/62600
Automatic Translation
*1,2, *2, 2,3, 1,2,4,5
1Allergy Unit, Hospital Regional Universitario de Málaga, 2Allergy Research Group, Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA, 3Universidad de Málaga, Departamento de Biología celular, Genética y Fisiología, Universidad de Málaga, 4Departamento de Medicina, Universidad de Málaga, 5Nanostructures for Diagnosing and Treatment of Allergic Diseases Laboratory, Andalusian Center for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND
* These authors contributed equally

Summary

Il test di attivazione dei basofili è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate basato sulla rilevazione dell'attivazione dei basofili in presenza di uno stimolo specifico attraverso la misura dei marcatori di attivazione mediante citometria a flusso.

Abstract

Il test di attivazione dei basofili (BAT) è un test diagnostico complementare in vitro che può essere utilizzato in aggiunta alla storia clinica, al test cutaneo (ST) e alla determinazione specifica delle IgE (sIgE) nella valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate al cibo, al veleno degli insetti, ai farmaci e ad alcune forme di orticaria cronica. Tuttavia, il ruolo di questa tecnica negli algoritmi diagnostici è altamente variabile e non ben determinato.

La BAT si basa sulla determinazione della risposta dei basofili all'attivazione incrociata delle IgE allergene/farmaco attraverso la misurazione di marcatori di attivazione (come CD63, CD203c) mediante citometria a flusso. Questo test può essere uno strumento utile e complementare per evitare test di provocazione controllati per confermare la diagnosi di allergia, specialmente nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali. In generale, le prestazioni delle BAT devono essere prese in considerazione se i) l'allergene/farmaco produce risultati falsi positivi nella ST; ii) non esiste una fonte di allergeni/farmaci da utilizzare per la determinazione di ST o sIgE; iii) vi è discordanza tra la storia del paziente e la determinazione ST o sIgE; iv) i sintomi suggeriscono che la ST può provocare una risposta sistemica; v) prima di prendere in considerazione un CCT per confermare l'allergene/farmaco colpevole. I principali limiti del test sono legati alla sensibilità non ottimale, soprattutto nell'allergia ai farmaci, alla necessità di eseguire il test non più di 24 ore dopo l'estrazione del campione e alla mancanza di standardizzazione tra i laboratori in termini di procedure, concentrazioni e marcatori cellulari.

Introduction

La diagnosi allergica IgE-mediata si basa sull'anamnesi, sui test cutanei (ST), sulla quantificazione delle IgE sierospecifiche (sIgE) e, se richiesto e indicato, sui challenge test controllati (CCT)1,2,3,4,5,6. Tuttavia, l'anamnesi clinica può essere inaffidabile poiché potrebbe esserci una mancanza di informazioni accurate e ST e CCT non sono procedure prive di rischio che possono essere controindicate nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali 1,2,3,4,5,6 . Questi problemi, insieme al fatto che la determinazione delle sIgE mediante saggi immunoenzimatici fluoroenzimatici validati e commerciali è disponibile solo per pochi allergeni e farmaci, hanno evidenziato l'importante ruolo di altri saggi funzionali in vitro come il test di attivazione dei basofili (BAT).

I basofili sono cellule effettrici chiave coinvolte nelle reazioni allergiche IgE-mediate che si attivano in seguito al cross-linking di sE adiacenti legate su recettori ad alta affinità (FcεRI) sulla superficie cellulare dopo esposizione ad allergeni / farmaci. L'attivazione dei basofili innesca la degranulazione cellulare e il rilascio di mediatori infiammatori preformati e nuovi sintetizzati contenuti nei granuli di secrezione intracitoplasmatica 7,8,9. La BAT è un metodo in vitro che cerca di imitare l'attivazione dei basofili in presenza di uno stimolo (allergene o farmaco) e determina cambiamenti nell'espressione dei marcatori di attivazione dei basofili mediante citometria a flusso 7,10. Esistono diverse strategie per identificare i basofili (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) e per misurare l'attivazione cellulare (principalmente la sovraregolazione di CD63 e CD203c) utilizzando combinazioni di anticorpi marcati con fluorocromo 7,10. CD63, il miglior marcatore di attivazione clinicamente validato 11,12,13,14, è una proteina di membrana ancorata ai granuli secretori contenente istamina che, dopo attivazione cellulare e fusione dei granuli con la membrana, è espressa sulla superficie basofila 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c è un marcatore di superficie che è costitutivamente espresso sui basofili e sovraregolato dopo stimolazione FcεRI, che ha anche mostrato risultati affidabili in BAT 15,22,23,24,25. Inoltre, sembra co-esprimere con CD6326.

