Summary
Den isolerade kanin lungpreparatet är ett guldstandardverktyg i lungforskning. Denna publikation syftar till att beskriva tekniken som utvecklad för studier av fysiologiska och patologiska mekanismer som är involverade i luftvägarna reaktivitet, lungbevarande och preklinisk forskning i lungtransplantation och lungödem.
Abstract
Det isolerade lungperfusionssystemet har använts i stor utsträckning i lungforskningen, vilket bidrar till att klargöra lungornas inre funktion, både mikro och makroskopiskt. Denna teknik är användbar vid karakterisering av lungfysiologi och patologi genom att mäta metaboliska aktiviteter och andningsfunktioner, inklusive interaktioner mellan cirkulationsämnen och effekterna av inhalerade eller perfuserade ämnen, som vid drogtester. Medan in vitro metoder innebär skivning och odling av vävnader, tillåter det isolerade ex vivo lungperfusion systemet att arbeta med ett komplett funktionellt organ vilket möjliggör studier av en kontinuerlig fysiologisk funktion samtidigt återskapa ventilation och perfusion. Det bör dock noteras att effekterna av frånvaron av central innervation och lymfatisk dränering fortfarande måste bedömas fullt ut. Detta protokoll syftar till att beskriva monteringen av den isolerade lungapparaten, följt av kirurgisk extraktion och cannulation av lungor och hjärta från experimentella laboratoriedjur, samt att visa perfusionsteknik och signalbehandling av data. Den genomsnittliga livskraften hos den isolerade lungan varierar mellan 5-8 h; under denna period ökar lungkapillärpermeabiliteten, vilket orsakar ödem och lungskada. Funktionen hos konserverad lungvävnad mäts med kapillärfiltreringskoefficienten (Kfc), som används för att bestämma omfattningen av lungödem genom tiden.
Introduction
Brodie och Dixon beskrev först ex-vivo lungperfusion systemet i 1903 1. Sedan dess har det blivit ett guldstandardverktyg för att studera lungornas fysiologi, farmakologi, toxikologi och biokemi2,3. Tekniken erbjuder ett konsekvent och reproducerbart sätt att utvärdera livskraften hos lungtransplantationer och att bestämma effekten av inflammatoriska medlare som histamin, arakidonsyrametaboliter och substans P, bland andra, liksom deras interaktioner under lungfenomen som bronkokonstristriktion, atelektas och lungödem. Det isolerade lungsystemet har varit en nyckelteknik för att avslöja lungornas viktiga roll i elimineringen av biogena aminer från den allmänna cirkulationen4,5. Dessutom har systemet använts för att utvärdera biokemin hos lungsurfaktant6. Under de senaste decennierna har ex-vivo lungperfusionssystemet blivit en idealisk plattform för lungtransplantationsforskning7. År 2001 beskrev ett team lett av Stig Steen den första kliniska tillämpningen av ex-vivo lungperfusionssystemet genom att använda det för att rekonditionera lungorna hos en 19-årig donator, som ursprungligen avvisades av transplantationscentra på grund av dess skador. Den vänstra lungan skördades och perfuserades i 65 min; efteråt transplanterades det framgångsrikt till en 70-årig man med KOL8. Ytterligare forskning om lungrekonditionering med hjälp av ex-vivo perfusion ledde till att utveckla Toronto-tekniken för utökad lungperfusion för att bedöma och behandla skadade donatorlungor9,10. Kliniskt har ex-vivo lungperfusionssystemet visat sig vara en säker strategi för att öka givarpoolerna genom att behandla och rekonditionera undermåliga donatorlungor, vilket inte ger någon signifikant skillnad i risker eller resultat jämfört med standardkriterier givare10.
Den största fördelen med det isolerade lungperfusionssystemet är att de experimentella parametrarna kan utvärderas i ett komplett funktionellt organ som bevarar sin fysiologiska funktion under en konstgjord laboratorieinställning. Dessutom tillåter det mätning och manipulering av lungmekanisk ventilation att analysera komponenterna i lungfysiologi såsom luftvägsresistens, total kärlbeständighet, gasutbyte och ödembildning, som hittills inte kan mätas exakt in vivo på labbdjur2. I synnerhet kan sammansättningen av den lösning med vilken lungan perfunderas kontrolleras fullt ut, vilket gör det möjligt att tillsatsen av ämnen för att utvärdera deras effekter i realtid och provsamling från perfusion för vidare studier11. Forskare som arbetar med det isolerade lungsystemet bör komma ihåg att mekanisk ventilation orsakar förfall av lungvävnaden som förkortar dess användbara tid. Detta progressiva fall i mekaniska parametrar kan avsevärt fördröjas genom att hyperinflatera lungorna ibland under experimentet4. Ändå kan preparatet vanligtvis inte vara mer än åtta timmar. En annan faktor för ex-vivo lung perfusion systemet är avsaknaden av centrala nervsystemet reglering och lymfatiska dränering. Effekterna av deras frånvaro är ännu inte helt förstådda och kan potentiellt vara en källa till partiskhet i vissa experiment.
