Summary
Представлен протокол расширения гамма-дельта (γδ) Т-клеточного лекарственного препарата. Лимфоциты выделяют элютрированием и γδ-обогащают золедроновой кислотой и интерлейкином-2. Альфа-бета-Т-клетки истощаются с помощью устройства магнитного разделения клинического класса. Клетки γδ культивируют совместно с искусственными антигенпрезентирующими клетками, полученными из K562, и расширяют.
Abstract
Хотя Т-клетки Vγ9Vδ2 являются незначительным подмножеством Т-лимфоцитов, эта популяция востребована за ее способность распознавать антигены основным комплексом гистосовместимости (MHC) независимым образом и развивать сильную цитолитическую эффекторную функцию, что делает ее идеальным кандидатом для иммунотерапии рака. Из-за низкой частоты гамма-дельта (γδ) Т-клеток в периферической крови мы разработали эффективный протокол для значительного расширения высокочистого лекарственного препарата γδ-клеток для первого в человеке использования аллогенных γδ Т-клеток у пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Используя здоровый донорский аферез в качестве аллогенного источника клеток, лимфоциты выделяют с помощью валидированного устройства для метода противоточного центрифугирования разделения клеток по размеру и плотности.
Используется богатая лимфоцитами фракция, и γδ Т-клетки предпочтительно активируются золедроновой кислотой (одобренной FDA) и интерлейкином (IL)-2 в течение 7 дней. После предпочтительного расширения γδ Т-клеток для истощения загрязняющих Т-клеточных рецепторов (TCR)αβ Т-клеток используется магнитное устройство для разделения клеток клинического класса и шарики TCRαβ. Высокообогащенные γδ Т-клетки затем подвергаются второму расширению с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (aAPC), полученных из клеток K562, генетически модифицированных для экспрессии одноцепочечного переменного фрагмента (scFv) для CD3 и CD28, 41BBL (CD137L) и IL15-RA-вместе с золедроновой кислотой и IL-2. Посев в течение всего дня 7 обогащенных γδ Т-клеток в кокультуре с aAPC облегчает производство высокочистых γδ Т-клеток со средним расширением в 229 000 раз > из здоровой донорской крови.
Introduction
Рецидив лейкемии является основной причиной смертности после трансплантации гемопоэтических клеток (HCT) у пациентов с ОМЛ1,2,3. Сообщалось о лучшей выживаемости без лейкемии при повышенном восстановлении γδ Т-клеток крови после HCT без повышенного риска болезни трансплантата против хозяина (GVHD)4. Способность γδ Т-клеток распознавать антигены независимым от MHC способом и развивать сильные цитолитические и Th1-подобные эффекторные функции делает эту незначительную субпопуляцию Т-клеток идеальной для лечения пациентов с ОМЛ, подвергающихся аллогенной трансплантации с риском рецидива5. Учитывая, что Т-клетки Vγ9Vδ2 являются второстепенным подмножеством Т-лимфоцитов в диапазоне от 0,5% до 5% Т-клеток на периферии6, мы решили создать надежную систему для расширения этой редкой популяции клеток крови для достижения потенциально терапевтических доз для клинических испытаний.
Хотя другие успешно расширили γδ Т-клетки, используя золедроновую кислоту и даже aAPC, мы разработали процесс, который потенциально может расширить γδ Т-клетки в 229 749 раз. Расширение двухфазное: сначала лимфоциты получают элютрированием с помощью инструмента разделения. Оборудование обеспечивает замкнутую систему, которая позволяет разделять ячейки на основе их размера, формы и плотности путем противоточного центрифугирования. После обогащения на лимфоциты селективное расширение Т-клеток Vγ9Vδ2 достигается лечением золедроновой кислотой и ИЛ-2 в течение 7 дней. Сразу после этого лечения TCR-αβ Т-клетки истощаются с использованием технологии микрогранул, что позволяет впоследствии расширять γδ Т-клетки с помощью APC, полученных из K562.
Для валидации процесса было использовано только 5 × 106 γδ-Т-клеток, расширенных золедроновой кислотой, для расширения кокультуры фазы-2 с aAPC. На этом втором этапе расширения γδ Т-клетки активируются с использованием текущего Банка рабочих клеток (WCB), совместимого с надлежащей производственной практикой (cGMP), генетически модифицированных APC K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)), изготовленных в Моффитте. Обоснование этого двухфазного расширения основано на способности золедроновой кислоты ингибировать фарнезилдифосфатсинтазу (FDPS) в моноцитах, что приводит к накоплению изопентенилпирофосфата, который непосредственно стимулирует клетки Vγ2Vδ2. На второй фазе расширения производные от K562 aAPC (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) обеспечивают надежную стимуляцию всех Т-клеток. Тем не менее, клеточный продукт уже был обогащен для γδ Т-клеток, что привело к надежному расширению γδ Т-клеток.