Negli ultimi decenni, la BAT ha dimostrato di essere utile nella diagnosi di reazioni allergiche IgE-mediate indotte da diversi fattori scatenanti come farmaci, cibo o inalanti, nonché in alcune forme di orticaria cronica, come descritto di seguito. Tuttavia, la posizione di questa tecnica negli algoritmi diagnostici è altamente variabile e non ben determinata.

Ipersensibilità ai farmaci
La BAT ha dimostrato di essere utile come test complementare per farmaci e pazienti selezionati, in particolare per coloro che manifestano reazioni gravi a causa del fatto che il valore diagnostico della ST non è ben stabilito per la maggior parte dei farmaci, in quanto sono validati e standardizzati per un numero limitato di farmaci27,28,29,30. Inoltre, la quantificazione delle sIgE è disponibile solo per un numero limitato di farmaci, con sensibilità inferiore a ST 27,28,29,30,31,32. Pertanto, la diagnosi di ipersensibilità ai farmaci di solito si basa sul test di provocazione farmacologica, che può essere controindicato nei soggetti che manifestano gravi reazioni pericolose per la vita33.

Sono stati riportati risultati promettenti per l'uso di BAT in pazienti selezionati che hanno riportato reazioni di ipersensibilità immediata a diversi farmaci come betalattamici (BL)20,34,35,36,37,38,39, agenti bloccanti neuromuscolari (NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluorochinoloni (FQs)46,47,48,49, pirazoloni 50,51,52, mezzi di contrasto radiocontrastanti (RCM)53,54,55,56 e composti di platino57,58,59 . È stato riportato che le BAT hanno una sensibilità e una specificità comprese rispettivamente tra il 51,7-66,9% e l'89,2-97,8%; e i valori predittivi positivi e negativi sono descritti tra il 93,4% e il 66,3%, rispettivamente27,31. Inoltre, la BAT è stata proposta come biomarcatore predittivo per le reazioni breakthrough durante la desensibilizzazione con composti di platino, poiché l'espressione di CD203c è aumentata rispetto a CD63 in pazienti con alto rischio di reazioni avverse durante la desensibilizzazione del farmaco57.

È da notare che la BAT è utile solo nell'ipersensibilità ai farmaci quando la reazione comporta la degranulazione dei basofili; pertanto, non è utile nelle reazioni derivanti dall'inibizione enzimatica della cicloossigenasi 142.

Allergia alimentare
La BAT è emersa come un potenziale strumento diagnostico per l'allergia alimentare perché la determinazione delle sIgE sieriche all'intero estratto allergenico o ai singoli allergeni è spesso ambigua, richiedendo la sfida alimentare orale per confermare la diagnosi, che, analogamente all'ipersensibilità ai farmaci, è una procedura costosa e non priva di rischi60. Diversi studi hanno mostrato risultati rilevanti con latte vaccino 61,62, uovo 61,63, frumento 64,65,66,67,68, arachidi 63,69,70,71,72, nocciola 73,74,75,76 ,77, crostacei78, pesca 79,80,81, mela21, sedano e carota82,83.

Il principale valore aggiunto delle BAT nella diagnosi di allergia alimentare rispetto alle ST e alle sIgE nel siero è che mostra una maggiore specificità e una sensibilità simile. Pertanto, la BAT è uno strumento utile per differenziare i pazienti clinicamente allergici da soggetti sensibilizzati, ma tolleranti, che hanno sia un'elevata specificità (75-100%) che sensibilità (77-98%)63,69,84. I valori di sensibilità e specificità dipendono dall'allergene e da altri fattori come fenotipi (ad esempio, sindrome allergica orale contro anafilassi), età e modelli di sensibilizzazione legati alla geografia63,85.

