Summary
هنا ، نقدم نموذج آفة الغضروف داخل المفصل الناجم عن التحميل الدوري لركبة الفئران ، الناتجة عن 60 ضغطا دوريا يزيد عن 20 نيوتن ، مما يؤدي إلى تلف غضروف اللقمة الفخذية في الفئران.
Abstract
لا تزال الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المفاصل الأولي (OA) غير واضحة. ومع ذلك ، من المحتمل أن يرتبط تصنيف فرعي محدد ل OA في الفئات العمرية الأصغر نسبيا بتاريخ من تلف الغضروف المفصلي وقلع الأربطة. تلعب النماذج الحيوانية الجراحية لالتهاب المفاصل في الركبة دورا مهما في فهم بداية وتطور الزراعة العضوية بعد الصدمة والمساعدة في تطوير علاجات جديدة لهذا المرض. ومع ذلك ، فقد تم النظر مؤخرا في النماذج غير الجراحية لتجنب الالتهاب الرضحي الذي يمكن أن يؤثر على تقييم التدخل.
في هذه الدراسة ، تم تطوير نموذج فأر آفة الغضروف داخل المفصل الناجم عن التحميل الانضغاطي الدوري في الجسم الحي ، مما سمح للباحثين ب (1) تحديد الحجم الأمثل والسرعة ومدة الحمل التي يمكن أن تسبب تلف الغضروف البؤري. (2) تقييم التغيرات المرضية الزمانية المكانية بعد الصدمة في حيوية الخلايا الغضروفية ؛ و (3) تقييم التعبير النسيجي للجزيئات المدمرة أو الوقائية التي تشارك في آليات التكيف والإصلاح ضد الأحمال الانضغاطية المشتركة. يصف هذا التقرير البروتوكول التجريبي لهذه الآفة الغضروفية الجديدة في نموذج الفئران.
Introduction
تقليديا ، يعتبر استئصال الرباط الصليبي الأمامي (ACL) أو زعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي هو الأمثل للتحقيق في هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) في الحيوانات الصغيرة. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام نماذج الضغط الدوري غير الغازية لدراسة PTOA. تم تصميم هذا النموذج في الأصل للتحقيق في استجابة العظام الملغاة للتحميل الميكانيكي1 ثم تم تعديله كنموذج حيواني غير جراحي لدراسات PTOA2،3،4،5،6. الأساس المنطقي هو تصادم الغضروف المفصلي عن طريق تطبيق قوة خارجية دورية ، مما يؤدي إلى سلسلة من الاستجابات الالتهابية. ومع ذلك ، تم تطبيق هذا النموذج فقط على الفئران ، ولم تتم مناقشة الحجم المناسب للتحميل على الحيوانات الكبيرة.
مشكلة أخرى في النموذج السابق هي أن بروتوكول الحجم الكبير تضمن العديد من الدورات ، مما تسبب في سماكة مفرطة للعظم تحت الغضروف ، وهو أحد الآثار الجانبية غير المرغوب فيها ، في عدة عينات7. لذلك ، تم تطوير طريقة جديدة للضغط الدوري مع الحجم المناسب للحيوانات الكبيرة وتأثير جانبي أقل للتحميل8. الهدف العام من المقالة الحالية هو وصف بروتوكول نموذج الضغط الدوري غير الغازي في الفئران ومراقبة النتائج التمثيلية لتنكس الغضروف. سيساعد البروتوكول الحالي القراء المهتمين بتطبيق نموذج الضغط الدوري غير الغازي على الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة البحوث الحيوانية بجامعة كيوتو (رقم الموافقة: Med kyo 17616).
1. أداء في الجسم الحي ضغط دوري على ركبة الفئران
- الحث على تخدير التجارب
- حث التخدير في فأر Wistar البالغ من العمر 12 أسبوعا (256.8 ± 8.7 جم) عن طريق استنشاق محلول إيزوفلوران بنسبة 5٪ في صندوق التخدير.
- حقن داخل الصفاق خليط من ثلاثة عوامل مخدرة9 ، بما في ذلك ميديتوميدين ، ميدازولام ، وبوتورفانول ، في 2 ملغ / كغ من وزن جسم الفئران ، وحلق المنطقة المحيطة بمفصل الركبة الأيمن. تأكد من التخدير الكافي عن طريق عدم وجود منعكس دواسة لقرصة إصبع القدم.
- قم بتركيب الجرذ المخدر على جهاز التثبيت.
- ضع الجرذ المخدر ملقى على بطنه على الصفيحة الأساسية (الشكل 1) ، مع ربط الركبة اليمنى بقطعة صغيرة من الراتنج مع أخدود مقعر. ضع الطرف الخلفي الأيمن في وضعي تمديد الورك وثني الركبة وتمديد الكاحل ، مع ثني الركبة بزاوية 140 درجة تقريبا. استيعاب كعب الفئران على الأخدود على شكل إسفين على لاعبا اساسيا المنقولة.