С использованием специального оборудования и колб процесс представляет собой функционально закрытую систему, что снижает риск загрязнения. Кроме того, 1 л закрытого системного биореактора способствует максимальному росту и расширению клеток в общем объеме 1 л среды с минимальной потребностью в питании. Преимущество метода Моффитта заключается в том, что он обеспечивает быструю, воспроизводимую и высокоосуществимую систему GMP для получения высокочистого продукта γδ-Т-клеток донорского происхождения для аллогенного введения. Этот метод может быть применен к любому клиническому испытанию, которое направлено на использование человеческих γδ Т-клеток, экспрессирующих рецепторы Т-клеток Vγ2Vδ2, в качестве приемной иммунотерапии для опосредования иммунитета против микробов и опухолей у больных раком с частичной и полной ремиссией. Кроме того, он обеспечивает надежную платформу для разработки и производства γδ химерных антиген-рецептор-положительных (CAR+) Т-клеток.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Было получено одобрение IRB и получено информированное согласие от доноров.
1. Выделение лимфоцитов
- Перенесите продукт афереза в чистое помещение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Валидация процесса проводилась с использованием обычного донорского афереза от внешнего коммерческого поставщика, соответствующего правилам сбора клеточного сырья. - Соберите образцы для тестирования на стерильность, количество клеток и фенотипирование клеток.
- Элютриат на устройстве центрифугирования противотока с использованием первичной среды сбалансированного раствора соли Хэнкса с 1% сывороточного альбумина человека (HSA) и вторичной среды физиологического раствора (0,9% хлорида натрия для инъекций USP) или фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS). Установите скорость центрифугирования элютриации на уровне 900 × g и соберите фракции на основе расхода и времени.
- Соберите образцы из фракции 2 и выполните следующие испытания: 2 мл для проверки на стерильность; 0,5 мл для количества и жизнеспособности клеток с использованием акридина оранжевого/йодида пропидия (АО/ПИ); 5 × 106 клеток для фенотипирования клеток методом проточной цитометрии.
- Расширить чистую фракцию лимфоцитов (фракция 2) клеток в культуре при 10 × 106 клеток/см2 в 1 л закрытого системного биореактора с 5 мкмоль/л золедроновой кислоты и 300 МЕ/мл IL-2.
- Инкубировать в течение семи дней в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
2. Истощение альфа-бета(αβ)Т-клеток
- Собирайте клетки из колбы с закрытой системой 1 л. Стерильно приварите 1-литровый трансферный пакет к красной линии биореактора с закрытой системой и используйте соответствующий фармацевтический насос для переноса клеток в трансферную упаковку.
- Берут следующие пробы: 10 мл на отработанную среднюю стерильность; 0,5 мл клеток для подсчета и жизнеспособности клеток с использованием АО/ПИ; 5 × 106 клеток для проточной цитометрии
- Повторное суспендирование клеток при ~5 × 108 клеток/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) или (PBS/этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА)) буфере + 0,5% HSA и биотинилированное TCR αβ-специфическое антитело.
- Поместите шейкер в холодильник и высиживайте ячейки при 2-8 °C в течение приблизительно 15 мин с встряхиванием.
- Промывайте ячейки общим количеством 600 мл буфера PBS/EDTA + 0,5% HSA. Центрифуга удаляет несвязанное антитело при 200-500 × г в течение 15 мин при 2-8 °С. Повторное суспендирование ~5 × 108 клеток/мл в буфере PBS/EDTA + 0,5% HSA с антибиотин-специфическими микрошариками (7,5 мл/1 флакон).
- Поместите шейкер в холодильник и высиживайте ячейки при 2-8 °C в течение приблизительно 15 мин с встряхиванием. После инкубации центрифугируют клетки при 200-500 × г в течение 15 мин при 2-8 °C для удаления несвязанных микрошариков. Повторное суспендирование ~6 × 107 клеток/мл в буфере PBS/EDTA + 0,5% HSA и перенос их в сумку для переноски.
- Установите комплект трубок в устройство разделения магнитных клеток клинического класса, следуя инструкциям производителя, поместите упаковки с буфером PBS / EDTA и передаточным пакетом с клеточным продуктом в приборе и увеличьте его по указанию прибора.
- Выберите протокол Depletion 1.2 для истощения меченых αβ Т-клеток.
- Центрифугировать целевую фракцию (обогащенную γδ Т-клетками) и повторно суспендировать клетки в среде, дополненной 10% сывороткой AB человека.
