Summary
A preparação isolada do pulmão do coelho é uma ferramenta padrão-ouro na pesquisa pulmonar. Esta publicação tem como objetivo descrever a técnica desenvolvida para o estudo de mecanismos fisiológicos e patológicos envolvidos na reatividade das vias aéreas, preservação pulmonar e pesquisa pré-plínica em transplante de pulmão e edema pulmonar.
Abstract
O sistema isolado de perfusão pulmonar tem sido amplamente utilizado em pesquisas pulmonares, contribuindo para elucidar o funcionamento interno dos pulmões, tanto micro quanto macroscopicamente. Esta técnica é útil na caracterização da fisiologia pulmonar e patologia medindo atividades metabólicas e funções respiratórias, incluindo interações entre substâncias circulatórias e os efeitos de substâncias inaladas ou perfumadas, como no teste de drogas. Enquanto os métodos in vitro envolvem o corte e a colheita de tecidos, o sistema isolado de perfusão pulmonar ex vivo permite trabalhar com um órgão funcional completo possibilitando o estudo de uma função fisiológica contínua ao mesmo tempo em que recria ventilação e perfusão. No entanto, deve-se notar que os efeitos da ausência de inervação central e drenagem linfática ainda devem ser totalmente avaliados. Este protocolo tem como objetivo descrever a montagem do aparelho pulmonar isolado, seguido da extração cirúrgica e cannulação de pulmões e coração de animais de laboratório experimentais, bem como exibir a técnica de perfusão e processamento de sinais dos dados. A viabilidade média do pulmão isolado varia entre 5-8 h; durante esse período, a permeabilidade capilar pulmonar aumenta, causando edema e lesão pulmonar. A funcionalidade do tecido pulmonar preservado é medida pelo coeficiente de filtragem capilar (Kfc), usado para determinar a extensão do edema pulmonar ao longo do tempo.
Introduction
Brodie e Dixon descreveram pela primeira vez o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo em 1903 1. Desde então, tornou-se uma ferramenta padrão-ouro para estudar a fisiologia, farmacologia, toxicologia e bioquímica dos pulmões2,3. A técnica oferece uma forma consistente e reprodutível de avaliar a viabilidade dos transplantes de pulmão, e determinar o efeito de mediadores inflamatórios como histamina, metabólitos ácido aracidônico e substância P, entre outros, bem como suas interações durante fenômenos pulmonares como broncoconstrição, atelectasia e edema pulmonar. O sistema pulmonar isolado tem sido uma técnica fundamental para desvendar o importante papel dos pulmões na eliminação de aminas biogênicas de circulação geral4,5. Além disso, o sistema tem sido utilizado para avaliar a bioquímica do surfactante pulmonar6. Nas últimas décadas, o sistema de perfusão de pulmão ex-vivo tornou-se uma plataforma ideal para pesquisas de transplante de pulmão7. Em 2001, uma equipe liderada por Stig Steen descreveu a primeira aplicação clínica do sistema de perfusão pulmonar ex-vivo, usando-o para recondicionar os pulmões de um doador de 19 anos, que foi inicialmente rejeitado pelos centros de transplante devido às suas lesões. O pulmão esquerdo foi colhido e perfundido por 65 min; depois, foi transplantado com sucesso em um homem de 70 anos com DPOC8. Outras pesquisas sobre o recondicionamento pulmonar usando a perfusão ex-vivo levaram ao desenvolvimento da técnica de Toronto para perfusão pulmonar prolongada para avaliar e tratar os pulmões doados feridos9,10. Clinicamente, o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo tem se mostrado uma estratégia segura para aumentar as piscinas de doadores, tratando e recondicionando pulmões doadores abaixo do padrão, não apresentando diferença significativa de riscos ou desfechos em relação aos doadores de critérios padrão10.