- انقل جهاز التثبيت إلى أداة اختبار الإجهاد / الشد (انظر جدول المواد). بعد التأكد من عدم وجود جهات اتصال مع خلية التحميل ، افتح برنامج التحكم في أداة اختبار الإجهاد / الشد (جدول المواد) وانقر على زر المعايرة . بعد المعايرة ، قم بتوصيل الجزء العلوي من الإطار بخلية التحميل بعناية. للحفاظ على مفصل الركبة متصلا بشكل وثيق بالإطار ، قم بتشغيل المقبض الدوار على لوحة التشغيل الرئيسية المتحركة ببطء حتى يصل التحميل المسبق إلى 5 نيوتن.
- بناء طريقة التحميل وإعداد اختبار الضغط.
- في القائمة الرئيسية ، انقر فوق إنشاء طريقة جديدة | تسمية النظام . اضبط وضع الاختبار على دورة ، ونوع الاختبار على الضغط. انقر فوق ملصق المستشعر وحدد علامة التبويب اختبار للتحقق من أن الحد في حدود 60 نيوتن. بالإضافة إلى ذلك ، حدد علامة التبويب Stroke وتحقق من أن الحد في حدود 500 مم.
ملاحظة: ستوقف الخطوة أعلاه العملية على الفور إذا كان هناك إزاحة كبيرة على نقطة الإجهاد. - ضمن تسمية التحكم في الاختبار ، حدد أصل النمو لبدء البرنامج الرئيسي بنسبة 0.3٪ / مقياس كامل. من بين الأقسام الأربعة في دورة التحميل ، اضبط سرعة الشط في التحكم في القسمينالأول و 3 إلى 1 مم / ثانية. اضبط قوة الاختبار القصوى في القسم الثاني على 20 نيوتن ، والحد الأدنى لقوة الاختبار في القسم الرابع إلى 5 نيوتن. اضبط "مدة الانتظار" على 0.5 ثانية لحمل الذروة و 10 ثوان للحد الأدنى للحمل (الشكل 2).
ملاحظة: نظرا لأن هذه الخطوة تحدد كل دورة ، تأكد من أن أسطح المفصل على اتصال ببعضها البعض وتتحرك بسرعة معقولة وأن الحركة يتم الحفاظ عليها. - في علامة التبويب التحميل المسبق في أسفل الصفحة ، تأكد من تحديد تشغيل ، وضبط سرعة إزالة الانحراف على 100 مم / دقيقة ، والقوة القصوى هي 5 نيوتن. في ملصق العينة ، اضبط المادة كمعدن.
ملاحظة: قد تكون هذه الإعدادات التفصيلية خاصة بكل مصنع. - في القائمة الرئيسية ، ضمن قسم تحديد الطريقة والاختبار ، حدد الطريقة التي تم إنشاؤها للتو ، وانقر فوق ابدأ لبدء الاختبار.
ملاحظة: يوضح الجدول الموجود في الأسفل القياسات الفعلية لحمل الذروة والإزاحة. - اضبط عدد الدورات على 60.
ملاحظة: تتضمن جلسة التحميل بأكملها 60 دورة ، والتي تستغرق حوالي 12 دقيقة. في المجموعة الضابطة ، خضعت الفئران للتحميل المسبق 5 N لمدة 12 دقيقة من التحميل المسبق في ظل نفس الظروف.
- في القائمة الرئيسية ، انقر فوق إنشاء طريقة جديدة | تسمية النظام . اضبط وضع الاختبار على دورة ، ونوع الاختبار على الضغط. انقر فوق ملصق المستشعر وحدد علامة التبويب اختبار للتحقق من أن الحد في حدود 60 نيوتن. بالإضافة إلى ذلك ، حدد علامة التبويب Stroke وتحقق من أن الحد في حدود 500 مم.
- بعد التحميل ، أعد الجرذ إلى قفصه وراقبه حتى الشفاء التام. الحفاظ على جدول 12-12 ساعة من الضوء والظلام في القفص مع مساحة كافية والطعام الإعلاني. بعد الفترات التجريبية المطلوبة ، التضحية الفئران بجرعة زائدة من خليط من عوامل التخدير الثلاثة التي يتم حقنها داخل الصفاق أو استنشاق ثاني أكسيد الكربون للتحليل (1 ساعة - 8 أسابيع).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الحصول على نتيجة تمثيلية للتغيرات قصيرة المدى (1 ساعة و 12 ساعة) في صلاحية الخلايا الغضروفية في العينات المعرضة لتحميل دوري 20 نيوتن. كما هو موضح في الشكل 3 ، زاد عدد الخلايا الغضروفية الميتة (مضان أحمر) في 12 ساعة بعد الصدمة. وعلى العكس من ذلك، استمر عدد الخلايا الغضروفية الحية (التألق الأخضر) في الانخفاض، حيث لا تحتوي بعض العينات على خلايا غضروفية حية في المنطقة المصابة.