- Возьмите образец объемом 0,5 мл и выполните подсчет и жизнеспособность клеток с окрашиванием AO / PI. Доведите клетки до конечной концентрации приблизительно 1 × 106 клеток/мл. Возьмите образец из 5 × 106 клеток продукта для фенотипирования проточной цитометрии после истощения.
3. Совместная культура с APC
- Облучение 5 × 107 aAPC/колба при 100 Гр на рентгеногенерирующем приборе.
- Используйте aAPC в кокультуре в соотношении 10:1 с γδ Т-клетками. Поместите облученные APC (5 × 107 клеток/колбу) и γδ Т-клетки (5 × 106 клеток/колбу) в колбы с закрытой системой 1 л закрытой системы с 1 л питательной среды, дополненной 10% сывороткой AB человека. Высевают до 10 колб.
- Разверните клетки в культуре в течение 10 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
- Контролируйте уровень глюкозы и лактата каждые 3-4 дня с помощью полосок, глюкозы и лактатометра.
- Если уровень глюкозы падает до 250 мг/дл, уменьшите объем в колбе до 200 мл с помощью фармацевтического насоса путем стерильной сварки 1-литрового трансферного пакета к красной линии закрытого системного биореактора.
- Смешайте клетки в оставшихся 200 мл и возьмите образец 0,5 мл для подсчета клеток и измерения жизнеспособности путем окрашивания AO-PI. Если количество клеток составляет ≥109, разделите одну колбу на две колбы и заполните каждую колбу до 1 л AIM-V, дополненной 10% сывороткой AB человека. Если количество клеток составляет <109, кормите клетки свежим литром питательной среды, дополненной 10% сывороткой AB человека.
- Повторите шаг 3.6 для всех колб и верните их в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Повторяйте шаги 3,4-3,7 каждые 3-4 дня.
4. Сбор клеток
- По истечении 10 дней в кокультуре собирают все колбы биореактора. Соберите 1 колбу биореактора за раз и объедините все клетки в трансферную упаковку соответствующего размера. Стерильно приварите трансферную упаковку к красной линии биореактора с закрытой системой и используйте фармацевтический насос для переноса клеток в передаточный пакет.
- Удаляют следующие образцы контроля качества: 1% лекарственного препарата (ДП) для стерильности путем посева крови и окрашивания граммами; 0,5 мл для подсчета и жизнеспособности клеток с использованием АО/ПИ; 5-10 × 106 клеток для проточной цитометрии (см. Рисунок 1 для стратегии гастинга); 0,5 мл для эндотоксина; 0,5 мл для окрашивания в грамм; 106 клеток превратились в 10 мл отработанной среды для тестирования на микоплазму.
- Центрифугируют клетки при 200-500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре и выбрасывают супернатант.
- Промыть ячейки раствором сбалансированного кристаллоидного раствора + 0,5% HSA при 200-500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторно суспендируют их в целевом объеме 100-300 мл сбалансированного кристаллоидного раствора + 0,5% HSA.
5. Тестирование релиза
- Провести контроль качества γδ Т-клеток DP для следующего: чистоты и идентичности методом проточной цитометрии (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); жизнеспособность при окрашивании АО/ПИ; эндотоксин; Тестирование микоплазмы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР); стерильность путем окрашивания по граму и аэробных и анаэробных культур крови; остаточный анализ К562 методом проточной цитометрии (CD3-CD16-CD56-CD71+).
Representative Results
Процесс γδ Т-клеток был охарактеризован и оптимизирован для производства лекарственного препарата γδ Т-клеток. Оптимизация процесса включала 1) обогащение лимфоцитов с использованием элютриации, 2) γδ Т-клеточное лекарственное вещество (DS) клеточно-специфическое расширение золедроновой кислотой, 3) γδ T-клеточное разрушение DS TCRαβ, 4) вторичное расширение γδ T-клеточной DS с использованием K562-производных aAPC и 5) конечный сбор DP и рецептура продукта для введения или криоконсервации. После оптимизации процесса были выполнены подтверждающие прогоны в масштабе с использованием материала, полученного от трех здоровых доноров, для подтверждения пригодности обработки клеток. Все данные были проанализированы и обобщены в Таблице 1, Таблице 2 и Таблице 3. Клетки, отделенные от постпротивоточного центрифугирования фракции 2 (F2), дали чистую популяцию лимфоцитов со средним содержанием 99,23% клеток CD45+ (сообщается как частота общего живого затвора) и отличной средней жизнеспособностью 95,80% (таблица 1).
