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Biochemistry

बड़े पैमाने पर मल्टी-ओमिक्स जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (एमओ-जीडब्ल्यूएएस): नमूना तैयारी और सामान्यीकरण के लिए दिशानिर्देश

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/62732
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Max-Planck-Institute of Molecular Plant Physiology, 2Center of Plant Systems Biology and Biotechnology

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम एक अनुकूलित वर्कफ़्लो पेश करते हैं, जो कई नमूनों की एक कुशल और तेज़ नमूना तैयारी को जोड़ती है। इसके अलावा, हम चयापचय जीडब्ल्यूएएस अध्ययनों के उच्च-थ्रूपुट मूल्यांकन के लिए विश्लेषणात्मक विविधताओं को कम करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं।

Abstract

गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) और तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) दोनों व्यापक रूप से सैकड़ों हजारों मेटाबोलाइट विशेषताओं का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए चयापचय दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है। हालांकि, बड़ी संख्या में नमूनों के लिए इन तकनीकों का अनुप्रयोग अधिक जटिल इंटरैक्शन के अधीन है, विशेष रूप से जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (जीडब्ल्यूएएस) के लिए। यह प्रोटोकॉल फलियां फसल प्रजातियों के लिए नमूनों की एक बड़ी संख्या के विश्लेषण के साथ एक कुशल और तेजी से नमूना तैयारी को जोड़ती है, जो एक अनुकूलित चयापचय वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। यह थोड़ा संशोधित निष्कर्षण विधि शुरू में पौधे और जानवरों के ऊतकों के विश्लेषण के लिए विकसित की गई थी और मिथाइल टर्ट-ब्यूटाइल ईथर में निष्कर्षण पर आधारित है: ध्रुवीय और लिपिड चयापचयों के कब्जे की अनुमति देने के लिए मेथनॉल विलायक। इसके अलावा, हम विश्लेषणात्मक विविधताओं को कम करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं, जो जीडब्ल्यूएएस में चयापचय विचरण के उच्च-थ्रूपुट मूल्यांकन के लिए आवश्यक हैं।

Introduction

बड़े पैमाने पर "ओमिक्स" दृष्टिकोण ने जटिल जैविक प्रणालियों 1,2,3 के विश्लेषण और जीनोटाइप और परिणामस्वरूप फेनोटाइप4 के बीच लिंक की आगे की समझ को सक्षम किया है। अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूएचपीएलसी-एमएस) और जीसी-एमएस का उपयोग करके मेटाबोलॉमिक्स ने मेटाबोलाइट सुविधाओं की अधिकता का पता लगाने में सक्षम बनाया, जिनमें से केवल कुछ को एक निश्चित डिग्री तक एनोटेट किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अज्ञात चयापचयों का उच्च अनुपात होता है। एक विविध आबादी के अंतर्निहित जीनोटाइपिक भिन्नता के साथ बड़े पैमाने पर चयापचयों के संयोजन से जटिल इंटरैक्शन का पता लगाया जा सकताहै 5. हालांकि, बड़े नमूना सेटों को संभालना स्वाभाविक रूप से विश्लेषणात्मक विविधताओं से जुड़ा हुआ है, आगे की डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के लिए चयापचय विचरण के मूल्यांकन को विकृत करता है। विशेष रूप से, विश्लेषणात्मक विविधताओं के लिए अग्रणी प्रमुख मुद्दे मशीन के प्रदर्शन और समय के साथ वाद्य बहाव पर आधारितहैं 6. बैच-टू-बैच भिन्नता का एकीकरण चुनौतीपूर्ण है और बड़े पैमाने पर संरचित पौधों की आबादी का विश्लेषण करते समय विशेष रूप से समस्याग्रस्त है। गैर-जैविक विविधताओं के लिए सही करने के लिए कई सामान्यीकरण प्रक्रियाओं का सुझाव दिया गया था, उदाहरण के लिए, विश्लेषणात्मक त्रुटियों के लिए सही करने के लिए आंतरिक, बाहरी और आइसोटोप-लेबल वाले आंतरिक मानकों का उपयोग, जिनमें से प्रत्येक स्वाभाविक रूप से ज्ञात समस्याओं और नुकसान 7,8,9,10 से जुड़ा हुआ है।

विश्लेषणात्मक भिन्नता के अलावा, निष्कर्षण प्रोटोकॉल की पसंद आम तौर पर विश्लेषणात्मक विधि के आधार पर भिन्न होती है। आखिरकार, यह सामग्री और श्रम लागत को कम करने के साथ-साथ चरण पृथक्करण-आधारित निष्कर्षण विधियों का प्रदर्शन करके विभिन्न विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के लिए एक ही नमूने के कई विभाज्य का उपयोग करने की आवश्यकता को कम करने के लिए वांछित है। इन विधियों को पहली बार क्लोरोफॉर्म का उपयोग करके पेश किया गया था: ध्रुवीय और हाइड्रोफोबिकयौगिकों को विभाजित करने के लिए मेथनॉल /

यह प्रोटोकॉल फलियां प्रजातियों में ध्रुवीय चयापचयों और लिपिड दोनों को प्रोफाइल करने के लिए एक बहु-ओमिक्स प्लेटफॉर्म के लिए एक तेज़ उच्च-थ्रूपुट पाइपलाइन का वर्णन करता है। इसके अलावा, यह दिखाता है कि जीडब्ल्यूएएस प्रदर्शन करके मेटाबोलाइट मात्रात्मक विशेषता लोकी (क्यूटीएल) का पता लगाने के लिए जीनोटाइपिक जानकारी को एकीकृत करने से पहले उन डेटासेट को विश्लेषणात्मक भिन्नता के लिए उचित रूप से कैसे ठीक किया जा सकता है और सामान्यीकृत किया जा सकता है।

Protocol

1. प्रायोगिक डिजाइन और पौधों की खेती

नोट: प्रयोगात्मक परिकल्पना के आधार पर प्रयोग स्थापित करें, उदाहरण के लिए, बड़े पैमाने पर जीडब्ल्यूएएस आबादी का उपयोग करने से कई प्रतिकृतियों की आवश्यकता कम हो जाती है, क्योंकि परिग्रहण के बजाय सभी व्यक्तिगत एसएनपी के हैप्लोटाइप के आधार पर सांख्यिकीय परीक्षण किया जाएगा। इसके विपरीत, अन्य प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों में कई प्रतिकृतियां अपरिहार्य हैं। प्रयोग तैयार करते समय निम्नलिखित बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए।

  1. प्रयोगात्मक परिकल्पना के आधार पर पर्याप्त जैविक प्रतिकृतियां शामिल करें।
  2. खेती के दौरान स्थानीय पर्यावरणीय पूर्वाग्रह को कम करने के लिए ब्लॉक-वार जैविक प्रतिकृतियों को यादृच्छिक करें, उदाहरण के लिए, ग्रीनहाउस, क्षेत्र।
  3. विकास के दौरान पौधे का उचित रखरखाव सुनिश्चित करें। पूर्वाग्रह को कम करने के लिए पौधों को सजातीय रूप से व्यवहार करें।