A principal vantagem do sistema isolado de perfusão pulmonar é que os parâmetros experimentais podem ser avaliados em um órgão funcional completo que preserva sua função fisiológica sob uma configuração artificial de laboratório. Além disso, permite medir e manipular a ventilação mecânica pulmonar para analisar os componentes da fisiologia pulmonar, como resistência às vias aéreas, resistência vascular total, troca de gás e formação de edema, que até o momento não podem ser medidos precisamente em animais de laboratório2. Notavelmente, a composição da solução com a qual o pulmão é perfusado pode ser totalmente controlada, permitindo a adição de substâncias para avaliar seus efeitos em tempo real e coleta amostral de perfusão para posterior estudo11. Os pesquisadores que trabalham com o sistema pulmonar isolado devem ter em mente que a ventilação mecânica causa decomposição do tecido pulmonar encurtando seu tempo útil. Esta queda progressiva nos parâmetros mecânicos pode ser significativamente retardada por hiperinflar os pulmões ocasionalmente durante o tempo do experimento4. Ainda assim, a preparação geralmente não pode durar mais de oito horas. Outra consideração para o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo é a ausência de regulação nervosa central e drenagem linfática. Os efeitos de sua ausência ainda não são totalmente compreendidos e poderiam potencialmente ser uma fonte de viés em certos experimentos.
A técnica isolada do sistema de perfusão pulmonar pode ser realizada no modelo coelho com alto grau de consistência e reprodutibilidade. Este trabalho descreve os procedimentos técnicos e cirúrgicos para a implementação da técnica de perfusão pulmonar isolada ex-vivo , desenvolvida para o modelo coelho no Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, na Cidade do México, com a intenção de compartilhar os insights e fornecer um guia claro sobre os passos-chave na aplicação desse modelo experimental.
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Protocol
O sistema isolado de perfusão no modelo coelho tem sido amplamente utilizado no Laboratório de Hiperresponsividade Brônquica no Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. O protocolo inclui coelhos neozelandeses com um peso aproximado de 2,5-3 kg. Todos os animais foram mantidos em condições padrão de vivarium e alimentação ad libitum em conformidade com as diretrizes oficiais mexicanas para animais de laboratório (NOM 062-ZOO-1999) e sob o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição, 2011). Todos os procedimentos de animais e métodos de cuidado animal apresentados neste protocolo foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética do Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.
NOTA: A preparação do sistema isolado de perfusão pulmonar envolve a morte deliberada de um animal sob anestesia e via eutanásia.
1. Equipamento e preparação de aparelhos.
- Arranjo do equipamento:
- Configure uma mesa de operação com tamanho de acordo com o peso do coelho.
- Monte a tampa do tórax artificial na coluna de aço com a câmara de vidro por baixo e o ventilador com uma bomba de rolo pelos lados.
- Certifique-se de que a tampa está facilmente inclinada a ter a cânula traqueal em linha com a traqueia para permitir uma conexão mais rápida.
- Tórax artificial:
NOTA: É uma parte essencial do sistema. Consiste em uma câmara de vidro revesida de água selada por uma capa especial. A tampa funciona como o porta-órgãos com as conexões para cannular a traqueia e os vasos embutidos nela.- Configure um jato venturi operado por ar comprimido para gerar a pressão negativa dentro do tórax artificial.
NOTA: O módulo de controle de ventilação (VCM) permite ajustes separados de pressões inspiratórias e expiratórias finais, bem como taxa de respiração e a razão de duração inspiratória à duração total do ciclo.
- Configure um jato venturi operado por ar comprimido para gerar a pressão negativa dentro do tórax artificial.
- Aparelho:
- Certifique-se de que um aparelho normalmente funcionando consiste em uma coluna de aço principal montada em uma placa base segurando o tórax artificial, com o pneumotachômetro e transdutor de peso localizado acima dele e atrás da bobina pré-aquecimento com uma armadilha de bolhas.
- Conecte um transdutor de pressão diferencial ao pneumotámetro e outro à pressão da câmara. Coloque um par diferente de transdutores de pressão atrás do tórax para medir a perfusão e pressões venosas.
- Conecte o estoque de troca abaixo do oxigenador com um eletrodo de nível e o sistema de ventilação ao lado do aparelho.
2. Extração cirúrgica do bloco cardiopulmonar.
- Anestesia:
- Use uma combinação de um sedativo (xilazine) e um barbiturato (pentobarbital).
NOTA: Diferentes coquetéis anestésicos podem ser usados sem efeito em desfechos experimentais. - Primeiro, sedeia os coelhos saudáveis da Nova Zelândia com uma única injeção intramuscular de cloridrato de xilazina (3-5 mg/kg). Certifique-se de que os coelhos permaneçam calmos e relaxados para permitir mais manipulação após alguns minutos da injeção.