γδ Т-клеточное специфическое расширение с золедроновой кислотой зависело от начального процента естественных клеток-киллеров (NK), присутствующих в фракции лимфоцитов (F2) после элютриации. Обогащение γδ Т-клеток DS с истощением TCRαβ было последовательным (таблица 2). Γδ T-клеточный DP, изготовленный из трех здоровых доноров, имел в среднем 0,11% ± 0,05% CD20 + В-клеток и 0,00% ± 0,00% TCR αβ + Т-клеток, таким образом, удовлетворяя критерию высвобождения ≤1% TCR αβ + Т-клеток. Средний процент NK-клеток в конечном продукте составляет 17,06% ± 26,19% и соответствует критерию высвобождения <35%. Кроме того, средний процент Т-клеток и NK-клеточных линейно-отрицательных клеток в конечном продукте составил 0,48% ± 0,42% (таблица 3). Окрашивание поверхности клеток и проточный цитометрический анализ использовались для характеристики идентичности, чистоты и технологических примесей DS и DP, как показано на рисунке 2A-D.
Вторичное расширение, достигнутое из кокультуры aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB и γδ Т-клетки DS в соотношении 10:1, генерировало γδ T-ячейку DP, которая соответствовала всем критериям высвобождения, как показано в таблице 4. Кроме того, клетки окрашивали и оценивали с помощью проточной цитометрии на 0-й день центрифугирования клеток F2, Т-клеток, расширенных 7-золедроновой кислотой, истощения Т-клеток 7-TCR αβ, 17-го дня ДП для следующего кластера биомаркеров дифференцировки (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC хемокиновый рецептор 7 (CCR7), запрограммированный белок гибели клеток-1 (PD-1), цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4 (CTLA4), активирующий лимфоциты ген 3 (LAG3) и Т-клеточный иммуноглобулин и муцин, содержащий домен белка 3 (TIM3). Данные, показанные на рисунке 3 , усреднены из трех независимых прогонов и демонстрируют, что ячейки не достигли истощения. Moffitt CTF также разработал остаточный анализ K562 для определения примесей DP, связанных с APC, полученными из K562 (рисунок 4).
Стратегия проточного цитометрического гатинга, используемая для характеристики процентного соотношения типов клеток, была следующей: 1) обнаружение Т- и NK клеточной линии отрицательной популяции (CD3-CD56-CD16-); 2) затвор на CD71+ (рецептор трансферрина, экспрессируемый в эритроидной линии и ОМЛ, позволяющий обнаруживать остаточные клетки K562). Эта стратегия измерения позволила оценить клетки CD3-CD16-CD56-CD71+, которые являются aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (называемый «остаточным K562» на рисунке 4). Эта система позволяет перечислить остаточный K562 в конечном DP путем умножения частоты остаточного K562 на общее количество жизнеспособных чисел (TVC) DP (%CD71+ × DP TVC = Остаточные ячейки K562 в DP). Все цитометрические данные потока сообщаются как частота живых клеток. В таблице 5 и на рисунке 4 приведены процентные доли отрицательных по линии Т-клеток и NK-клеток, а также остаточных клеток K562. Для определения статистической значимости различий между этими популяциями был проведен двуххвостый т-тест, который показал, что существует значительная разница между WCB и γδ T-клетками DP и между WCB и γδ T-клетками (t = 0,0019 для Т-клеток и NK-клеток с отрицательной линией; t < 0,0001 для остаточного K562 и t = 0,0314 для Т-клеток и NK-клеток - отрицательный; t < 0,0001 для остаточного K562) (таблица 5).