2. जैविक पौधे सामग्री की तैयारी

  1. फसल की तैयारी
    1. होमोजेनाइजिंग के लिए दो 5 मिमी और दो 8 मिमी व्यास धातु मोती युक्त लेबल कटाई ट्यूब (20 एमएल)। तरल नाइट्रोजन के साथ एक देवर भरें।
      नोट: पौधों को ताजा पत्ती और जड़ ऊतक कटाई के लिए वनस्पति चरण में होना चाहिए।
  2. तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीजिंग द्वारा हार्वेस्ट जैविक नमूने। लंबे समय तक कटाई की अवधि12,13 के दौरान चयापचय पर सर्कैडियन दोलन के प्रभाव को बाहर करने के लिए जितनी जल्दी हो सके हार्वेस्ट करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर आगे की प्रक्रिया के लिए कटाई ताजा पत्ती और जड़ ऊतकों को स्टोर करें।
    नोट: फ्लैश-फ्रीजिंग के लिए पत्ती काटने में कुछ सेकंड से अधिक समय नहीं लगना चाहिए क्योंकि पत्ती दरार के बाद, सक्रिय जैविक प्रक्रियाएं घायल होने के कारण चयापचय प्रोफाइल को बदल देंगी। जड़ों के लिए, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीजिंग से पहले पानी से धोकर जड़ों को प्रीक्लीन करें। जड़ की सतह पर अतिरिक्त पानी को कागज के ऊतकों के साथ भिगोया जाना चाहिए। सूखे बीज कमरे के तापमान पर संग्रहीत किए जा सकते हैं; तरल नाइट्रोजन में कोई ठंड की आवश्यकता नहीं है।
  3. एक ऊतक मिक्सर मिल का उपयोग करके ऊतक को पीस लें।
    1. ऊतक को पीसते समय कम तापमान बनाए रखने के लिए कुछ मिनटों के लिए तरल नाइट्रोजन में ट्यूब धारकों को प्रीकूल करें।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर ले जाने के बाद एक नाइट्रोजन युक्त देवर में जैविक नमूनों का परिवहन करें।
    3. सजातीय पाउडर प्राप्त करने के लिए ऊतकों को पीस लें; 1 मिनट के लिए 25 हर्ट्ज का उपयोग करें और तरल नाइट्रोजन में ठंड के बाद दोहराएं यदि ऊतक सजातीय रूप से जमीन नहीं है।
  4. सूखे बीजों को पीसने के लिए, बीज को 15 मिमी व्यास धातु मनका के साथ पीसने वाले जार में रखें। 2.3.3 में उल्लिखित समान आवृत्ति और समय का उपयोग करें।
    नोट: एक ऊतक मिक्सर मिल अनुपलब्ध है, तो साफ और प्रीकोल्ड मोर्टार और मूसल का उपयोग किया जा सकता है।
  5. प्रीकूल ने 2 एमएल सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को लेबल किया। विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग करके ताजा पौधे सामग्री के ±5 मिलीग्राम की त्रुटि के साथ 50 मिलीग्राम वजन करें। तरल नाइट्रोजन में पौधे सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण प्रीकूल। सुनिश्चित करें कि वजन प्रक्रिया के दौरान पौधे की सामग्री जमी हुई रहती है।
    नोट: कमरे के तापमान के लिए ताजा पौधे सामग्री को बहुत लंबे समय तक उजागर न करें क्योंकि जैविक प्रक्रियाएं तापमान में वृद्धि, चयापचय प्रोफाइल14 को बदलकर सक्रिय होती हैं।
  6. प्रत्येक नमूने के अनुपात को पूल करके और 50 मिलीग्राम वजन करके अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) नमूने उत्पन्न करें, जिसमें ±5 मिलीग्राम पूल किए गए ताजा पौधे सामग्री की त्रुटि के साथ प्रीकूल्ड 2 एमएल सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब।
    नोट: प्रत्येक 60 नमूनों के लिए कम से कम तीन क्यूसी नमूनों की सलाह दी जाती है। क्यूसी नमूने डाउनस्ट्रीम सुधार, सामान्यीकरण और विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं।

3. निष्कर्षण अभिकर्मकों

  1. ताजा ऊतक, जैसे, पत्तियां और जड़ें
    नोट: नमूना निष्कर्षण एक पहले वर्णित प्रोटोकॉल15 पर आधारित है। इस प्रोटोकॉल को वर्तमान आवश्यकताओं के आधार पर संशोधित किया गया है, उदाहरण के लिए, कई ऊतकों, विभिन्न आंतरिक मानकों और बड़े पैमाने पर प्रयोगों। इसके अतिरिक्त, नीचे उल्लिखित सभी वॉल्यूम और इंस्ट्रूमेंट सेटिंग्स को इन-हाउस विश्लेषणात्मक इकाइयों में समायोजित किया जाता है। प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को परीक्षण नमूनों के आधार पर अपनी विश्लेषणात्मक इकाई और जैविक नमूनों के अनुसार इन्हें समायोजित करना चाहिए।
    1. निष्कर्षण मिश्रण 1 (ईएम 1): मिथाइल टर्ट-ब्यूटाइल ईथर (एमटीबीई)/मेथनॉल (एमईओएच) (3: 1 वी /
      1. 3: 1 अनुपात में एमटीबीई / एमईओएच का मिश्रण तैयार करें। निष्कर्षण विलायक के 100 मिलीलीटर के लिए, एक साफ कांच की बोतल में एमईओएच के 25 एमएल के साथ एमटीबीई के 75 एमएल मिलाएं।
        नोट: सॉल्वैंट्स उचित सुरक्षा उपकरण के साथ धूआं हुड में सावधानी से संभाला जाना चाहिए।
      2. यूएचपीएलसी-एमएस आधारित लिपिड विश्लेषण के लिए आंतरिक मानक के रूप में 1,2-डाइहेप्टेडकैनोयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (क्लोरोफॉर्म में 1 मिलीग्राम / एमएल) के 45 μL, जीसी-एमएस आधारित विश्लेषण के लिए आंतरिक मानक के रूप में रिबिटोल के 400 μL (पानी में 1 मिलीग्राम / एमएल) और आइसोविटेक्सिन के 125 μL (1 मिलीग्राम /
        नोट: विश्लेषणात्मक आवश्यकताओं के अनुसार विश्लेषण के बाद सामान्यीकरण के लिए आंतरिक मानकों के अलावा आवश्यक है। चूंकि प्रत्येक नमूने के लिए ईएम 1 के 1 एमएल की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रयोगात्मक नमूना आकार के अनुसार एक स्टॉक समाधान तैयार करें, जिसका उपयोग पूरे प्रयोग के लिए किया जाना चाहिए। ईएम 1 को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। प्रयुक्त आंतरिक मानक की अनुपस्थिति और जांच की गई प्रजातियों में अन्य यौगिकों के साथ अतिव्यापी की जांच करें। कई मानकों का उपयोग किया जा सकता है; इस प्रोटोकॉल में आंतरिक मानकों का चयन आमसेम अर्क 16 का उपयोग कर पिछले परीक्षणों पर आधारित था।
    2. निष्कर्षण मिश्रण 2 (ईएम 2) पानी / मेथनॉल (एमईओएच) (3: 1 वी /
      1. 100 एमएल ईएम 2 के लिए, एक साफ कांच की बोतल में 75 मिलीलीटर डबल-डिस्टिल्ड वॉटर और 25 एमएल एमईओएच जोड़ें।
      2. नमूना प्रति ईएम 2 के 500 μL जोड़ें, और प्रयोगात्मक नमूना आकार है, जो पूरे प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए के अनुसार एक स्टॉक समाधान तैयार करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर ईएम 2 स्टोर करें।
  2. सूखे बीज
    1. निष्कर्षण मिश्रण 3 (ईएम 3) मेथनॉल (एमईओएच)/
      1. ईएम 3 के 100 एमएल के लिए, एक साफ कांच की बोतल में 70 एमएल एमईओएच और 30 एमएल डबल-डिस्टिल्ड पानी जोड़ें। प्रत्येक नमूने के लिए ईएम 3 के 1 एमएल तैयार करें।
      2. जीसी-एमएस-आधारित विश्लेषण के लिए आंतरिक मानकों के रूप में रिबिटोल के 400 μL (पानी में 1 मिलीग्राम / एमएल) और यूएचपीएलसी-एमएस-आधारित मेटाबोलाइट विश्लेषण के लिए आइसोविटेक्सिन के 125 μL (एमईओएच / पानी में 1 मिलीग्राम /
        नोट: प्रयोगात्मक नमूना आकार के अनुसार एक स्टॉक समाधान तैयार करें और पूरे प्रयोग के लिए इसका उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर ईएम 3 स्टोर करें।