- Após a sedação, utilize as veias auditivas marginais (laterais) como acesso à anestesia dos coelhos com uma injeção intravenosa de sódio pentobarbital (28 mg/kg).
- Use uma combinação de um sedativo (xilazine) e um barbiturato (pentobarbital).
- Monitorização:
- Para evitar anestesia insuficiente ou depressão excessiva das funções cardíacas e respiratórias, monitore os seguintes parâmetros. Para avaliar a profundidade da anestesia, realize um teste de beliscão do dedo do dedo do dedo.
- Certifique-se de que a membrana mucosa é rosa. Tons azuis ou cinzentos indicam hipóxia.
- Certifique-se de que a frequência cardíaca está entre 120-135 batidas/min, e que a temperatura corporal não caia abaixo de 36,5 °C.
- Colocação animal:
- Raspe o tronco do coelho e coloque o animal na mesa de operação em posição supina. Coloque o sistema de ventilação perto da mesa, atrás da cabeça do coelho, para permitir conectar a cânula rapidamente após a traqueotomia para evitar danos tissulares.
- Incisão e traqueotomia:
- Disseca a pele com uma incisão de linha mediana ventral de 3-5 cm do diafragma até o pescoço.
- Com a tesoura de operação, corte o 2/3 anterior da traqueia entre dois anéis de cartilagem para inserir a cânula traqueal através da membrana fibrosa traqueal.
- Inserir um 5 mm (diâmetro externo; OD) cânula traqueal através da membrana fibrosa traqueal e use uma sutura de seda 4-0 para corrigi-la cuidadosamente.
- Coloque as pinças ou pinças debaixo da traqueia para garantir que a cânula não se dobre contra a traqueia.
- Ventilação de pressão positiva:
- Enquanto os pulmões permanecerem fora do tórax artificial, use uma bomba de respiração de pequenas espécies para ventilar uma pressão positiva, a fim de evitar o colapso pulmonar durante a cirurgia.
- Inicie a ventilação através da cânula traqueal conectada à bomba de respiração rapidamente após a traqueotomia e antes que o tórax seja aberto.
- Ajuste o volume da maré em 10 mL/kg.
NOTA: Dependendo da configuração do experimento e do modelo de tórax artificial, forneça ventilação de pressão positiva pela mesma bomba de ventilação usada para fornecer pressão negativa ou outra, concedendo uma rápida relaculação.
- Toracotomia e exsanguinação:
- Para acessar a cavidade torácica, use um bisturi ou uma tesoura para abrir a parede do tórax e realizar uma esternotomia medial até o terço superior do tórax.
- Mantenha as metades do tórax abertas por dois retratores. Vários retalhos pulmonares geralmente cercam o coração.
- Localize a veia cava superior e inferior e encaminhe-as com roscas.
- Antes da exsanguinação do animal, identifique o ventrículo direito e injete 1000 UI/kg de heparina.
- Imediatamente após a injeção, ligar a veia cava superior e inferior com o fio pré-looped e realizar a exsanguinação.
- Colheita coração-pulmão:
- Colher o bloco cardiopulmonar suavemente e rapidamente. Use dissecção digital direta ou tesoura de mola para separar o tecido conjuntivo de modo a remover os pulmões do tórax.
- Dissecar a vasculatura na área, bem como o esôfago.
- Corte o manúbrio sterni para estender a esternotomia medial em direção à cânula traqueal, liberando a traqueia em ambos os lados de tecido de conexão.
- Agora, ressegue a traqueia acima da cânula traqueal. Puxe suavemente a cânula em um eixo craniocaudal à medida que a fixação dorsal da traqueia e pulmões é ressecada.
- Canulação:
- Levante os pulmões isolados do tórax e coloque-os cuidadosamente sobre uma gaze estéril em uma placa de petri.
- Para evitar atelectasia, ventile os pulmões usando ventilação de pressão positiva com pressão final positiva (PEEP) fixada em 2 cmH2O.
- Remova os ventrículos cortando-os do coração ao nível da ranhura atrioventricular.
- Depois de abrir os dois ventrículos, introduza a cânula da artéria pulmonar OD de 4,6 mm para o coelho com uma cesta através da artéria pulmonar e introduza a cânula de átrio esquerdo de 5,9 mm para o coelho com a cesta através da válvula mitral no átrio esquerdo.