Рисунок 1: Схематическое представление стратегии проточной цитометрической решетки. Сокращения: aAPC = , искусственная антигенпрезентирующая клетка; SSC-A = площадь бокового рассеяния пика; FSC-A = прямая площадь рассеяния пика; SSC-H = высота бокового рассеяния пика; FSC-H = прямая высота рассеяния пика; CD = кластер дифференциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Состав исходного материала, промежуточных продуктов и конечного лекарственного средства. Все показанные данные усредняются из трех независимых запусков. (A) Аферез от здоровых доноров подвергается элютрированию с использованием устройства центрифугирования противотока, в результате чего образуется F2 (богатая лимфоцитами фракция), которая используется в качестве исходного материала. (B) F2 подвергается Vγ9Vδ2 Т-клеточному расширению в течение 7 дней с 5 мкмоль/л золедроновой кислоты и 300 МЕ/мл IL-2 в 1 л среды, дополненной 10% сывороткой AB человека. (C) Истощение TCR αβ Т-клеток осуществляется на продукте, вскрываемом золедроновой кислотой. (D) Высокочистый γδ Т-клеточный лекарственный препарат собирают после второго 10-дневного расширения облученными aAPC в соотношении 1:10 с 5 мкмоль/л золедроновой кислоты и 300 МЕ/мл IL-2 в 1 л среды, дополненной 10% сывороткой AB человека. Сокращения: NK = природный убийца; CD = кластер дифференциации; TCR = Т-клеточный рецептор; IL = интерлейкин; aAPC = искусственные антигенпрезентирующие клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Биомаркеры исходного материала, промежуточных продуктов и конечного лекарственного средства. Клетки собираются и окрашиваются для CD3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 и TIM3 в день 0-противоточного центрифугирования F2 клеток, 7-го дня золедроновой кислоты-расширенных Т-клеток, 7-TCR αβ Т-клеток дня, 17-го дня окончательного лекарственного препарата. Все показанные данные усредняются из трех независимых запусков. (A) Стволовые (CD3+, TCR γδ+, CD45RA+, CD45RO- и CCR7+), показанные как общее количество живых клеток. (B) Центральная память (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+ и CCR7+), изображенная в процентах от CD3+ TCR γδ+ клеток. Сокращения: CD = кластер дифференциации; TCR = Т-клеточный рецептор; IL = интерлейкин; . CCR7 = CC хемокиновый рецептор 7; PD-1 = запрограммированный белок гибели клеток-1; CTLA4 = цитотоксический Т-лимфоцитарно-ассоциированный белок 4; LAG3 = ген, активирующий лимфоциты 3; TIM3 = Т-клеточный иммуноглобулин и муциновый домен-содержащий белок 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные данные остаточного анализа K562 (CD3-CD16-CD56-CD71+). Сокращения: aAPC = искусственная антигенпрезентирующая клетка; NK = естественная клетка-киллер; SSC-A = площадь бокового рассеяния пика; CD = кластер дифференциации; IL = интерлейкин; TCR = Т-клеточный рецептор; MCB = банк главных ячеек; FMO = флуоресценция минус единица; DP = лекарственное средство; WCB = банк рабочих ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Этапы процесса | Параметры | Доноров | Средний | Св. | |||
| Выполнить 1 | Выполнить 2 | Вылет 3 | |||||
| Постобогащение (фракция лимфоцитов F2) | TVC Все валидации процессов были посеяны на 109 TVC | 1,00 Х 109 | 1,00 Х 109 | 1,00 Х 109 | 1,00 Х 109 | 0.00 | |
| Жизнеспособность (%) | 98.6 | 96.6 | 92.2 | 95.8 | 3.27 | ||
| CD20+ В-клетки (%) | 15.6 | 23.4 | 15.2 | 18.07 | 4.62 | ||
| CD3+ Т-клетка (%) | 80.04 | 66.7 | 76.1 | 74.28 | 6.85 | ||
| TCR αβ+ (%) | 77.59 | 58.03 | 68.96 | 68.19 | 9.8 | ||
| TCR γδ+ (%) | 2.48 | 1.59 | 2.1 | 2.06 | 0.45 | ||
| CD3-CD56 + CD16 + NK-клетки (%) | 6.57 | 19.4 | 10.5 | 12.16 | 6.57 | ||
| Отрицательная линия Т-клеток и NK-клеток (%) | 13 | 13.7 | 13.4 | 13.37 | 0.35 | ||
Таблица 1: Сводка об обогащении лимфоцитов элютрированием, сообщаемая как частота живых клеток. Сокращения: ТВЦ = общее число жизнеспособных; TCR = Т-клеточный рецептор; CD = кластер дифференциации; NK = естественная клетка-киллер.