4. नमूना निष्कर्षण

  1. ताजा ऊतक, जैसे, पत्तियां और जड़ें
    1. प्रत्येक नमूने के लिए तीन 1.5 एमएल सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब तैयार करें। ईएम 1 को -20 डिग्री सेल्सियस तरल शीतलन प्रणाली में रखें। परिवहन के लिए सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ताजा नमूने स्थानांतरण। बर्फ पर रखने से पहले संक्षेप में प्रत्येक 50 मिलीग्राम विभाज्य और भंवर में 1 मिलीलीटर प्रीकूल्ड ईएम 1 जोड़ें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर नमूने सेते हैं।
    3. 10 मिनट के लिए एक बर्फ ठंडा सोनिकेशन स्नान में नमूनों को सोनीकेट करें।
    4. जोड़ा मात्रा में भिन्नता से बचने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर EM2 के 500 μL जोड़ें।
    5. भंवर नमूने संक्षेप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 11,200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग से पहले निष्कर्षण मिश्रण मिश्रण.
    6. चरण पृथक्करण होने के बाद, ऊपरी लिपिड युक्त चरण के 500 μL को एक प्रीलेबल्ड 1.5 एमएल सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ऊपरी चरण के बाकी हिस्सों को हटा दें।
      नोट: इस ऊपरी चरण के रूप में स्थानांतरित करते समय ध्यान रखें एक उच्च वाष्प दबाव है और विंदुक से बाहर रिसाव करने के लिए जाता है।
    7. जीसी-एमएस और यूएचपीएलसी-एमएस विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले दो 1.5 एमएल सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में निचले ध्रुवीय और अर्ध-ध्रुवीय मेटाबोलाइट युक्त चरणों के 150 μL और 300 μL को स्थानांतरित करें।
    8. वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके सॉल्वैंट्स को हीटिंग के बिना वाष्पित करके सभी निकाले गए अंशों को ध्यान केंद्रित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. सूखे बीज
    1. प्रत्येक नमूने के लिए दो 1.5 एमएल सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब तैयार करें। बर्फ पर ईएम 3 रखें। नमूना विभाज्य में एक 5 मिमी व्यास धातु मनका रखें।
    2. प्रत्येक 50 मिलीग्राम विभाज्य में ईएम 3 के 1 एमएल जोड़ें और बर्फ पर डालने से पहले 2-3 मिनट के लिए 25 हर्ट्ज पर नमूनों को समरूप करें।
    3. 10 मिनट के लिए एक बर्फ ठंडा सोनिकेशन स्नान में नमूनों को सोनीकेट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 11,200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग से पहले संक्षेप में नमूने भंवर।
    5. जीसी-एमएस और यूएचपीएलसी-एमएस विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले दो 1.5 एमएल सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला के 150 μL और 300 μL स्थानांतरण करें।
    6. वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके सॉल्वैंट्स को हीटिंग के बिना वाष्पित करके सभी निकाले गए अंशों को केंद्रित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: अनुभव के आधार पर, उपयोगकर्ताओं को अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों के लिए चरण 4.2 करने और सूखे बीजों में व्युत्पन्न मेटाबोलाइट विश्लेषण करने की सलाह दी जाती है। सूखे बीज लिपिड विश्लेषण के लिए निष्कर्षण चरण 4.1 करें।

5. यूएचपीएलसी-एमएस का उपयोग करके लिपिड का विश्लेषण

  1. एसिटोनिट्राइल: 2-प्रोपेनोल (7: 3, वॉल्यूम / वॉल्यूम) के 250 μL में सूखे लिपिड अंशों को फिर से निलंबित करें।
  2. 5 मिनट के लिए लिपिड चरण को सोनीकेट करें, 1 मिनट के लिए 11,200 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  3. एलसी-एमएस के लिए एक कांच की शीशी के लिए सतह पर तैरनेवाला के 90 μL स्थानांतरण।
  4. एलसी-एमएस में अर्क के 2 μL इंजेक्ट करें।
  5. तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार एलुएंट ए और बी के क्रमिक परिवर्तनों के साथ 400 μL/मिनट के प्रवाह के साथ चल रहे 60 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित एक उलट-चरण सी8 कॉलम पर लिपिड विभाजन करें। जेड की द्रव्यमान सीमा के साथ सकारात्मक आयनीकरण मोड में द्रव्यमान स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।
  6. विश्लेषणात्मक भिन्नता के लिए सुधार सुनिश्चित करने के लिए सभी दैनिक बैचों और एक रिक्त में कई क्यूसी नमूने शामिल करें। अनुक्रमिक क्रम में ब्लॉक-वार नमूनों को यादृच्छिक करें।

6. यूएचपीएलसी-एमएस का उपयोग करके ध्रुवीय और अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों का विश्लेषण