Le BAT che utilizzano singoli componenti allergenici possono potenzialmente migliorare l'accuratezza diagnostica per alcuni allergeni alimentari61,80. Esistono studi che utilizzano proteine di stoccaggio dei semi (ad esempio, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 e Ara h 6 da arachidi)86; proteine di trasferimento lipidico (ad esempio, Pru p 3 dalla pesca e Ara h 9 dall'arachide)80,86; e Bet v 1 omologhi (ad esempio, Ara h 8 da arachidi)87. Altre potenziali utilità sono legate all'identificazione dell'allergene colpevole nei casi di sindrome da allergia ai pollini 21,87,88, allergia alla carne rossa 89 o anafilassi indotta dall'esercizio fisico dipendentedal cibo 66.

È interessante notare che la BAT può fornire informazioni sulla gravità e la soglia delle reazioni allergiche poiché i pazienti con reazioni più gravi mostrano una percentuale maggiore di basofili attivati, come osservato negli studi su pazienti allergici al latte di arachidi e latte vaccino 84,90,91; e i pazienti che reagiscono a tracce dell'allergene mostrano una maggiore sensibilità basofila 84,90,92. Questi dati suggeriscono che le BAT possono essere utili per identificare i pazienti allergici ad alto rischio che richiedono un follow-up più attento e un'istruzione più intensa93. Inoltre, è stato riportato che le BAT possono prevedere le risposte di sfida alimentare 70,91,92,94 e le soglie di reattività90,95 per aiutare a determinare quando il cibo può essere (re)introdotto in modo sicuro 84. Tuttavia, questi risultati sono controversi in alcuni studi63,96 e sono necessarie ulteriori ricerche.

D'altra parte, il BAT è stato utilizzato per monitorare la risoluzione dell'allergia alimentare, sia naturalmente che sotto trattamenti immunomodulatori, nel tempo, che fino ad ora è stata valutata solo per via orale, con i rischi e i costi associati 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107.108. Inoltre, è stato anche usato per monitorare l'effetto di omalizumab nell'allergia alimentare poiché l'attivazione dei basofili diminuisce durante il trattamento con omalizumab, ma aumenta dopo la cessazione del trattamento109.

Allergia inalante
La BAT è raramente benefica nell'allergia inalante poiché la diagnosi può essere stabilita di routine mediante quantificazione delle IgE e ST. Tuttavia, nei casi di rinite allergica locale (livelli non rilevabili di sIgE e ST negative con test di provocazione nasale positivi), la BAT ha permesso la diagnosi nel 50% dei casi110. È stata inoltre riportata una correlazione tra sensibilità ai basofili e risposta ai test di provocazione nasale/bronchiale, nonché tra gravità dell'asma ed efficacia del trattamento con omalizumab111.112.

Il BAT è stato utilizzato anche per monitorare l'immunoterapia con allergeni per acari della polvere domestica e pollini, poiché la sensibilità dei basofili diminuisce durante l'immunoterapia, probabilmente a causa dell'interferenza degli anticorpi IgG bloccanti 113.114.115.116.117.

Allergia al veleno degli imenotteri
La diagnosi di allergia al veleno degli imenotteri si basa di routine sulla ST e sulle sIgE sieriche. La BAT ha mostrato un'elevata sensibilità (85-100%) e specificità (83-100%) ed è stata riportata come utile nei casi che producono risultati equivoci o in pazienti con una storia clinica suggestiva di allergia al veleno ma sIgE non rilevabile e ST118.119 negativa. Tuttavia, la BAT non sembra essere predittiva della gravità di queste reazioni120.121.

Fino al 60% dei pazienti presenta sIgE sia alla vespa che al veleno d'api e l'identificazione dell'allergene dominante è fondamentale per un adeguato trattamento immunoterapico. In questi casi, il BAT è stato segnalato per essere utile nell'identificazione dell'allergene dominante 119,122,123,124. Sebbene le sIgE ai principali allergeni dei veleni di api e vespe possano ridurre l'utilità della BAT nei pazienti con doppia positività ad entrambi i veleni, fornisce informazioni utili principalmente in soggetti con risultati negativi nelle determinazioni delle sIgE123.