| Этапы процесса | Параметры | Доноров | Средний | Св. | |||
| Выполнить 1 | Выполнить 2 | Вылет 3 | |||||
| 7-дневное расширение после золедроновой кислоты (до истощения TCRαβ) | ТВЦ | 3,69 Х 109 | 1,79 Х 109 | 1,42 Х 109 | 2,3 Х 109 | 1,22 Х 109 | |
| Жизнеспособность (%) | 99.2 | 82.6 | 89.8 | 90.53 | 8.32 | ||
| CD20+ В-клетки | 2.1 | 11.5 | 7.08 | 6.89 | 4.7 | ||
| CD3+ Т-клетка (%) | 95.7 | 64.1 | 91.9 | 83.9 | 17.25 | ||
| TCR αβ+ (%) | 13.88 | 38.14 | 31.98 | 28 | 12.61 | ||
| TCR γδ+ (%) | 81.44 | 24.93 | 56.98 | 54.45 | 28.34 | ||
| CD3-CD56 + CD16 + NK-клетки (%) | 3.59 | 33.1 | 7.28 | 14.66 | 16.08 | ||
| Отрицательная линия Т-клеток и NK-клеток (%) | 0.67 | 2.7 | 0.82 | 1.4 | 1.13 | ||
| Истощение после TCRαβ | ТВЦ | 1,81 х 109 | 4,95 Х 108 | 3,80 Х 108 | 8,95 х108 | 7,94 Х 108 | |
| Жизнеспособность клеток (%) | 98.8 | 87.6 | 89.8 | 92.07 | 5.93 | ||
| CD20+ В-клетки | 2.26 | 12 | 6.59 | 6.95 | 4.88 | ||
| CD3+ Т-клетка (%) | 95.8 | 45.3 | 89.7 | 76.93 | 27.56 | ||
| TCR αβ+ (%) | 0 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | ||
| TCR γδ+ (%) | 95.61 | 45.07 | 89.16 | 76.61 | 27.51 | ||
| CD3-CD56 + CD16 + NK-клетки (%) | 3.85 | 59.9 | 9.79 | 24.51 | 30.79 | ||
| Отрицательная линия Т-клеток и NK-клеток (%) | 0.34 | 1.72 | 0.45 | 0.84 | 0.77 | ||
| TCR αβ+ ТВЦ | 0.00 | 4,95 х 103 | 3,8 Х 103 | 2,92 Х 103 | 2,59 Х 103 | ||
| TCR γδ+ ТВЦ | 1,73 Х 109 | 2,23 Х 108 | 3,39 Х 108 | 7,64 Х 108 | 8,39 Х 108 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK ТВЦ | 6,97 Х 107 | 2,97 Х 108 | 3.72Е+07 | 1,35 Х 108 | 1,42 Х 108 | ||
Таблица 2: Сводная информация о расширении γδ Т-клеток золедроновой кислотой и инструментальном обогащении, сообщаемом как частота живых клеток. Сокращения:TVC = общее количество жизнеспособных; TCR = Т-клеточный рецептор; CD = кластер дифференциации; NK = естественная клетка-киллер.
| Атрибуты продукта | Параметры | Доноров | Средний | Св. | |||
| Выполнить 1 | Выполнить 2 | Вылет 3 | |||||
| День 0 γδ Т-клетки | 2,48 Х 107 | 1,59 Х 107 | 2,10 Х 107 | 2,06 Х 107 | 4,47 Х 107 | ||
| День 7 после обогащения γδ Т-клеток | 1,73 Х 109 | 2,23 Х 108 | 3,39 Х 108 | 7,64 Х 108 | 8,39 Х 108 | ||
| Свернутое расширение на 7-й день | 69.76 | 14.03 | 16.14 | 33.31 | 31.58 | ||
| ТВЦ при сборе урожая* | 8,14 Х 1010 | 1,67 Х 1010 | 6,84 Х 1010 | 5,55 Х 1010 | 3,42 Х 1010 | ||
| Жизнеспособность клеток (%) | 92.8 | 85.5 | 87.3 | 88.53 | 3.80 | ||
| CD20+ В-клетки (%) | 0.12 | 0.06 | 0.15 | 0.11 | 0.05 | ||
| CD3+ Т-клетка (%) | 97.8 | 52 | 97.5 | 82.43 | 26.36 | ||
| TCR αβ+ (%) | 0 | 0.001 | 0 | 0.00 | 0.00 | ||
| TCR γδ+ (%) | 97.51 | 50.13 | 97.21 | 81.62 | 27.27 | ||
| CD3-CD56 + CD16 + NK-клетки (%) | 2.16 | 47.3 | 1.71 | 17.06 | 26.19 | ||
| Отрицательные линии Т-клеток и NK-клеток, CD71+ Residual K562 (%) | 0.018 | 0.61 | 0.82 | 0.48 | 0.42 | ||
| Общее количество γδ Т-клеток в Harvest | 7,93 Х 1012 | 8,38 Х 1011 | 6,65 Х 1012 | 5,14 Х 1012 | 3,78 Х 1012 | ||
| Полное сложение γδ Т-клеток (от дня 0 до сбора урожая) | 3,20 Х 105 | 5,27 Х 104 | 3,17 Х 105 | 2,30 Х 105 | 1,53 Х 105 | ||
| * Валидация процесса была уменьшена до колбы с 5 X 106 γδ Т-ячейкой и 50 X106 облученными aAPC. Приведенные цифры относятся к прогнозируемому полномасштабному запуску, если 24 колбы посеяны из использованного лекарственного вещества D7. | |||||||
Таблица 3: Сводка кокультуры γδ+ Т-клеток с aAPC и расширенного сбора γδ+ Т-клеток, сообщаемая как частота живых клеток. * Валидация процесса была уменьшена до одного биореактора с закрытой системой (емкость 1 л) с 5 × 106 γδ Т-клетками и 50 × 106 облученными aAPC. Сообщаемые цифры относятся к прогнозируемому полномасштабному запуску, если 24 колбы посеяны из лекарственного вещества D7. Сокращения: aAPCs = искусственные антигенпрезентирующие клетки; TVC = общее количество жизнеспособных; TCR = Т-клеточный рецептор; CD = кластер дифференциации; NK = естественная клетка-киллер.