  1. यूएचपीएलसी-ग्रेड मेथनॉल के 180 μL में सूखे ध्रुवीय चरण को फिर से निलंबित करें: पानी (1: 1 वी /
  2. 2 मिनट के लिए ध्रुवीय चरण को सोनीकेट करें, 1 मिनट के लिए 11,200 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  3. एलसी-एमएस के लिए एक कांच की शीशी के लिए सतह पर तैरनेवाला के 90 μL स्थानांतरण।
  4. एलसी-एमएस में अर्क के 3 μL इंजेक्ट करें।
  5. तालिका1 में दिखाए गए अनुसार एलुएंट ए और बी के क्रमिक परिवर्तनों के साथ 400 μL/मिनट के प्रवाह के साथ चल रहे 40 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित एक रिवर्स चरण सी 18 कॉलम पर मेटाबोलाइट विभाजन करें। जेड की द्रव्यमान सीमा में द्रव्यमान स्पेक्ट्रा प्राप्त करें एक पूर्ण एमएस स्कैन और 40 केवी के उच्च ऊर्जा टकराव पृथक्करण (एचसीडी) द्वारा प्रेरित सभी आयन विखंडन (एआईएफ)।
    नोट: दोनों आयनीकरण मोड का उपयोग करें। हालांकि, बड़ी संख्या में नमूने चलाते समय सीमित क्षमता के कारण, पसंदीदा आयनीकरण मोड निर्धारित करने के लिए दोनों आयनीकरण मोड में परीक्षण नमूने चलाएं।
  6. विश्लेषणात्मक भिन्नता के लिए सुधार सुनिश्चित करने के लिए सभी दैनिक बैचों और एक रिक्त में कई क्यूसी नमूने शामिल करें। अनुक्रमिक क्रम में ब्लॉक-वार नमूनों को यादृच्छिक करें।
  7. नकारात्मक और सकारात्मक आयनीकरण मोड दोनों में डेटा-निर्भर एमएस2 में एक पूल्ड क्यूसी चलाएं। एनोटेशन के लिए बाद के चरण (8.5) में प्राप्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रा का उपयोग करें।

7. जीसी-एमएस17,18 का उपयोग करके व्युत्पन्न चयापचयों का विश्लेषण

नोट: व्युत्पन्न चयापचयों का विश्लेषण पहले वर्णित प्रोटोकॉल17 पर आधारित है। धूआं हुड में सभी व्युत्पन्न अभिकर्मकों को संभालें। सुनिश्चित करें कि एन-मिथाइल-एन-(ट्राइमेथिलसिलिल) ट्राइफ्लोरासेटामाइड (एमएसटीएफए) पानी और आर्द्रता के संपर्क में नहीं आता है।

  1. व्युत्पन्न अभिकर्मक 1 (डीआर 1)
    1. एमएल डीआर 1 की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पाइरिडीन में मेथोक्सियामाइन हाइड्रोक्लोराइड को भंग करें। प्रत्येक नमूने के लिए DR1 के 40 μL का प्रयोग करें। नमूना आकार के अनुसार एक स्टॉक समाधान तैयार करें, और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. व्युत्पन्न अभिकर्मक 2 (डीआर 2)
    1. एमएसटीएफए के प्रति 1 एमएल फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (एफएएमई) के 20 μL के साथ एमएसटीएफए को भंग करें। प्रत्येक नमूने के लिए DR2 के 70 μL का प्रयोग करें। नमूना आकार के अनुसार एक स्टॉक समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एमएसटीएफए और -20 डिग्री सेल्सियस पर एफएएमई स्टोर करें।
      नोट: एफएएमई में मिथाइलकैप्रिलेट, मिथाइल पेलार्गोनेट, मिथाइलकैप्रेट, मिथाइललॉरेट, मिथाइलमाइरिस्टेट, मिथाइलपालिमिटेट, मिथाइलस्टीरेट, मिथाइलीकोसानोएट, मिथाइलडोकोसानोएट, लिग्नोसेरिक एसिड मिथाइल एस्टर, मिथाइलहेक्साकोसानोएट, मिथाइलोक्टाकोसानोएट और ट्रायकॉन्टानोइक एसिड मिथाइलेस्टर शामिल हैं।
  3. डाउनस्ट्रीम व्युत्पन्न के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉल्वैंट्स के साथ भंडारण के दौरान उत्पन्न एच2ओ के किसी भी हस्तक्षेप से बचने के लिए 30 मिनट के लिए वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके ध्रुवीय चरण (-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) से गोली को फिर से सुखाएं।
  4. DR1 के 40 μL जोड़ें।
  5. एक कक्षीय प्रकार के बरतन का उपयोग कर37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 950 × ग्राम पर नमूने हिला, तरल के एक छोटे स्पिन-डाउन के बाद।
  6. DR2 के 70 μL जोड़ें।
  7. कक्षीय प्रकार के बरतन का उपयोग कर37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 950 × ग्राम पर फिर से हिलाओ।
  8. जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए कांच की शीशियों में 90 μL स्थानांतरित करने से पहले कमरे के तापमान पर संक्षेप में अपकेंद्रित्र।
  9. मिनट के निरंतर हीलियम वाहक गैस प्रवाह के साथ मेटाबोलाइट सांद्रता के आधार पर जीसी-एमएस स्प्लिटलेस मोड में 1 μL इंजेक्ट करें। इंजेक्शन तापमान 30 मीटर एमडीएन -35 केशिका स्तंभ का उपयोग करके 230 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया है।
    नोट: अतिरिक्त जानकारी, उदाहरण के लिए, तापमान ढाल, तालिका 1 में पाया जा सकता है। द्रव्यमान सीमा 20 स्कैन / मिनट के साथ 70-600 मीटर / जेड पर सेट है। ऐसे मामलों में पुन: व्युत्पन्न निकालने के लिए लागत और समय की बचत, पुटेटिव ओवरलोडिंग यौगिकों की मात्रा का ठहराव सक्षम करने के लिए विभाजन मोड शामिल करें।
  10. विश्लेषणात्मक भिन्नता के लिए सुधार सुनिश्चित करने के लिए सभी दैनिक बैचों और एक रिक्त में कई क्यूसी नमूने शामिल करें। अनुक्रमिक क्रम में ब्लॉक-वार नमूनों को ठीक से यादृच्छिक करें।

8. क्रोमैटोग्राम प्रसंस्करण और यौगिक एनोटेशन

  1. तीव्रता थ्रेसहोल्ड को परिभाषित करके रासायनिक शोर को फ़िल्टर करें। क्रोमैटोग्राम को संसाधित करते समय सभी क्यूसी नमूने शामिल करें।
    नोट: बड़े पैमाने पर डेटा के लिए, कंप्यूटिंग समय और प्रसंस्करण शक्ति को कम करने के लिए शोर फ़िल्टरिंग महत्वपूर्ण है।
  2. अवधारण समय शिफ्ट विंडो को परिभाषित करके क्रोमैटोग्राम संरेखित करें। इंट्रा- और इंटर-बैच भिन्नता का आकलन करने के लिए प्रत्येक बैच से क्रोमैटोग्राम की जांच करें।
  3. चोटी के आकार के आधार पर चोटी का पता लगाने का प्रदर्शन करें, उदाहरण के लिए, आधा अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) गणना पर पूर्ण चौड़ाई के लिए ऊंचाई और चौड़ाई।
  4. अनावश्यक संकेतों को कम करने और सिंगलटन को फ़िल्टर करने के लिए क्लस्टर आइसोटोप।
    नोट: क्रोमैटोग्राम प्रसंस्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर पर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। विभिन्न स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर टूल, जैसे, एमएस-डायल, मेटलिग्न, एमजेडमाइन और एक्सकैलिबर 19,20,21 का उपयोग करके क्रोमैटोग्राम को संसाधित करने के तरीके पर गहन प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं।
  5. यौगिक एनोटेशन के लिए एक पूल किए गए क्यूसी नमूने के डीडीएमएस2 डेटा का उपयोग करें। मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान का निर्धारण करके और सामान्य तटस्थ नुकसान, ज्ञात चार्ज किए गए एग्लिकोन और विभिन्न प्रकार के दरारों का अवलोकन करके आणविक संरचना का आकलन करें, उदाहरण के लिए, होमोलिटिक या हेटरोलिटिक16,22।
  6. मेटाबोलाइट डेटा की रिपोर्टिंग के लिए, फर्नी एट अल में वर्णित सिफारिशका पालन करें।
    नोट: विभिन्न कम्प्यूटेशनल चयापचय दृष्टिकोण चयापचय डेटा24,25,26 का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