Alcuni studi suggeriscono che il BAT può essere utile come biomarcatore predittivo per gli effetti collaterali durante la fase di accumulo dell'immunoterapia del veleno poiché questa opzione di trattamento è stata segnalata per ridurre la sensibilità dei basofili. Tuttavia, la reattività non diminuisce e questa utilità BAT è oggi controversa 13,120,125,126,127,128,129,130.

Orticaria e angioedema
Un sottogruppo di pazienti con orticaria cronica ha una fisiopatologia autoimmune, dovuta agli autoanticorpi IgE contro gli autoallergeni e agli autoanticorpi IgG che colpiscono i complessi FcεRI o IgE-FcεRI presenti sulla superficie dei mastociti131.132. Nella pratica clinica, la diagnosi di questo tipo di orticaria cronica si è basata su ST sierico autologo positivo, che ha il rischio di infezione accidentale. La BAT è stata proposta come test in vitro per la diagnosi e il monitoraggio dei pazienti con sospetta orticaria cronica. È stato riportato che sia l'espressione di CD63 che quella di CD203c sulla superficie dei basofili sono aumentate in seguito alla stimolazione con sieri di pazienti con orticaria cronica, mostrando la rilevazione di autoanticorpi attivi 133.134.135.136.137. Recentemente, è stato riportato che i pazienti con BAT positivo spesso sperimentano lo stato di malattia più attivo, valutato dal punteggio di attività dell'orticaria, e richiedono dosi più elevate di antistaminici insieme a trattamenti di terza linea (ciclosporina A o omalizumab), rispetto a quelli con BAT138 negativo.

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Protocol

L'esecuzione del protocollo è stata condotta secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvata dal Comitato Etico locale (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spagna). Tutti i soggetti sono stati informati oralmente dello studio di ricerca e hanno firmato il corrispondente modulo di consenso informato.

NOTA: Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura BAT che gli autori utilizzano quotidianamente. Tuttavia, questo non è un metodo standardizzato ed esistono differenze con le procedure pubblicate da altri autori. Le principali modifiche del protocollo sono legate all'uso di IL-3 nel tampone di stimolazione, al tempo di incubazione con lo stimolo, al metodo per fermare la degranulazione dei basofili e alle strategie di citometria a flusso. Inoltre, diversi kit disponibili in commercio per BAT includono protocolli specifici raccomandati dal produttore.

1. Preparazione del campione

  1. Raccogliere il sangue periferico in provette eparinizzate da 9 ml e mantenere il campione a temperatura ambiente (RT) in un rotore fino a quando non è necessario per il protocollo sperimentale.
  2. Etichettare i tubi citometrici da 5 ml per controlli negativi (2 provette), controlli positivi (2 provette) e diverse concentrazioni di allergene/farmaco (1 tubo per ogni concentrazione di allergene/farmaco testata). Posizionare i tubi in un rack dove i tubi si adattano perfettamente senza scivolare.
  3. Preparare tampone di stimolazione in acqua bidistillata contenente 2% (v/v) HEPES, 78 mg/L NaCl, 3,7 mg/L KCl, 7,8 mg/L CaCl 2, 3,3 mg/L MgCl2, 1 g/L HSA. Regolare il pH a 7,4 e aggiungere IL-3 a 2 ng/ml. Preparare solitamente 100 ml e dividere in 2,5 ml di aliquote da congelare a -20 °C.
  4. Preparare controlli positivi in PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): controllo positivo 1, N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (4 μM), per confermare la qualità dei basofili; Controllo positivo 2, Anti-IgE (0,05 mg/ml) come controllo positivo IgE-mediato.
  5. Preparare l'allergene/farmaco in PBS-T a 2 volte la concentrazione finale desiderata.
    NOTA: Le concentrazioni ottimali di allergeni/farmaci da utilizzare devono essere preventivamente determinate utilizzando un'ampia gamma di concentrazioni, mediante curve dose-risposta e mediante studi di citotossicità che seguono le stesse fasi del protocollo139.