Den isolerade lungperfusionssystemet tekniken kan utföras i kaninmodellen med en hög grad av konsistens och reproducerbarhet. Detta arbete beskriver de tekniska och kirurgiska ingreppen för genomförandet av ex-vivo isolerade lungperfusion teknik som utvecklats för kaninmodellen vid Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias i Mexico City, med avsikt att dela insikterna och ge en tydlig guide om viktiga steg i tillämpningen av denna experimentella modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det isolerade perfusionssystemet i kaninmodellen har använts i stor utsträckning i Bronchial Hyperresponsiveness Laboratory vid Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Protokollet innehåller nyazeeländska kaniner med en ungefärlig vikt på 2,5-3 kg. Alla djur hölls under standard vivariumförhållanden och ad libitummatning i enlighet med de officiella mexikanska riktlinjerna för laboratoriedjur (NOM 062-ZOO-1999) och enligt guiden för vård och användning av laboratoriedjur (8: e upplagan, 2011). Alla djurprocedurer och djurvårdsmetoder som presenteras i detta protokoll godkändes tidigare av etikkommittén vid Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.
OBS: Beredningen av det isolerade lungperfusionssystemet innebär avsiktlig död av ett djur under anestesi och via dödshjälp.
1. Utrustning och förberedelse av apparater.
- Utrustningsarrangemang:
- Ställ in ett operationsbord med storlek enligt kaninens vikt.
- Montera locket på den konstgjorda bröstkorgen på stålkolonnen med glaskammaren under och fläkten med en rullpump i sidorna.
- Se till att locket lätt lutar till att ha trakealkanylen i linje med luftstrupen för att möjliggöra en snabbare anslutning.
- Konstgjord bröstkorg:
OBS: Det är en viktig del av systemet. Den består av en vattenmantlad glaskammare förseglad med ett speciellt lock. Omslaget fungerar som organhållare med anslutningarna för att kanylera luftstrupen och kärlen inbäddade i den.- Sätt upp en venturistråle som drivs av tryckluft för att generera det undertryck som finns inuti den konstgjorda bröstkorgen.
OBS: Ventilationsstyrningsmodulen (VCM) möjliggör separata justeringar av inandnings- och slututsättningstrycket samt andningshastighet och förhållandet mellan inandningslängd och total cykelvaraktighet.
- Sätt upp en venturistråle som drivs av tryckluft för att generera det undertryck som finns inuti den konstgjorda bröstkorgen.
- Apparat:
- Se till att en normalt fungerande apparat består av en huvudstålpelare monterad på en bottenplatta som håller den konstgjorda bröstkorgen, med pneumotachometern och viktgivaren placerad ovanför den och bakom förvärmningsspolen med en bubbelfälla.
- Anslut en differentialtrycksgivare till pneumotachometern och en annan med kammartrycket. Ställ in ett annat par tryckgivare bakom bröstkorgen för att mäta perfusion och venöst tryck.
- Anslut växellagret under oxygenatorn med en nivåelektrod och ventilationssystemet bredvid apparaten.
2. Kirurgisk extraktion av kardiopulmonära blocket.
- Anestesi:
- Använd en kombination av ett lugnande medel (xylazin) och en barbiturat (pentobarbital).
OBS: Olika bedövningscocktails kan användas utan effekt på experimentella resultat. - Först söva de friska nyazeeländska kaninerna med en enda intramuskulär injektion av xylazinhydroklorid (3-5 mg/kg). Se till att kaninerna förblir lugna och avslappnade för att möjliggöra ytterligare manipulering efter några minuter av injektionen.
- Efter sedering, använd marginalörörerna (laterala) som tillgång till bedöva kaninerna med en intravenös injektion av pentobarbital natrium (28 mg/kg).
- Använd en kombination av ett lugnande medel (xylazin) och en barbiturat (pentobarbital).
- Övervakning:
- För att undvika otillräcklig anestesi eller överdriven depression av hjärt- och andningsfunktioner, övervaka följande parametrar. För att bedöma anestesidjupet, utför ett toe pinch-test.
- Se till att slemhinnan är rosa. Blå eller grå nyanser indikerar hypoxi.
- Se till att pulsen är mellan 120-135 slag/min och att kroppstemperaturen inte sjunker under 36,5 °C.
- Placering av djur:
- Raka kaninens torso och placera djuret på operationsbordet i supinläge. Placera ventilationssystemet nära bordet, bakom kaninens huvud, för att möjliggöra anslutning av kanylen snabbt efter trakeotomi för att undvika tissulär skada.
- Snitt och trakeotomi:
- Dissekera huden med ett ventrala medianlinjesnitt på 3-5 cm från membranet upp till nacken.
- Skär den främre 2/3 av luftstrupen med arbetssaxen mellan två broskringar för att föra in luftrörs canylen genom luftstrupens fibrösa membran.
- Sätt in en 5 mm (ytterdiameter; OD) trakeal cannula genom trakealfibrös membranet och använd en 4-0 silke sutur för att fixa det noggrant.
- Placera antingen tång eller pincett under luftstrupen för att säkerställa att kanylen inte böjde sig mot luftstrupen.