| Параметр теста | Критерии приемлемости | Результаты | ||
| Проверка 1 | Проверка 2 | Проверка 3 | ||
| Жизнеспособность | ≥ 70% | 92.80% | 85.50% | 87.30% |
| Микоплазмы | Отрицательная | Отрицательная | Отрицательная | Отрицательная |
| Стерильность | Финал без роста (14 дней) | Финал без роста (14 дней) | Финал без роста (14 дней) | Финал без роста (14 дней) |
| Граммовое пятно | Организмы не замечены (NOS) | НОС | НОС | НОС |
| Эндотоксин | ≤ 2 ЕС/мл | <0.50 ЕС/мл | <0.50 ЕС/мл | <0.50 ЕС/мл |
Таблица 4: Резюме результатов испытаний на высвобождение γδ-Т-клеток для контроля качества.
| Остаточный анализ K562 | К562 | ВКБ | Только γδ | γδ + WCB Продукт | ||||
| T и NK клеточная линия нег. % | Остаточный K562 % | T и NK клеточная линия нег. % | Остаточный K562 % | T и NK клеточная линия нег. % | Остаточный K562 % | T и NK клеточная линия нег. % | Остаточный K562 % | |
| 99.4 | 98.8 | 98.7 | 96.83 | 3.49 | 0.58 | 0.48 | 0.07 | |
| 99.2 | 98.31 | 99.5 | 98.21 | 12.8 | 0.38 | 3.87 | 0.71 | |
| 98.9 | 98.6 | 97.6 | 95.55 | Н/Д | Н/Д | 14.4 | 0.63 | |
| 99.2 | 98.9 | 97.9 | 96.53 | Н/Д | Н/Д | Н/Д | Н/Д | |
| 98.7 | 98.3 | 98.6 | 97.6 | Н/Д | Н/Д | Н/Д | Н/Д | |
| Средний | 99.08 | 98.58 | 98.46 | 96.94 | 8.15 | 0.48 | 6.25 | 0.47 |
| Св. | 0.28 | 0.27 | 0.74 | 1.02 | 6.58 | 0.14 | 7.26 | 0.35 |
Таблица 5: Т-клеточные и NK-клеточные линейные и остаточные K562 проценты, сообщаемые как частота живых клеток. Сокращения: NK = естественная клетка-киллер; WCB = банк рабочих ячеек.
Discussion
Лаборатория клеточной терапии Моффита разработала протокол с двухфазным расширением высокочистых γδ Т-клеток для использования в качестве DP в клинических испытаниях. Этот протокол обеспечивает метод производства в соответствии с руководящими принципами cGMP в закрытой системе, которая дает высокочистую γδ T-ячейку DP, которая успешно активируется и расширяется золедроновой кислотой и WCB aAPCs. Этот протокол был одобрен FDA для производства аллогенной γδ Т-клеточной DP для пациентов с ОМЛ. Используя здоровых доноров, мы успешно расширили небольшую популяцию донорских γδ Т-клеток всего за 7 дней с 2,06 ± 0,45% до 54,45 ± 28,34%. После 7-дневного расширения золедроновой кислотой было замечено, что донор 2 имел увеличение популяции НК.
Золедроновая кислота ингибирует фарнезилдифосфатсинтазу (FDPS) в моноцитах, что, в свою очередь, приводит к накоплению изопентенилпирофосфата (IPP), что коррелирует со значительным увеличением пролиферации Т-клеток и естественных NK-клеток7,8,9. Это увеличение популяции NK препятствует 2-й фазе расширения с aAPCs, поскольку aAPC будут только способствовать дальнейшему расширению NK-клеток. По этой причине критерии доноров были изменены, чтобы исключить доноров с высокой численностью населения Нагорного Карабаха. После истощения αβ Т-клеток γδ Т-клетки были дополнительно обогащены до 76,61 ± 27,51%. Этот уникальный протокол включает в себя второе расширение, использующее APC производства Моффита для нацеливания на рецепторы CD8, CD28 и CD127L в γδ Т-клетках. Эта вторая фаза расширения с aAPC дала DP с ≥65% для CD3 + TCR γδ + Т-клеток, ≤1% TCRαβ T и <35% CD3-CD16 + CD56 + NK-клеток. В связи с использованием APC, полученных из K562, было необходимо продемонстрировать, что эти APC составляют <1% конечного продукта.