2. Preparazione della miscela di colorazione

  1. Aggiungere gli anticorpi monoclonali marcati con fluorocromo al tampone di stimolazione dopo la concentrazione di anticorpi raccomandata dal produttore o mediante precedente titolazione degli anticorpi. In questo protocollo aggiungiamo 1 μL di ciascun anticorpo (CCR3-APC e CD203c-PE per l'identificazione dei basofili; CD63-FITC per l'attivazione dei basofili)140 per 20 μL di tampone di stimolazione.
    NOTA: Proteggere la preparazione della miscela di colorazione dalla luce.
  2. Aggiungere 23 μL di miscela colorante a ciascun tubo.

3. Stimolazione del sangue

  1. Aggiungere 100 μL di PBS-T alle provette 1 e 2 (controllo negativo), 100 μL di fMLP alla provetta 3, 100 μL di anti-IgE alla provetta 4 e 100 μL delle diverse concentrazioni di allergeni/farmaci alle seguenti provette. Incubare per 10 minuti a 37 °C in bagno termostatico con agitazione media per preriscaldare i reagenti.
  2. Aggiungere delicatamente 100 μL di sangue a ciascuna provetta per evitare l'emolisi. Vorticare delicatamente i tubi e incubare per 25 minuti a 37 °C in un bagno termostatico con media agitazione.
  3. Arrestare la degranulazione, mantenendo i tubi a 4 °C per almeno 5 min.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui a 4 °C per 30-45 minuti se necessario141.142.143.

4. Lisa eritrociti

  1. Aggiungere 2 ml di tampone lisante 1x a ciascuna provetta per lisare gli eritrociti. Vortice ogni tubo e incubare per 5 minuti a RT.
    NOTA: In questa fase, le cellule sono fisse a causa di agenti fissativi (formaldeide) contenuti nel tampone.
  2. Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 5 min. Decantare il surnatante, rovesciando il rack in un lavandino. Le cellule rimangono sul fondo dei tubi.
  3. Aggiungere 3 ml di PBS-T a ciascun tubo per lavare le cellule. Vortice ogni tubo.
  4. Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 5 min. Decantare il surnatante, rovesciando il rack in un lavandino.
    NOTA: Conservare i campioni a 4 °C, al riparo dalla luce fino all'acquisizione del citometro a flusso.

5. Acquisizione della citometria a flusso

  1. Acquisire campioni tramite citometro a flusso (ad esempio, BD FACSCalibur Flow Cytometer). Collegare il citometro a flusso al software del computer e attendere che il citometro sia pronto. Caricare il modello e le impostazioni dello strumento (Tabella 1).
  2. Avviare l'acquisizione del campione.
  3. Utilizzare le seguenti strategie citometriche per la selezione dei basofili attivati139.
    1. Eliminare i linfociti dal grafico Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).
    2. Eliminare i basofili dalla popolazione linfocitaria come cellule CCR3 + CD203c +. Acquisire almeno 500 basofili per tubo.
    3. Mostra un grafico CCR3 - CD63 per analizzare l'attivazione utilizzando CD63 come indicatore di attivazione. Impostare la soglia negativa CD63 a circa il 2,5% utilizzando i tubi di controllo negativi.
    4. Acquisisci tutti i campioni.

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Representative Results

La BAT eseguita con allergeni o farmaci consente di studiare le reazioni di ipersensibilità IgE-dipendenti. La reattività dei basofili deve essere misurata in almeno due concentrazioni ottimali per ottenere i migliori risultati34 e l'attivazione viene visualizzata dalla sovraregolazione di CD63 sulla superficie cellulare. Nel caso di allergeni, inoltre, per confermare la reattività dei basofili, la sensibilità dei basofili dovrebbe essere analizzata misurando la reattività a concentrazioni multiple decrescenti di allergeni114. Questa misura permette di determinare la concentrazione di allergeni che induce la risposta del 50% di basofili (EC50), che può essere espressa come "CD-sens"141. La misurazione dell'area sotto la curva di dose (AUC) è stata recentemente proposta per valutare sia la reattività basofila che la sensibilità ai basofili insieme58.