أظهر علم الأنسجة أن الغضروف المفصلي لركبتي الفئران الذي خضع لتحميل ديناميكي 20 نيوتن قد تضرر ، وتم تأكيد منطقة آفة بؤرية واحدة في اللقمة الفخذية الجانبية في جميع العينات (الشكل 4). ومع ذلك ، لم يزداد حجم الآفة تدريجيا خلال فترة المراقبة التي استمرت 8 أسابيع. يمكن ملاحظة الحدود التي تتوافق مع واجهة الآفة والغضروف غير المتأثر في المنطقة المصابة.
الشكل 1: يتكون جهاز التثبيت من صفيحة أساسية وجهاز تثبيت. تحتوي لوحة القاعدة (الطول: 27.5 سم ، العرض: 13 سم) على أخدود مقعر من الراتنج (الطول: 0.8 سم ، العرض: 0.4 سم) على الجانب الخلفي لاستيعاب مفصل الركبة المرن للفئران. يحتوي جهاز التثبيت على أخدود على شكل إسفين (عرض الأخدود: 1.5 سم ، عمق الأخدود: 1 سم) يستوعب كعب الجرذ ، والذي يتداخل في الصفيحة بين قضيبين معدنيين. سيكون الجزء العلوي من جهاز التثبيت على اتصال مباشر بخلية الحمل الخاصة بأداة اختبار الإجهاد / الشد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: ملف تعريف التحميل لدورة واحدة من التحميل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: التقييم الزماني المكاني لصلاحية الخلايا الغضروفية في منطقة الآفة. بعد التضحية ، تم تشريح مفصل الركبة وفصله باستخدام ملقط صغير ومقص. تم تحضير محاليل بقع الكالسيين AM و EthD-1 عن طريق تخفيف المجموعة الأصلية (جدول المواد) عند 1: 500 و 1: 4000 في 5 مل من PBS ، على التوالي. تم تحضين العينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم غمر عينات التحكم في PBS في ظل نفس الظروف. تم الحصول على صور مضان باستخدام مجهر مضان (جدول المواد) باستخدام قنوات إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (495 نانومتر / 519 نانومتر) وبروبيديوم يوديد (535 نانومتر / 617 نانومتر). أظهرت الخلايا الغضروفية الحيوية مضان أخضر ، في حين أن الخلايا الميتة تتألق باللون الأحمر. بالمقارنة مع الخلايا الغضروفية في عينات التحكم (A) ، تم زيادة عدد الخلايا الغضروفية الميتة على ركبة الفئران المحملة عند 1 ساعة (B) واحتلت معظم المنطقة في المنطقة المصابة عند 12 ساعة (C). يمثل التألق الأخضر والأحمر مناطق الخلايا الغضروفية الحية والميتة ، على التوالي. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: كالسيين AM = كالسيين أسيتوكسي ميثيل استر ؛ EthD-1 = إيثيديوم هوموديمر -1 ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: السافرانين التمثيلي O تلطيخ اللقمة الفخذية في الركبة المحملة. شريحة تظهر الأجزاء السهمية من اللقمة الفخذية الجانبية ، والتي كانت ملطخة بمحلول سافرانين O / Fast Green ومحلول الهيماتوكسيلين. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، انخفضت كثافة تلطيخ السافرانين O في المنطقة المصابة بعد التحميل ، ولوحظ وجود حدود واضحة (سهم) للغضروف العلوي / المتكلس. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: w = أسبوع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لأول مرة ، يوضح البروتوكول الحالي كيفية إنشاء نموذج لآفة الغضروف الناجم عن التحميل على اللقمة الفخذية الجانبية في الفئران ، على غرار نموذج الضرر داخل المفصل في القوارض الأصغر مثل الفأر2. ومع ذلك ، تسبب بروتوكول التحميل في الفئران في تكوين عظمي شديد وآفات الرباط الصليبي ، والتي لم تكن مثالية لتقييم آثار الضغط الدوري. خلق البروتوكول الحالي آفة غضروف بؤري في الفئران مع قوة تحميل أقل بكثير. تعد إعدادات طريقة التحميل الصحيحة أمرا بالغ الأهمية للبروتوكول لأن الحجم المناسب والسرعة ومدة الإجهاد فقط هي التي يمكن أن تدمر الغضروف دون الإضرار بأنسجة العظام.