- Use uma sutura de seda 4-0 na artéria pulmonar e átrio esquerdo para consertar as cânulas. Inclua os tecidos circundantes nas ligaduras da artéria pulmonar e átrio esquerdo para evitar a distensão dessas estruturas.
- Injete 250 mL de solução isotônica salina através da cânula arterial para retirar o sangue restante do leito vascular.
3. Técnica de perfusão.
- Configuração:
- Coloque os pulmões isolados cuidadosamente na câmara pulmonar.
- Coloque a traqueia no transdutor na tampa da câmara.
- Conecte as naves cânuladas ao sistema de perfusão.
- Feche a câmara e fixe-a com a fechadura rotativa.
NOTA: O circuito de perfusão recirculante consiste em um reservatório venoso aberto, uma bomba peristáltica, um trocador de calor e uma armadilha de bolhas. - Neste ponto, conecte a tampa da câmara e troque sobre uma torneira para mudar de ventilação de pressão positiva para negativa. Para verificar a ventilação de pressão negativa dos pulmões e o fechamento hermético da câmara, inspecione a excursão respiratória da pressão pulmonar e de câmara no medidor de pressão.
- Perfuuse os pulmões com 200 mL de perfusato artificial sem sangue (um tampão bicarbonato Krebs-Ringer contendo 2,5% de albumina bovina).
- Inicie o fluxo de perfusato a 3 mL/min/kg, em seguida, intensifique lentamente o fluxo durante um período de 5 minutos para 5 mL/min/kg. Atinja um fluxo de 8 mL/min/kg ao longo dos próximos 5 minutos e, em seguida, após outro período de 5 min, atinja um fluxo máximo de 10 mL/min/kg. Tome cuidado para evitar que o ar entre no circuito.
NOTA: Mantenha o pH e a temperatura do perfusato dentro das faixas fisiológicas (pH 7.4-7.5; temperatura, 37 °C-38 °C). Para ajustar o pH, adicione NaHCO3 (1N) ou aumente o fluxo de dióxido de carbono. Alternativamente, use HCl (0.1N) para acidificar.
- Parâmetros:
- Verifique se os parâmetros de perfusão e ventilação predeterminados estão definidos conforme necessário.
- Ventilar os pulmões com ar umidificado a uma frequência de 30 bpm, um volume de maré de 10 mL/kg, e uma pressão expiratória final (Pe) de 2 cmH2O.
NOTA: A pressão arterial pulmonar (0-20 mmHg) corresponde à altura do nível líquido no oxigenador ou reservatório em centímetros acima do tronco pulmonar, enquanto a pressão venosa pulmonar corresponde à altura da câmara de equilíbrio de pressão acima do átrio esquerdo. Ambos os valores podem ser modificados. Note que a pressão do átrio esquerdo também é de 0-20 mmHg.
- Alcançar condições da zona 3:
- Use os dois cateteres conectados às portas laterais do cânulas fixados na artéria pulmonar, átrio esquerdo e transdutores de pressão para medir as pressões arterial (Pa) e venosa (Pv).
- Coloque as pressões da linha de base no nível do hilum pulmonar (referência zero).
- Conduzir os experimentos sob condições de ventilação da zona 3. Para isso, espere de 10 a 15 min para obter um equilíbrio caracterizado por um estado isogravimétrico.
- Certifique-se de que a pressão venosa é maior do que a pressão alveolar (Palv) e que a pressão arterial permaneça maior do que ambas (Pa > Pv > Palv) para que as condições da Zona 3 ocorram.
- Certifique-se de que o peso dos pulmões permaneça constante e as pressões atrial arterial e esquerda são estáveis para alcançar condições da zona 3 para abrir um número máximo de vasos pulmonares e manter o teor de leito microvascular durante o experimento.
NOTA: A medição do Kfc como indicador de edema pulmonar não tem variação entre um sistema manual e de perfusão automática.
- Controle eletrônico e processamento de sinais: Certifique-se de que o fluxo respiratório, as alterações de peso, a pressão microvascular, o volume da maré, a resistência vascular, entre outros, sejam registrados em uma unidade eletrônica central múltipla que integra sinais provenientes dos transdutores e os exibe no sistema de avaliação.