La strategia di citometria a flusso per l'analisi dei risultati BAT è mostrata in Figura 1 e Figura 2 e include linfociti gating dal diagramma SSC-FSC (fase 1), basofili di gating dalla popolazione linfocitaria come cellule CCR3 + CD203c + (fase 2), mostrando un grafico CCR3 - CD63 per analizzare l'attivazione utilizzando CD63 come marcatore di attivazione (fase 3). Le figure mostrano esempi rappresentativi dei risultati delle BAT ottenuti per i farmaci (Figura 1) e gli allergeni (Figura 2).

Figure 1
Figura 1: Analisi rappresentativa del test di attivazione dei basofili del farmaco mediante citometria a flusso . (A) Diagramma SSC-FSC per selezionare la popolazione linfocitaria+basofila. (B) CCR3-CD203c complotta per eliminare i basofili dalla popolazione linfocitaria come cellule CCR3+CD203c. (C) Diagramma CCR3-CD63 per analizzare l'attivazione utilizzando CD63 come marcatore di attivazione per il controllo negativo, il controllo positivo e il farmaco. I valori mostrati in ciascun pannello rappresentano la percentuale di celle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi rappresentativa del test di attivazione dei basofili allergenici mediante citometria a flusso . (A) Diagramma SSC-FSC per selezionare la popolazione linfocitaria+basofila. (B) Il complotto CCR3-CD203c per eliminare i basofili dalla popolazione linfocitaria come cellule CCR3+CD203c+ . (C) Diagramma CCR3-CD63 per analizzare l'attivazione utilizzando CD63 come marcatore di attivazione che mostra risultati per il controllo negativo e concentrazioni decrescenti di allergene (Ara h 9). I valori mostrati in ciascun pannello rappresentano la percentuale di celle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Sorgenti luminose (laser) Laser agli ioni di argon condensato ad aria SapphireTM da 488 nm; 20 mW; Laser JDS UniphaseTM HeNe da 633 nm raffreddato ad aria; 17 mW
Lunghezza d'onda eccitatoria della luce Laser blu: 488 nm; Laser rosso: 633 nm
Potenza della sorgente luminosa alla lunghezza d'onda eccitatoria Laser blu: 20 mW; Laser rosso: 17 mW
Filtri ottici CSD: 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20
Rilevatori ottici FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC
Rilevatori ottici tye Laser argon-ion raffreddato ad aria
Percorsi ottici Ottagono BD (linea laser 488 nm); BD Trigons (linea laser 633 nm)

Tabella 1: Requisiti del citometro a flusso

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Discussion

La BAT è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate che si è dimostrato utile nella diagnosi di reazioni indotte da diversi fattori scatenanti come farmaci, alimenti o inalanti, nonché in alcune forme di orticaria cronica. In generale, le prestazioni delle BAT devono essere considerate se i) l'allergene/farmaco produce risultati falsi positivi nella ST; ii) l'allergene/farmaco non è disponibile per essere utilizzato per la quantificazione ST o sIgE; iii) esiste una discordanza tra storia clinica e determinazione ST o sIgE; iv) i sintomi suggeriscono che la ST può indurre una reazione sistemica; v) prima della CCT per la conferma dell'allergene/farmaco colpevole10.