9. बड़े पैमाने पर चयापचय डेटासेट का सामान्यीकरण

  1. आंतरिक मानक (ओं) के वितरण की जांच करें और एकल या एकाधिक आंतरिक मानकों की प्रतिक्रिया के लिए सही करके सामान्यीकृत करें।
  2. चरण 2.5 से विभाज्य समरूप नमूना वजन द्वारा चोटी की तीव्रता को विभाजित करके सटीक नमूना वजन पर क्रोमैटोग्राम से प्राप्त चोटी की तीव्रता को सही करें।
  3. बहु-बैच श्रृंखला में तीव्रता बहाव के लिए सही। आर का उपयोग करके स्थानीय रूप से अनुमानित स्कैटरप्लॉट चौरसाई (एलओईएसएस) 27 जैसे क्यूसी-आधारित सुधार विधियां करें।
    नोट: कई उपकरण और संकुल पूरे बैचों28,29 के अधिग्रहण के दौरान एमएस प्रदर्शन के बहाव को संबोधित करने के लिए उपलब्ध हैं।
  4. डेटा परिवर्तन द्वारा लक्षणों का सामान्य वितरण सुनिश्चित करें, उदाहरण के लिए, जीडब्ल्यूएएस को पूरा करने के लिए आर पैकेज मास से बॉक्सकॉक्स () फ़ंक्शन का उपयोग करके बॉक्स-कॉक्स परिवर्तन30।
  5. कम प्रचुर मात्रा में यौगिकों के उचित वजन को सुनिश्चित करने के लिए बहुभिन्नरूपी विश्लेषण के लिए डेटा स्केलिंग, उदाहरण के लिए, पेरेटो स्केलिंग करें31.
    नोट: यदि संभव हो, तो मैट्रिक्स प्रभाव से बचने के लिए एक वसूली परख करें, उदाहरण के लिए, आयन दमन14.

10. जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (जीडब्ल्यूएएस)32

  1. अनुक्रमण डेटा33,34 से एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) या संरचनात्मक वेरिएंट (एसवी) को कॉल करें।
  2. टैसल35 का उपयोग करके कम आवृत्ति पूर्वाग्रह से बचने के लिए मामूली एलील आवृत्ति (एमएएफ) के लिए जीनोटाइपिक डेटा 5% और >10% की लापता दर <।
  3. आर पैकेज IME436 का उपयोग कर पर्यावरणीय कारकों (यादृच्छिक प्रभाव) से उत्पन्न पूर्वाग्रह को खत्म करने के लिए प्रयोगात्मक पुनरावृत्ति पर प्रत्येक सामान्यीकृत सुविधा के लिए सर्वोत्तम रैखिक निष्पक्ष भविष्यवाणियों (बीएलयूपी) की गणना करें।
  4. आर37 में आरएमवीपी पैकेज का उपयोग करके जीडब्ल्यूएएस करने के लिए व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक सुविधा के ब्लप का उपयोग करें।
    नोट: प्रत्येक चयापचय सुविधा को यहां एक व्यक्तिगत स्टैंड-अलोन फेनोटाइप के रूप में देखा जाता है।
  5. जीडब्ल्यूएएस का प्रदर्शन करते समय, प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) और राज्य द्वारा पहचान (आईबीएस) या वैनरेडन का उपयोग करके जनसंख्या संरचना के लिए सही भ्रामक प्रभावों को कम करने के लिए। इसके अलावा, मिश्रित रैखिक मॉडल (एमएलएम) या एक बहु-लोकस मिश्रित मॉडल (एमएलएमएम) का उपयोग करने पर विचार करें, क्योंकि मिश्रित मॉडल में निश्चित और यादृच्छिक प्रभाव होते हैं।

11. क्यूटीएल का पता लगाना

  1. अंतर्निहित आनुवंशिक क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए लिंकेज असंतुलन (एलडी) गणना के लिए मैनहट्टन भूखंडों को ध्यान में रखते हुए, महत्वपूर्ण सहयोग दिखाने वाले एसएनपी की जांच करें। आर पैकेज एलडी हीटमैप या टैसल 5 का उपयोग करके एलडी गणना करें।
  2. संभावित कारण एसएनपी को खोजने के लिए हैप्लोटाइप के बीच सांख्यिकीय परिवर्तनों के लिए विशेषता स्तरों की जांच करके विशेषता पर प्रभाव आकार के लिए संबंधित एसएनपी की जांच करें, उदाहरण के लिए, एसएनपी प्रोटीन-कोडिंग अनुक्रम में एमिनो एसिड परिवर्तन के लिए अग्रणी है, जो फेनोटाइपिक भिन्नता की व्याख्या कर सकता है।
    नोट: चूंकि एसएनपी-विशेषता संघ जरूरी कारण संघ का उत्पादन नहीं करते हैं, इसलिए जीनोमिक क्षेत्र को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। फीचर एनोटेशन द्वारा यौगिक पहचान एक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र में सही उम्मीदवार जीन खोजने में काफी मदद कर सकती है। हम आनुवंशिक क्षेत्रों38 को रेखांकित करने के लिए प्लियोट्रोपिक मानचित्र में कुछ यौगिकों से जुड़े सभी पता लगाए गए क्यूटीएल को संयोजित करने का सुझाव देते हैं, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है। उम्मीदवार जीन के सत्यापन के लिए, कई दृष्टिकोण किए जा सकते हैं (चर्चा देखें)।