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Representative Results
O sistema isolado de perfusão pulmonar permite manipulação de órgãos para biópsia, coleta de amostras de perfusão e coleta de dados em tempo real de parâmetros fisiológicos. O sistema isolado pode ser usado para testar muitas hipóteses envolvendo diferentes funções e fenômenos pulmonares, desde atividade metabólica e enzimática até períodos de formação e preservação de edema para transplantes de pulmão.
A Figura 1 exibe um diagrama do sistema de perfusão pulmonar totalmente montado, juntamente com o sistema de ventilação e a aquisição de dados computados. O componente de perfusão do sistema garante que o perfusato esteja constantemente fluindo através dos pulmões isolados. A artéria pulmonar é canulada para fornecer perfusão de fluxo, enquanto a saída perfusada é fornecida pela cânulação esquerda do coração. O perfusato é passado usando a bomba de rolo de modo que perfusado passa através do trocador de calor, em seguida, através da armadilha bolha na artéria pulmonar, e finalmente para o leito vascular pulmonar. O componente de ventilação do sistema permite que o meio de ventilação flua constantemente além da extremidade distal do pneumotachômetro diretamente através da cânula traqueal para os pulmões.
A Figura 2 mostra a concentração de MAO (Figura 2A) e 5-HT (Figura 2B) em um pulmão isolado preservado a 4 °C a 24 h. Os níveis de oxidase de serotonina e monoamina foram determinados a partir de amostras de fluido intravascular obtidas em diferentes momentos e analisadas pela ELISA. A concentração de 5-HT atingiu o pico após 15 minutos de preservação e depois diminuiu durante as próximas 6 horas. Posteriormente, os níveis de perfusão apresentaram aumento não estatisticamente significativo até a 24ª hora. Os níveis de MAO mostraram um comportamento semelhante, atingindo o pico após 15 minutos de preservação, diminuindo durante as próximas seis horas até a 24ª hora12. A Figura 3 mostra taxas de liberação de 5-HT e MAO, expressas em percentagem do valor inicial, medida até 24 h em uma preparação pulmonar isolada a 4 °C. Durante a primeira hora de preservação, os níveis de 5-HT subiram mais alto que o MAO e diminuíram em 6 h após serem recapturados por células e plaquetas e plaquetas estotélios, bem como catabolismo mediado por MAO12.
A Figura 4 mostra NEP (densidades ópticas/mg proteína/min) e atividade enzimática ACE (densidades ópticas/mg de proteína/min) através do tempo em uma preparação pulmonar isolada. A atividade nep (Figura 4A) foi determinada pela análise espectrofotométrica usando N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly como substrato NEP seguido pela adição de enalabril para inibir ace. A atividade ace (Figura 4B) foi determinada pela análise espectrofotométrica utilizando enalapril como substrato ACE, seguido pela adição de fosforamidon para inibir o NEP. Uma vez que ambas as soluções continham enalapril, a atividade ace foi calculada como a diferença de fluorescência entre amostras com e sem enalapril13.
A Figura 5 mostra o efeito da preservação pulmonar na permeabilidade capilar (mKfc) através de um período de 24 h no sistema isolado de perfusão pulmonar no modelo coelho. Um grupo controle (n = 6), avaliado imediatamente após a colheita, teve um mKfc de 2,8 ± 0,8 (mL/min/cmH2O/g) erro padrão, em contrapartida, o pulmão perfusado sofreu um aumento progressivo na pontuação mKfc 7,5 ± 1,4 (n = 6) às 6h, 10,8 ± 2,3 (n = 6) às 12h e atingiu 16,3 ± 2,5 (n = 6) após 24h de preservação13.
A Figura 6 mostra o efeito de diferentes aditivos na permeabilidade capilar do sistema isolado de perfusão pulmonar em diversas condições. Um aumento repentino de pressão de 10 cmH2O é gerado por uma obstrução parcial da saída venosa para medir a permeabilidade do leito capilar através do coeficiente de filtragem capilar (Kfc). Para medir o Kfc, a tubulação de saída que sai do ventrículo esquerdo para o reservatório Krebs foi parcialmente fixada. Em seguida, o grampo parcial foi mantido por 3 minutos certificando-se de que o incremento de pressão atingiu 10 cmH2O. A fixação foi liberada, e o fluxo normal continuou. Esta manobra foi registrada como um incremento da pressão arterial e um aumento do peso pulmonar. Este último parâmetro é considerado o Kfc.