يعد تعيين حد الإزاحة (خطوة البروتوكول 1.3.1) أمرا بالغ الأهمية أيضا لأنه يوقف الأداة على الفور في حالة تمزق الرباط أو إذا استيقظ الجرذ من التخدير أثناء جلسة التحميل. لا يزال يتعين تحديد الحمل الأقصى الأمثل وعمر الفئران. ومع ذلك ، في التجارب الأولية ، أدى الحمل الذي يزيد عن 50 نيوتن إلى احتمال كبير لتمزق الرباط الصليبي الأمامي في ركبتي الفئران. علاوة على ذلك ، يصعب تكاثر النموذج الحالي في الفئران الأكبر سنا (> 36 أسبوعا) ، ربما بسبب تصلب الغضروف مع حدوث النمو.
على الرغم من عدم تحديد عتبة الحمل المدمر للفئران الأصغر سنا ، إلا أنه يعتقد أن الدراسات المستقبلية يجب أن تبقي الحمل الأقصى أقل من 20 نيوتن لمراقبة أي آثار ابتنائية على الغضروف. كان تحديد نطاق منطقة الآفة وموقعها سهلا نسبيا ، حتى بالنسبة لأولئك الجدد في الميدان ، كما هو مقدر من خلال حجم تنكس الخلايا الغضروفية في كل عينة ، والتي من المحتمل أن تركز على التقييم اللاحق للتدخل في منطقة غضروف ضيقة نسبيا.
أظهر التلوين النسيجي أن نطاق منطقة الآفة كان ثابتا نسبيا خلال فترة المراقبة التي استمرت 8 أسابيع. ومع ذلك ، تدهورت درجات مانكين بشكل مستمر بينما زادت درجات تلطيخ المصفوفة وتوزيع الخلايا في المنطقة المصابة. علاوة على ذلك ، كان هناك انحراف واضح في اللون بين الطبقة الوسطى والغضروف المتكلس ، مما يوضح أن الغضروف فوق علامة المد فقط هو الذي تأثر بالضغط بين المفصل.
على العكس من ذلك ، بصرف النظر عن الرجفان الخفيف في العينات النادرة ، ظلت سلامة الغضروف سليمة إلى حد كبير طوال فترة المراقبة بأكملها ، والتي تختلف عن نماذج إصابة هشاشة العظام التقدمية10. لذلك ، قد يكون النموذج غير الجراحي أفضل لتقييم الآفات البؤرية الناجمة عن تصادم واجهة الغضروف ، والتي تكون أكثر شيوعا في الإصابات الرياضية. في المستقبل ، سيتم استخدام النموذج الحالي لتقييم آثار الأدوية أو العلاج الطبيعي ، مثل العلاج بالحرارة والتمارين الهوائية المشتركة ، على تلف الغضروف الرضحي. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا التحقق من صحة ابتناء الخلايا الغضروفية والهدم استجابة للتحفيز الميكانيكي الدوري في الجسم الحي في الحيوانات باستخدام هذا النموذج.
وللبروتوكول الحالي عدة قيود. أولا ، تم فحص آفات الغضروف فقط على اللقمة الفخذية الجانبية. يجب أيضا تقييم الآفة على الساق الجانبية في الدراسات المستقبلية. ثانيا ، لم يكن الجزء المصاب من الغضروف المفصلي الذي تمت دراسته في البروتوكول الحالي هو المنطقة الرئيسية الحاملة للتحميل أثناء المشي. بسبب عدم تجانس الغضروف ، قد تختلف صلابة الغضروف داخل المفصل عن الجزء الذي تم فحصه في الدراسة الحالية. وبالتالي ، لا يمكن استخدام هذه النتائج إلا كمرجع. أخيرا ، لم يظهر النموذج أي تقدم كبير في تنكس الغضروف ، وهو سمة مهمة لتطوير الزراعة العضوية. يمكن أن تجمع الدراسات الإضافية بين الجراحة الغازية والآفات المحملة مسبقا لمراقبة التغيرات الزمانية المكانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منحة JSPS KAKENHI (الأرقام JP18H03129 و JP18K19739).
تلقى هذا البحث أيضا تمويلا من التحالف من أجل أبحاث وتدريب إعادة التأهيل التجديدي (AR3T) ، والذي يدعمه معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) ، والمعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية (NIBIB) التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة P2CHD086843. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
- De Souza, R. L., et al. Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element. Bone. 37 (6), 810-818 (2005).
- Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model. Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).
- Wu, P., et al. Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets. Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).
- Poulet, B., et al. Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).
- Ko, F. C., et al. Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading. Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).
- Adebayo, O. O., et al. Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).
- Ko, F. C., et al. In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae. Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).
- Ji, X., et al. Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Iijima, H., et al. Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model. Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).