Representative Results

सफल चयापचय जीडब्ल्यूएएस प्रयोगों को एक उचित प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ शुरू करना चाहिए, इसके बाद नमूना संग्रह, निष्कर्षण, डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण, जैसा कि चित्रा 1 में सचित्र है। इस प्रोटोकॉल में, एमटीबीई विधि15 का उपयोग कई यौगिक वर्गों से संबंधित सैकड़ों चयापचयों को निकालने और विश्लेषण करने के लिए किया गया था। क्रोमैटोग्राफी उपयोग किए गए कॉलम के गुणों के साथ-साथ क्षालन बफर मिश्रण पर अत्यधिक निर्भर करती है। चित्रा 2 क्यूसी नमूनों के क्रोमैटोग्राम दिखाता है, जो इस विश्लेषणात्मक प्रणाली में कुछ प्रमुख लिपिड वर्गों के क्षालन पैटर्न को दर्शाता है। प्रत्येक प्लेटफ़ॉर्म के लिए लागू ग्रेडिएंट तालिका 1 में दिए गए हैं। बड़े पैमाने पर प्रयोगों में प्रणालीगत त्रुटियों को संभालने पर मजबूत जोर दिया गया था। बड़े पैमाने पर चयापचय करना स्वाभाविक रूप से प्रणालीगत त्रुटियों से जुड़ा हुआ है। प्रदर्शन के लिए, हमने कई सामान्य बीन प्रजातियों में लिपिडोमिक डेटा का विश्लेषण किया। पूरक तालिका 1 सामग्री की तालिका में इंगित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके क्रोमैटोग्राम प्रसंस्करण के बाद प्राप्त निकाले गए कच्चे लिपिडोमिक डेटा प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल के बाद हमें ओमिक्स डेटा से निपटने में प्रमुख मुद्दों को दरकिनार करने में सक्षम बनाया गया, खासकर बड़े नमूना सेट को संभालते समय। सामान्यीकरण प्रक्रिया बैच-वार विश्लेषणात्मक त्रुटियों के सटीक सुधार में पैदावार देती है, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। यद्यपि क्यूसी नमूनों की संख्या में वृद्धि से सामान्यीकरण की शक्ति में वृद्धि होगी, यह लागत और समय की कमी के कारण हमेशा संभव नहीं होता है। गैर-लक्षित चयापचय सुविधाओं के साथ उच्च-थ्रूपुट चयापचय जीडब्ल्यूएएस के लिए, विशेषता-मार्कर एसोसिएशन की उच्च संख्या को उचित रूप से चित्रित करना आवश्यक है। कई जीडब्ल्यूएएस परिणामों के संयोजन वाला एक प्लियोट्रोपिक मानचित्र38 का उपयोग जीनोमिक क्षेत्रों को उजागर करने के लिए किया जा सकता है जिनसे कई लक्षण जुड़े हुए हैं (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्रा 1: पौधों में चयापचय-आधारित जीडब्ल्यूएएस का फ्लोचार्ट। प्रायोगिक डिजाइन से लेकर क्यूटीएल का पता लगाने तक कई कदम बाएं पैनल में दिखाए गए हैं। दाएं पैनल में, बाएं पैनल में उल्लिखित कई चरणों का समर्थन करने के लिए कई आंकड़े दिखाए गए हैं। दाएं शीर्ष से शुरू होकर, (1) नमूनों का एक सुझाया गया अनुक्रम एलसी-एमएस के लिए दिखाया गया है, (2) पीसीए के पूर्व और बाद के सामान्यीकृत स्कोर भूखंडों, जिसमें एक प्रतिनिधि सुविधा वितरण पूर्व और बाद में प्रसंस्करण शामिल है, लाल संकेत क्यूसी नमूना तीव्रता के साथ, और (3) महत्वपूर्ण संघों के साथ एक मैनहट्टन प्लॉट जिसमें एलडी और हैप्लोटाइप वितरण उत्पन्न किए गए थे। संक्षिप्त नाम: जीडब्ल्यूएएस = जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन; क्यूटीएल = मात्रात्मक विशेषता लोकी; पीसीए = प्रमुख घटक विश्लेषण; क्यूसी = गुणवत्ता नियंत्रण; एलडी = लिंकेज असंतुलन; एमएस = मास स्पेक्ट्रोमेट्री; एलसी-एमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री; जीसी-एमएस = गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री; एलओईएसएस = स्थानीय रूप से अनुमानित स्कैटरप्लॉट चौरसाई; एमएलएमएम = मिश्रित रैखिक मॉडल/बहु-स्थान मिश्रित-मॉडल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: क्रोमैटोग्राम प्रसंस्करण। विभिन्न बैचों से दो क्यूसी क्रोमैटोग्राम (बेस पीक; लिपिड डेटा) पूल किए गए क्यूसी नमूनों में कुछ लिपिड वर्गों के लिए बैच-वार भिन्नता प्रदर्शित करते हैं। इन-हाउस एलसी-एमएस सिस्टम में उनके संबंधित क्षालन खिड़कियों के साथ चार प्रमुख लिपिड वर्गों को इंगित किया जाता है। क्रोमैटोग्राम को एमजेडमाइन21 से निर्यात किया गया था। संक्षिप्त नाम: क्यूसी = गुणवत्ता नियंत्रण; एलसी-एमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: व्यवस्थित त्रुटि का सुधार। अधिग्रहित लिपिडोमिक डेटा का प्रमुख घटक विश्लेषण, प्रणालीगत त्रुटियों (दाएं, बैच लोएस) के लिए पूर्व- (बाएं, कच्चे डेटा) और सुधार के बाद। निचले पैनल विश्लेषणात्मक भिन्नता के लिए नमूनों (एन = 650) और बैचों (एन = 10) पूर्व- (बाएं) और पोस्ट (दाएं) -सुधार पर सुविधा (Cluster_00005) वितरण का वर्णन करते हैं। संक्षिप्त नाम: पीसीए = प्रमुख घटक विश्लेषण; क्यूसी = गुणवत्ता नियंत्रण; एलओईएसएस = स्थानीय रूप से अनुमानित स्कैटरप्लॉट चौरसाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: संयुक्त जीडब्ल्यूएएस परिणामों को दर्शाते हुए प्लियोट्रोपिक मानचित्र। प्लियोट्रोपिक मानचित्र पूरे जीनोम में उन क्षेत्रों पर प्रकाश डालता है जो कई लक्षणों से जुड़े होते हैं। बाहरी छल्ले पर संख्याएं संबंधित गुणसूत्रों को इंगित करती हैं। प्रत्येक सर्कल अपने महत्वपूर्ण रूप से जुड़े एसएनपी के साथ एक व्यक्तिगत विशेषता का प्रतिनिधित्व करता है। रंग विभिन्न यौगिक वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं (ग्रे = यौगिक वर्ग 1; हरा = यौगिक वर्ग 2; बैंगनी = यौगिक वर्ग 3; पीला = यौगिक वर्ग 4)। एक ही जीनोमिक क्षेत्र के साथ अंतर-यौगिक वर्ग संघों के मामले में, जीन पर प्रकाश डाला जाता है। आंतरिक ग्रे सर्कल एक विशिष्ट जीनोमिक स्थिति से जुड़े सभी महत्वपूर्ण एसएनपी के योग को दर्शाता है। इस आकृति में दिखाए गए संघ केवल चित्रण के लिए कृत्रिम रूप से उत्पन्न होते हैं। संक्षिप्त नाम: जीडब्ल्यूएएस = जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन; एसएनपी = एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लिपिड के लिए यूएचपीएलसी-एमएस सेटिंग्स
समय [न्यूनतम] एलुएंट ए से बी [%]* सूचना
0 - 1.00 45% A एलुएंट ए: 1% 1 एम एनएच4-एसीटेट, पानी में 0.1% एसिटिक एसिड (यूएचपीएलसी ग्रेड)
1.00 - 4.00 एलजी 45% - 25% ए एलुएंट बी: 1% 1 एम एनएच4-एसीटेट, एसिटोनिट्राइल / 2-प्रोपेनॉल 7: 3 (यूएचपीएलसी ग्रेड) में 0.1% एसिटिक एसिड
4.00 - 12.00 एलजी 25% - 11% ए प्रवाह दर: 400 μL /
12.00 - 15.00 एलजी 11% - 0% ए इंजेक्शन की मात्रा: 2 μL
15.00 - 19.50 सीडब्ल्यू 0% ए
19.50-19.51 0% - 45% A
19.51-24.00 45%
ध्रुवीय और अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों के लिए यूएचपीएलसी-एमएस /
समय [न्यूनतम] एलुएंट ए और बी [%]* सूचना
0 - 1.00 99% ए एलुएंट ए: पानी में 0.1% फॉर्मिक एसिड (यूएचपीएलसी ग्रेड)
1.00 - 11.00 एलजी 99% -60% ए एलुएंट बी: एसिटोनिट्राइल (यूएचपीएलसी ग्रेड) में 0.1% फॉर्मिक एसिड
11.00 - 13.00 एलजी 60% - 30% ए प्रवाह दर: 400 μL /
13.00 - 15.00 एलजी 30% - 1% ए इंजेक्शन की मात्रा: 3 μL
15.00 - 16.00 सीडब्ल्यू 1% ए
16.00 - 17.00 एलजी 1% - 99% ए
17.00 - 20.00 समीकरण 99% A
व्युत्पन्न चयापचयों के लिए जीसी-एमएस सेटिंग्स
समय [न्यूनतम] तापमान [डिग्री सेल्सियस] सूचना
0 - 2.00 85 वाहक गैस: हीलियम
2.00 - 18.66 एलजी 80 - 330 प्रवाह दर: 2 एमएल /
18.66 - 24.66 सीडब्ल्यू 330 तापमान ढाल: 15 डिग्री सेल्सियस /
24.66 तेजी से ठंडा करना इंजेक्शन की मात्रा: 1 μL