Per quanto riguarda il protocollo sperimentale, ci sono diversi aspetti importanti da considerare per ottenere campioni di sangue idonei per il test. Gli steroidi sistemici 146 e gli immunosoppressori, inclusi i corticosteroidi orali,147 devono essere evitati prima del test a causa della diminuzione della risposta dei basofili 146 (antistaminici e steroidi topici non influenzano i risultati delle BAT)146. Il test non deve essere eseguito durante l'infezione o condizioni infiammatorie croniche attive148. Il tempo di intervallo tra la reazione e il test non deve essere superiore a 1 anno a causa della negativizzazione riportata dei livelli di sIgE nel tempo42,52,149. Il test viene eseguito con sangue intero fresco e deve essere eseguito non più di 24 ore dopo l'estrazione del sangue150.151. Il sangue deve essere raccolto in tubi stabilizzati con eparina perché i basofili non degranulano se EDTA o destrosio acido-citrato sono usati come stabilizzante, anche se potrebbe essere usato dopo aver aggiunto calcio152. D'altra parte, lo stimolo utilizzato nel test non dovrebbe includere eccipienti; Per questo motivo, si raccomandano estratti di allergeni standardizzati, allergeni ricombinanti o purificati, principi attivi puri o preparati di farmaci iniettabili per via endovenosa. Inoltre, devono essere considerate le caratteristiche chimiche dei farmaci. Ad esempio, alcuni farmaci sono instabili in soluzione e devono essere preparati al momento prima di ogni test, mentre altri sono fotolabili e devono essere eseguiti proteggendo il test dalla luce48. La tossicità e l'attivazione non specifica devono essere valutate per ciascun allergene/farmaco testato e le curve ROC con pazienti confermati e devono essere analizzati controlli tolleranti per determinare il cut-off. Infine, l'importanza di entrambi i controlli positivi dovrebbe essere sottolineata nell'analisi delle BAT. fMLP è un peptide batterico che induce l'attivazione dei basofili attraverso il recettore fMLP accoppiato alla proteina G. Per questo motivo, è spesso usato come controllo positivo dell'attivazione non IgE-mediata16. Gli anti-IgE o in alternativa anti-FcεRI sono usati come controlli positivi dell'attivazione dei basofili mediata da IgE. Nessuna attivazione dei basofili in presenza di controlli positivi sia non-IgE che IgE-mediati suggerisce una qualità insufficiente dei basofili o errori nel protocollo sperimentale. Al contrario, i basofili attivati con fMLP ma non con anti-IgE o anti-FcεRI sono designati come basofili non responder, essendo stimato che il 6-17% della popolazione generale non risponde alla stimolazione attraverso FcεRI in BAT 63,84,153, sebbene esprimano densità normali di IgE superficiale delle cellule. La mancata risposta potrebbe essere correlata a bassi livelli di fosfatasi Syk 154,155,156 insieme a livelli aumentati di CD45 157. Sebbene gli studi abbiano dimostrato che i basofili non responder possono trasformarsi in responder in presenza di IL-3158 nei test in vitro, i basofili non responder possono ancora essere rilevati nelle BAT e, in questi casi, i risultati non possono essere considerati per la valutazione.

Per quanto riguarda l'inclusione di IL-3, una citochina di priming basofila, non esiste un consenso generale. È stato riportato che l'uso di IL-3 migliora la reattività dei basofili nelle BAT basate su CD63 senza indurre la sovraregolazione di CD63 da sola dopo un breve pretrattamento 7.159.160. Tuttavia, un altro studio suggerisce che IL-3 sovraregola l'espressione di CD63 al basale161. Al contrario, nel caso di BAT basato su CD203c, gli studi confermano che il priming di IL-3 migliora l'espressione di CD203c da basofili a riposo, diminuendo le differenze tra basofili non stimolati e stimolati e diminuendo la sensibilità BAT 159.161.

Diverse strategie di gating possono essere utilizzate per identificare la popolazione di basofili e analizzare l'attivazione dei basofili mediante cittmetria a flusso. I basofili sono cellule a bassa dispersione laterale che possono essere identificate attraverso diverse opzioni di marcatori di selezione 162,163,164, essendo un punto chiave che potrebbe influenzare l'efficienza diagnostica di BAT165,166. La selezione dei marcatori cellulari dovrebbe essere basata sulla specificità per discriminare i basofili da altre popolazioni cellulari e sull'espressione di marcatori cellulari su cellule a riposo e attivate. I marcatori di selezione dei basofili più noti e comunemente usati sono: CD193 (CCR3) (espresso anche su mastociti, linfociti Th2162 ed eosinofili), CD123 (espresso anche su cellule dendritiche plasmacitoidi HLA-DR+), CD203c (espresso esclusivamente su basofili e sovraregolato dopo attivazione basofila) e FcεRI (espresso anche su progenitori pluripotenti di mastociti)139. Sulla base di questi marcatori cellulari e in combinazione con SSC, le strategie di selezione più comuni sono SSC low CCR3+, SSC low CCR3+CD203c+ (applicato in questo protocollo), SSC low CD123+HLA-DR−, SSC low CD203c+CD123+HLA-DR−, SSClowFcεRI+HLA-DR− (per escludere le cellule presentanti l'antigene e i monociti 146,161 ,162,163), SSC basso CD203c + CRTH2 + CD3- (per escludere le cellule T) 164, SSC basso CD203c + o SSC basso CCR3 + CD123 + 10.162.166, SSCbassoCD123 + (CD3-CD14-CD19-CD20-) 167.168, e SSCbassoIgE+169.170, sebbene quest'ultimo non sia raccomandato a causa delle limitazioni nei pazienti con bassi livelli di IgE. Dopo un'accurata selezione della popolazione di basofili, l'attivazione viene solitamente rilevata attraverso la rilevazione di CD63, situato nella membrana dei granuli secretori 16.171 la cui espressione sulla superficie dei basofili è direttamente correlata con la degranulazione dei basofili e il rilascio di istamina16.172.173. Un'altra opzione è l'analisi di CD203c, sebbene la sensibilità sia inferiore a causa della sua sovraregolazione da parte di IL-3159.161, espressa costitutivamente sui basofili a riposo e sovraregolata sui basofili attivati.