Figura 1: Diagrama para o sistema isolado de perfusão pulmonar. Este número foi modificado de Hugo Sachs Elektronik (HSE), Harvard Apparatus14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Concentração de serotonina (5-HT) e monoamina oxidase (MAO) envolvida no metabolismo pulmonar e permeabilidade vascular. A concentração de (A) MAO e (B) 5-HT em um pulmão isolado preservado a 4°C até 24 horas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Taxas de liberação de serotonina (5-HT) e monoamina oxidase (MAO). As taxas de liberação de 5-HT e MAO, expressas em percentagem do valor inicial, medida através de 24 h em uma preparação pulmonar isolada a 4 °C. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Atividade enzimática da endopepidase neutra (NEP) e enzima conversor de angiotensina (ACE). Atividade enzimática de (A) NEP e (B) ACE através do tempo em um pulmão isolado preservado a 4 °C a 24 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeito da preservação pulmonar na permeabilidade capilar (mKfc). Os dados mostram o efeito da preservação pulmonar na permeabilidade capilar (mKfc) através de um período de 24 h no sistema isolado de perfusão pulmonar no modelo coelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Efeito de diferentes aditivos na permeabilidade capilar. O efeito de diferentes aditivos na permeabilidade capilar do sistema isolado de perfusão pulmonar em diversas condições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho apresenta uma visão geral do sistema isolado de perfusão pulmonar, uma técnica essencial na pesquisa de fisiologia pulmonar. O sistema isolado de perfusão pulmonar oferece um grande grau de versatilidade em seus usos e permite a avaliação de vários parâmetros relevantes no teste de uma ampla gama de hipóteses15. Um sistema pulmonar isolado é uma ferramenta com presença mundial que, na última década, estabeleceu ainda mais sua relevância para avaliações específicas de órgãos e também ampliou sua utilidade como extensão de tecnologias de última geração e novas terapias envolvendo células-tronco mesenquimais16 e engenharia de genomas CRISPR/Cas917, entre outras. As áreas atuais de pesquisa de perfusão pulmonar ex vivo abrangem amplamente estratégias anti-inflamatórias, gerenciamento e prevenção de lesões por ventilação, tratamento anti-rejeição e desempenho de edema anti-pulmonar15.
É necessária uma montagem adequada do aparelho para garantir a correta coleta de dados. Como mostrado na Figura 1 , todo o sistema consiste em uma câmara úmida de pressão negativa presa a um sistema de ventilação e um sistema de perfusão que imita as funções respiratórias e circulatórias dos pulmões, respectivamente. Ambos os sistemas estão conectados a um sistema de aquisição de dados que permite a adição de dispositivos de medição que podem ser adaptados para as necessidades de qualquer protocolo. O processo cirúrgico de colheita do bloco cardio-pulmonar deve ser realizado rapidamente, preferencialmente por pessoal experiente, para evitar lesões teciduais adicionais para manter o pulmão o mais intacto possível para que a função fisiológica possa continuar sem maiores interferências durante o experimento. O sistema também permite a coleta de amostras de perfusão em tempo real que podem ser usadas para determinar o efeito de certas moléculas em diferentes funções pulmonares (por exemplo, efeito heparina na preservação pulmonar).
Para obter uma distribuição adequada do fluxo de perfusão entre os vasos pulmonares, ou seja, capilares, as condições da zona 3 devem ser adquiridas. As condições da zona 1 são definidas como a região onde a pressão arterial cai abaixo da pressão alveolar, tipicamente se aproximando da pressão atmosférica. Quando isso acontece, os capilares se achatam, tornando o fluxo de sangue ou perfusão impossível. Em circunstâncias normais, a zona 1 não pode existir, uma vez que a pressão arterial é suficiente para garantir a distribuição do fluxo. No entanto, as condições da zona 1 podem aparecer se a pressão arterial cair, ou a pressão alveolar aumentar (como acontece durante a ventilação positiva da pressão). As condições da zona 1 levam a um pulmão ventilado sem perfumado que é incapaz de realizar uma troca de gás. Nas condições da zona 2, a pressão arterial é maior que a pressão alveolar. No entanto, a pressão venosa permanece abaixo da pressão alveolar resultando em um fluxo de perfusão determinado pela diferença entre pressões arterials e alveolares. Este comportamento pode ser modelado usando um resistor Starling. As condições da zona 3 são determinadas pela diferença entre pressões arteriais e venosas. O aumento do fluxo de perfusão na zona 3 ocorre porque os capilares distend, condicionando a abertura de um número máximo de vasos pulmonares.