तालिका 1: विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों में से प्रत्येक के लिए ढाल सेटिंग्स7. संक्षिप्त नाम: एलजी = रैखिक ढाल; सीडब्ल्यू = कॉलम धोने; समीकरण = संतुलन; यूएचपीएलसी-एमएस = अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री; एमएस = अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री; जीसी-एमएस = गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री। * = प्रतिशत मूल्य एलुएंट ए से मेल खाता है; शेष प्रतिशत मान एलुएंट बी से मेल खाता है।

पूरक तालिका 1: कच्चे लिपिडोमिक्स डेटा। प्रत्येक नमूने पर पता लगाए गए समूहों में से प्रत्येक के लिए चोटी की तीव्रता को इंगित करता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

जीसी-एमएस और एलसी-एमएस दोनों विभिन्न मेटाबोलाइट वर्गों के जटिल मिश्रण की रूपरेखा तैयार करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं। इन उपकरणों के साथ बड़े डेटासेट को संभालना स्वाभाविक रूप से एक गैर-जैविक भिन्नता से जुड़ा हुआ है, उदाहरण के लिए, विश्लेषणात्मक भिन्नता, जो परिणामों की व्याख्या में हस्तक्षेप और पूर्वाग्रह करती है। यह प्रोटोकॉल गैर-जैविक मूल की भिन्नता को खत्म करने और बड़े पैमाने पर "ओमिक्स" अध्ययन करने के लिए व्यापक चयापचय प्रोफाइलिंग के लिए एक मजबूत और उच्च-थ्रूपुट निष्कर्षण पाइपलाइन प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त मात्रा और सांद्रता विभिन्न ऊतकों में फलियां प्रजातियों के लिए समायोजित किए गए थे। हालांकि, इन मापदंडों को थोड़ा संशोधित किया जा सकता है और अन्य पौधों की प्रजातियों से बड़े पैमाने पर चयापचय नमूनों के लिए भी उपयोग किया जा सकता है।

पहलेवर्णित 15 एमटीबीई-आधारित निष्कर्षण का उपयोग व्युत्पन्न चयापचयों, अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों और लिपिड का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटीन और संयंत्र हार्मोन निष्कर्षण39, जो इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर थे के लिए विस्तारित किया जा सकता है। अन्य निष्कर्षण प्रोटोकॉल डाइक्लोरोमेथेन पर भरोसा करते हैं: इथेनॉल मिश्रण40,41। इन निष्कर्षण प्रोटोकॉल में से, एमटीबीई: मेथनॉल निष्कर्षण प्रोटोकॉल मौजूदा क्लोरोफॉर्म-आधारित निष्कर्षण प्रोटोकॉल42 के लिए एक अनुकूल और कम खतरनाक विकल्प प्रदान करता है और ध्रुवीय और लिपिड चरणों के बीच एक इंटरफ़ेज़ के रूप में प्रोटीन गोली में परिणाम नहीं देता है। इसके अलावा, एमटीबीई विधियों का उपयोग पहले से ही विभिन्न जैविक नमूनों43,44,45 के लिए कई अध्ययनों में किया गया है।

यह प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा करता है जो बड़ी संख्या में नमूनों को संभालते समय संभावित भिन्नता का कारण बन सकते हैं, उदाहरण के लिए,कटाई 12,13, निष्कर्षण14, साथ ही यादृच्छिकीकरण46 के दौरान। इसके अलावा, ऐसे अतिरिक्त मुद्दे हैं जिन पर इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं की गई है जिन्हें उच्च गुणवत्ता वाले चयापचय डेटा को सुनिश्चित करने के लिए विचार किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स प्रभाव और आयन दमन14.

क्यूसी-आधारित सामान्यीकरण विधियों की शक्ति स्वाभाविक रूप से प्रत्येक बैच में क्यूसी नमूनों की संख्या पर निर्भर करती है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, हालांकि संख्या में वृद्धि से शक्ति में वृद्धि होगी, क्यूसी की इंट्रा-बैच भिन्नता इन विश्लेषणात्मक प्रणालियों में अंतर-बैच भिन्नता की तुलना में अपेक्षाकृत मामूली है, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। कुल मिलाकर, अन्य क्यूसी-आधारित सामान्यीकरण विधियां हैं, जैसे कि यादृच्छिक वन (एसईआरआरएफ) का उपयोग करके प्रणालीगत त्रुटि हटाने, जिन्हें बैच-वार-अनुपात, कई आंतरिक मानकों (एनओएमआईएस) के इष्टतम चयन का उपयोग करके सामान्यीकरण, और संभाव्य भागफल सामान्यीकरण (पीक्यूएन) 47 जैसे अधिकांश अन्य सामान्यीकरण विधियों को मात देने के लिए दिखाया गया है। . हालांकि, एसईआरआरएफ प्रत्येक बैच में कई क्यूसी नमूनों पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, प्रत्येक दसवें नमूने, जो बड़ी संख्या में नमूनों को संभालते समय संभव नहीं है। अन्य डेटा-चालित या आंतरिक मानक-आधारित विधियों पर क्यूसी-आधारित सामान्यीकरण का मुख्य लाभ यह है कि यह अवांछित तकनीकी भिन्नता को समायोजित करते हुए आवश्यक जैविक भिन्नता को बरकरार रखताहै। पाठक भिन्नता28 की हैंडलिंग पर इस समीक्षा का उल्लेख कर सकते हैं।