L'attivazione dei basofili viene rilevata misurando la percentuale di cellule CD63 positive (BAT basate su CD63) o le variazioni dell'intensità media di fluorescenza (MFI) CD203c (BAT basato su CD203c) rispetto a un controllo negativo impostato come valore soglia per ciascun test. Si raccomanda una soglia del 2,5% di cellule CD63 positive nel controllo negativo (cellule non stimolate) per determinare i risultati BAT più accurati rispetto a un test di provocazione controllato. La considerazione della positività dipende dallo stimolo testato. L'attivazione dei basofili è considerata positiva per uno stimolo se la percentuale di basofili CD63 positivi in presenza dello stimolo divisa per la percentuale di basofili CD63 positivi nel controllo negativo è superiore al cut-off calcolato dall'analisi della curva ROC dei dati ottenuti da pazienti allergici confermati e donatori sani.

Le prestazioni BAT consentono di distinguere tra attivazione basofila IgE-dipendente e IgE-indipendente analizzando l'effetto inibitorio della wortmannin (WTM)16,174,175, un potente e specifico inibitore della fosfoinositide 3-chinasi coinvolto nell'attivazione dei basofili IgE-mediati. Il test di inibizione viene eseguito incubando sangue con WTM (1 μM) a 37 °C per 5 minuti prima dell'incubazione con lo stimolo. Per confermare che l'inibizione delle BAT con WTM è corretta, deve essere osservata l'inibizione delle anti-IgE di controllo positivo ma non della fMLP di controllo positivo.

Sfortunatamente, non esiste una standardizzazione tra i diversi laboratori in termini di procedure, concentrazioni e marcatori. Sono necessari futuri studi multicentrici per standardizzare il metodo per confrontare i risultati tra i centri e per standardizzare e convalidare clinicamente il test.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Claudia Corazza per il suo prezioso supporto in lingua inglese. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto di Sanità ''Carlos III'' (ISCIII) del MINECO (sovvenzione cofinanziata dal FESR: "Una manera de hacer Europa"; Sovvenzioni n. PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 e RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Ministero regionale andaluso della sanità (concessione n. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID è uno sperimentatore clinico (B-0001-2017) e AA detiene un contratto post-dottorato senior (RH-0099-2020), entrambi supportati dal Ministero della Salute regionale andaluso (cofinanziato da ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile Corning 352008
APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody BioLegend 310708
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
FITC anti-human CD63 Antibody BioLegend 353006
HEPES (1 M) Thermo-Fisher 15630106
Lysing Solution 10x concentrated BD Biosciences 349202
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe Sigma-Aldrich F3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody BioLegend 324606
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Purified Mouse Anti-Human IgE BD Biosciences 555857
Recombinant Human IL-3 R&D Systems 203-IL
Sheath Fluid BD Biosciences 342003
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
TUBE 9 mL LH Lithium Heparin Greiner Bio-One 455084
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379

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Medicina Numero 171 Basofili allergene farmaco allergia diagnosi metodo in vitro CD63 CD203c
Test di attivazione dei basofili per la diagnosi di allergia
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Doña, I., Ariza, A., Fernández, T. D., Torres, M. J. Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis. J. Vis. Exp. (171), e62600, doi:10.3791/62600 (2021).

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