A unidade do sistema consiste em sete módulos: dois módulos amplificadores transdutores analógicos (TAM-A) equipados com um sinal analógico de gráfico de barras LED para monitorar sinais dinâmicos (pressão arterial, fluxo de ar respiratório, força de contração, etc.), um módulo amplificador transdutor digital (TAM-D) com um display numérico digital projetado para monitorar sinais pulsantes de mudança lenta; um controlador servo para módulo de perfusão (SCP) que trabalha em conjunto com amplificadores TAM-A e TAM-D para controle de perfusão de perfusões isoladas de órgãos usando a bomba peristáltica, a velocidade da bomba pode ser definida em modo de pressão constante ou controlada manualmente através do SCP; um módulo de equilíbrio de edema (EBM) que mede o peso pulmonar; um módulo de controle de ventilação (VCM) para controlar a ventilação de pressão positiva e negativa, e um módulo de contador de temporizador (TCM) que pode ser configurado para acionar o VCM para realizar ciclos profundos de inspiração.
A alta prevalência global de afetos pulmonares e respiratórios e as limitações das opções terapêuticas atuais estão forçando uma maior demanda por transplantes de pulmão, pois continua sendo o tratamento padrão ouro para pacientes com doença pulmonar terminal18. O sistema de perfusão pulmonar ex-vivo representa uma excelente plataforma para testar terapias-alvo em pesquisas básicas e clínicas. Em nível clínico, o sistema de perfusão ex-vivo pode ser usado para avaliar o tecido enxerto fora do corpo, permitindo testar o órgão isolado antes do transplante, ajudando a coletar dados clínicos para um prognóstico mais preciso sobre a eficácia do transplante. O uso racional do sistema isolado de perfusão pulmonar poderia ajudar a otimizar a cirurgia de transplante de pulmão, tornando-os um procedimento mais seguro e eletivo. O modelo pulmonar isolado também é útil na pesquisa básica de técnicas avançadas de diagnóstico e terapia, como a instilação de células-tronco mesenquimais e outras terapias imunomediadas; muitos relatos têm mostrado o potencial da técnica de perfusão ex-vivo como uma plataforma para fazer mais pesquisas sobre preservação pulmonar no desenvolvimento de técnicas para evitar lesões de isquemia-reperfusão e edema pulmonar, prolongando a viabilidade do órgão15. Algumas etapas e limitações de solução de problemas associadas ao modelo pulmonar isolado são principalmente o curto tempo disponível desta técnica para possível geração de edema induzida pela limitação do dreno linfático, bem como o efeito sistêmico da técnica. A determinação do coeficiente de filtragem capilar (Kfc) é um critério confiável para medir a funcionalidade do tecido pulmonar preservado e estabelecer a extensão do edema ao longo do tempo. Não foi encontrada diferença entre as determinações manual e automática do Kfc19.
À medida que o uso do sistema isolado de perfusão pulmonar populariza e novas terapias mudam o cenário clínico, a técnica de perfusão ex-vivo está se tornando uma escolha eletiva para melhorar os resultados dos pacientes em diferentes patologias pulmonares, bem como aumentar o pool de potenciais doadores de pulmão sem comprometer a segurança do receptor, prometendo uma nova era na preservação pulmonar e transplante de pulmão. O surgimento da pandemia Covid-19 e o aumento da prevalência da DPOC18,20 na população global destacam a necessidade de mais pesquisas básicas sobre fisiologia pulmonar, preservação pulmonar e transplante de pulmão, bem como pesquisas pré-clínicas de novas terapias com visões para a medicina translacional. Além disso, o modelo ex-vivo rabbit é um modelo acessível e prático para treinar residentes e estudantes na área de pneumologia, particularmente aqueles envolvidos com cirurgia torácica e ECMO. Qualquer laboratório envolvido em protocolos de pesquisa respiratória ou toracopulmonar é encorajado a considerar o sistema isolado de perfusão pulmonar como parte de suas ferramentas diárias para seus experimentos.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer à doutora Bettina Sommer Cervantes pelo apoio na redação deste manuscrito, e kitzia Elena Lara Safont por seu apoio às ilustrações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
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