जीडब्ल्यूएएस में एक मुख्य मुद्दा झूठी सकारात्मकता की दर है, जो ज्यादातर कारण और गैर-कारण साइटों48,49 के लिंकेज के कारण उत्पन्न होती है। दूसरा, रूढ़िवादी सांख्यिकीय सुधार दृष्टिकोण, उदाहरण के लिए, बोनफेरोनी और एफडीआर, स्वतंत्र परीक्षणों की संख्या के लिए सही है, जो समीपस्थ एसएनपी50,51 के बीच संबंध के कारण जीडब्ल्यूएएस में परख एसएनपी की संख्या के बराबर नहीं है इसलिए, स्वतंत्र परीक्षणों की वास्तविक संख्या अक्सर कम होती है। रूढ़िवादी सांख्यिकीय सीमा को कम करने का एक और तरीका परिभाषित जीनोमिक क्षेत्रों52 पर लिंकेज क्षय के आधार पर जीडब्ल्यूएएस के लिए उपयोग किए जाने वाले परीक्षण किए गए एसएनपी की संख्या को कम करना होगा। इस प्रोटोकॉल में वर्णित जीडब्ल्यूएएस-एकीकृत उच्च-थ्रूपुट मेटाबोलॉमिक्स प्लेटफॉर्म में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। विशेष रूप से, यह औद्योगिक और पौष्टिक रूप से वांछित स्तरों के लिए मेटाबोलाइट / लिपिड संरचना को बदलकर फसल प्रजनन में सुधार की सुविधा प्रदान करेगा। कुल मिलाकर, चयापचय ने पिछले दशकों में फसल पालतू बनाने के दौरान हुए चयापचयों और चयापचय विविधीकरण की अधिकता की आनुवंशिक वास्तुकला में गहराई से अंतर्दृष्टि प्रदान की है, जो चयापचय से जुड़े प्रजनन53 की विशाल क्षमता को दर्शाता है। डाउनस्ट्रीम क्यूटीएल सत्यापन के लिए आणविक जैविक दृष्टिकोण में सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 उत्परिवर्ती लाइनों54, टी-डीएनए सम्मिलन लाइनों55, स्थिर और / या क्षणिक ओवरएक्सप्रेशन लाइनों56, वीआईजीएस, पूर्व विवो मेटाबोलॉमिक्स दृष्टिकोण57 की पीढ़ी शामिल है क्रॉस एफ 2 आबादी उत्पन्न करने के साथ-साथ विभिन्न आबादी में क्रॉस सत्यापन।

ऊपर वर्णित विश्लेषणात्मक विविधताओं के लिए आवश्यक सुधार करके, जीडब्ल्यूएएस के अलावा कई एकीकृत दृष्टिकोण किए जा सकतेहैं, जैसे कि मेटाबोलाइट-मेटाबोलाइट, मेटाबोलाइट-लिपिड सहसंबंध विश्लेषण, अधिक जटिल लक्षणों पर प्रकाश डालने के लिए फेनोमिक डेटा के लिए सहसंबंध विश्लेषण, और /

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एमबी आईएमपीआरएस-पीएमपीजी 'प्राथमिक चयापचय और पौधे विकास' द्वारा समर्थित है। एआरएफ और एसए यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम, परियोजना प्लांटासिस्ट (एफपीए संख्या 664620 के तहत एसजीए-सीएसए नंबर 739582), और परियोजना वृद्धि (जीए 862862) की वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and standards
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (17:0 PC) Avanti Polar Lipids 850360P Internal standard for lipids
Chloroform Supleco 67-66-3 FAME solvent
Isovitexin Sigma Aldrich 38953-85-4 Internal standard for metabolites
Lignoceric Acid Methylester Sigma Aldrich 2442-49-1 FAME
Methanol (MeOH) Biosolve Chemicals 13684102 ULC-MS grade
Methoxyamin -hydrochlorid Sigma Aldrich 593-56-6 Metabolite deriviatization
Methyl laurate Sigma Aldrich 111-82-0 FAME
Methyl myristate Sigma Aldrich 124-10-7 FAME
Methyl palmitate Sigma Aldrich 112-39-0 FAME
Methyl stearate Sigma Aldrich 112-61-8 FAME
Methyl tert-butyl ether (MTBE) Biosolve Chemicals 13890602 HPLC grade
Methyl-caprat Sigma Aldrich 110-42-9 FAME
Methylcaprylat Sigma Aldrich 111-11-5 FAME
Methyldocosanoat Sigma Aldrich 929-77-1 FAME
Methyleicosanoat Sigma Aldrich 1120-28-1 FAME
Methyl-hexacosanoat Sigma Aldrich 5802-82-4 FAME
Methyl-octacosanoat Sigma Aldrich 55682-92-3 FAME
Methyl-pelargonate Sigma Aldrich 1731-84-6 FAME
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA) Macherey-Nagel 24589-78-4 Metabolite deriviatization
Pyridine Supleco 110-86-1 Metabolite deriviatization
Ribitol Supleco 22566-17-2 Internal standard for derivatized metabolites
Triacontanoic Acid Methyl Ester TCI Chemicals 629-83-4 FAME
Water Biosolve Chemicals 23214102 ULC-MS grade
Equipment
1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 3120086
2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 3120094
Balance Sartorius Corporation 14 557 572
DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 µm Aglient 123-3832 Analysis of derivatized metabolites
GC-MS system Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation) Analysis of derivatized metabolites
Grinding Balls, Stainless Steel OPS DIAGNOSTICS GBSS 196-2500-10
MS system Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific) Analysis of lipids
MS system Q Exactive Focus (Q Exactive™ Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap™
Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)		 Analysis of metabolites
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf, model 5427R 22620701
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column
(100 mm × 2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles)		 Waters 186002878 Analysis of lipids
RP High Strength Silica (HSS) T3 column
(100 mm × 2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles)		 Waters 186003539 Analysis of metabolites
Shaker Eppendorf Thermomixer 5436 2050-100-05
Sonicator USC 300 TH 142-0084
Tissue grinding mixer mill Retsch, Mixer Mill MM 300 20.746.0001
UPLC system Waters Acquity UPLC system (Waters)
Vacuum concentrator Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators 7.008.500.002
Vortex mixer Vortex-Genie 2, Model G560 SI-0236
Software
MetAlign Chromatogram processing
MzMine Chromatogram processing
R package "data.table"
R package "fujiplot" pleiotrpoic map
R package "genetics"
R package "Ime4" BLUPs calculation
R package "LDheatmap" LD plots
R package "MASS" transformation
R package "rMVP" GWAS
R version 4.0.4
RefinerMS Chromatogram processing
RefinerMS Genedata Expressionist Chromatogram processing
Tassel 5 Genotype filtering
Xcalibur Thermo Fisher Scientific OPTON-30965 Chromatogram processing

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References

  1. Doerr, A. Global metabolomics. Nature Methods. 14 (1), 32 (2017).
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जैव रसायन अंक 173
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Bulut, M., Fernie, A. R., Alseekh, S. Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization. J. Vis. Exp. (173), e62732, doi:10.3791/62732 (2021).

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