Moffit CTF разработал проточный цитометрический анализ, используемый для критериев высвобождения для измерения процента остаточных клеток K562 в конечном DP. Этот проточный цитометрический анализ смягчает все проблемы использования антигенов клеточной поверхности для идентификации клеток K562. Поскольку активированные Т-клетки могут экспрессировать CD71, мы разработали стратегию исключения всех Т-клеток и NK-клеток путем выделения популяций CD3-CD56- и CD16- , а затем изучения клеток CD71+ , которые будут исключительно клетками K562. Этот протокол демонстрирует, что DP γδ Т-клеток дает 0,48 ± 0,42% остаточных клеток K562 и соответствует всем критериям высвобождения жизнеспособности ≥70%, негативности микоплазмы с помощью ПЦР, отсутствия организмов, видимых при окрашивании граммами, ≤2 ЕС / мл эндотоксина и отсутствия стерильности конечного роста (14 дней) культуры крови.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим премию «Клеточная иммунотерапия-исследователь инициировал испытания» от Онкологического центра Моффитта за финансирование этого протокола. Мы также благодарим д-ра Клаудио Анасетти за его неоценимую помощь и руководство в рамках этого проекта. Наконец, мы благодарим д-ра Джастина Буше за его идеи и рецензию на рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution | R&D | 285-GMP | |
| Human Albumin 25% | Grifolis | 65483-16-071 | |
| Plasmalyte A | Fisher | 2B2543Q | |
| Zoledronic Acid (Zometa) | Hos pira | 4215-04--8 | FDA approved drug |
| DMSO | WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH | WAK-DMSO-10 | |
| CS10 | BIOLIFE SOLUTIONS | 210374 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 100 mL syringe | JMS | 992861 | |
| 18g Needle | Fisher | 305198 | |
| Cryovials 1.8 mL | Fisher | 375418 | |
| 5 mL pipette | Fisher | 1367811D | |
| 50 mL pipette | Fisher | 1367610Q | |
| 10 mL pipette | Fisher | 1367811E | |
| 100 mL pipette | Fisher | 07-200-620 | |
| 15 mL conical | Fisher | 05-539-12 | |
| 50 mL conical | Fisher | 05-539-7 | |
| 250 mL conical | Fisher | 430776 | |
| 600 mL Transfer Pack | TERUMO BCT INC | 1BBT060CB71 | |
| 4" Plasma Transfer Set | INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES | 03-220-90 | |
| Elutra Tubing Set | TerumoBCT | 70800 | |
| 100 MCS GREX | WILSON WOLF MFG CORP | 81100-CS | |
| Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system | Fisher Scientific | 22-246660 | |
| Acacia Pump boot | MPS Medical In | 17789HP3MLL | |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec Inc | 130-070-525 | |
| Dornase Alpha | Genentech, Inc | 50242-100-40/186-0055 | FDA approved drug |
| 1000 mL 0.22 um Filter | Fisher | 157-0020 | |
| Blood Filter 170um | B.Braun | V2500 | |
| CliniMACs Tubing set | Miltenyi Biotec Inc | 130-090-719 | |
| CliniMACS TCRα/β Kit | Miltenyi Biotec Inc | 130-021-301 | |
| Y-Type blood set | Fenwal | FWL4C2498H | |
| 75 mL Flask | Fisher | 430641U | |
| IL-2 | Prometheus | 65483-116-071 | FDA approved drug |
| AIM-V | Fisher | 0870112BK | |
| Human AB serum | Gemini Bio-Product | 100H41T | |
| 3 Liter Transfer pack | Independent Medical Associates | T3109 | |
| 1000 pipette tips | Fisher Scientific | 5991040 | |
| CF-250 | KOLBio | CF-250 | |
| Elutra | TERUMOBCT | ||
| CliniMACS | Miltenyi Biotec Inc | ||
| GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump | WILSON WOLF MFG CORP | ||
| HERAcell Vios CO2 Incubator | Thermo Scientific |
References
- Bejanyan, N., et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).
- Bejanyan, N., et al. Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).
- Schmid, C., et al. Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation. Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).
- Siegers, G. M., et al. Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model. PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).
- Airoldi, I., et al. γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes. Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).
- Acuto, O., et al. The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors. Cell. 34 (3), 717-726 (1983).
- Xiao, L., et al. Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells. Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).
- Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy. Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).
- Xu, Y., et al. Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer. Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).