- Ventilation med positivt tryck:
- Så länge lungorna förblir utanför den konstgjorda bröstkorgen, använd en liten art andningspump för att ventilera ett positivt tryck för att undvika lungkollaps under operationen.
- Initiera ventilation genom trakeal canyl ansluten till andningspumpen snabbt efter trakeotomi och innan bröstkorgen öppnas.
- Ställ in tidvattenvolymen till 10 ml/kg.
OBS: Beroende på experimentinställningen och konstgjord bröstkorgsmodell, ge positivtrycksventilation av antingen samma ventilationspump som används för att ge undertryck eller en annan, vilket ger en snabb omreglering.
- Thoracotomi och exsanguination:
- För att komma åt brösthålan, använd en skalpell eller sax för att öppna bröstkorgen och utföra en mediala sternotomy upp till den övre tredjedelen av bröstkorgen.
- Håll bröstkorgshalvorna öppna med två upprullningsdon. Flera lungklaffar omger vanligtvis hjärtat.
- Lokalisera den överlägsna och sämre vena cava och hänvisa dem med trådar.
- Före exsanguination av djuret, identifiera rätt ventrikel och injicera 1000 UI/kg heparin.
- Omedelbart efter injektionen, liga den överlägsna och sämre vena cava med den förslingade tråden och utför exsanguination.
- Hjärt-lungskörd:
- Skörda kardiopulmonära blocket försiktigt och snabbt. Använd direkt digital dissekering eller vårsax för att separera bindväven för att avlägsna lungorna från bröstkorgen.
- Dissekera vaskulaturen i området, liksom matstrupen.
- Skär genom manubrium sterni för att förlänga den mediala sternotomy mot trakeal cannula, släppa luftstrupen på båda sidor från anslutande vävnad.
- Sätt om luftstrupen ovanför luftstrups canylen. Dra försiktigt upp kanylen i en kraniokaudal axel när dorsala fixering av luftstrupen och lungorna är resected.
- Kanylering:
- Lyft ut de isolerade lungorna ur bröstkorgen och placera dem försiktigt över en steril gasväv på en petriskål.
- För att förhindra atelektas, ventilera lungorna med hjälp av positivtrycksventilation med positivt ändutsättande tryck (PEEP) inställt på 2 cmH2O.
- Ta bort ventriklarna genom att skära av dem från hjärtat i nivå med atrioventricular spåret.
- Efter att ha öppnat de två ventriklarna, introducera OD 4,6 mm lungartärkanyl för kaninen med en korg genom lungartären och introducera OD 5,9 mm vänster atriumkanyl för kaninen med korgen genom mitralventilen i vänster atrium.
- Använd en 4-0 silkes sutur i lungartären och vänster atrium för att fixa kanylerna. Inkludera de omgivande vävnaderna i ligaturerna i lungartären och vänster förmak för att undvika distension av dessa strukturer.
- Injicera 250 ml saltlösningsosotonisk lösning genom artärkanylen för att spola det återstående blodet från kärlbädden.
3. Perfusionsteknik.
- Installationen:
- Placera de isolerade lungorna försiktigt i lungkammaren.
- Fäst luftstrupen på givaren på kammarens lock.
- Anslut de kanylerade kärlen till perfusionssystemet.
- Stäng kammaren och säkra den med rotationslåset.
OBS: Den återcirkulerande perfusionskretsen består av en öppen venreservoar, en peristaltisk pump, en värmeväxlare och en bubbelfälla. - Fäst vid denna punkt kammarlocket och byt över en kran för att byta från positiv till undertrycksventilation. För att kontrollera lungornas undertrycksventilation och lufttät stängning av kammaren, inspektera lungans andningsutflykt och kammartrycket på tryckmätaren.
- Perfusera lungorna med 200 ml artificiellt blodfritt perfusat (en Krebs-Ringer bikarbonatbuffert som innehåller 2,5% av bovint albumin).
- Starta perfusatflödet vid 3 ml/min/kg och öka sedan långsamt flödet under en 5-min period till 5 ml/min/kg. Nå ett flöde på 8 ml/min/kg under de närmaste 5 minuterna och nå sedan efter ytterligare 5 min period ett maximalt flöde på 10 ml/min/kg. Var försiktig så att du undviker att luft kommer in i kretsen.
OBS: Håll pH-värdet och perfusatets temperatur inom fysiologiska intervall (pH 7,4-7,5; temperatur, 37 °C-38 °C). För att justera pH, tillsätt NaHCO3 (1N) eller öka flödet av koldioxid. Alternativt kan du använda HCl (0,1N) för att försura.
- Parametrar:
- Kontrollera om de förutbestämda perfusions- och ventilationsparametrarna är inställda efter behov.
- Ventilera lungorna med fuktad luft med en frekvens av 30 bpm, en tidvattenvolym på 10 ml/kg och ett slututgångstryck (Pe) på 2 cmH2O.
OBS: Lungartärtrycket (0-20 mmHg) motsvarar höjden på vätskenivån i oxygenatorn eller behållaren i centimeter ovanför lungstammen, medan lungtrycket motsvarar höjden på tryckkvilibreringskammaren ovanför det vänstra atriumet. Båda värdena kan ändras. Observera att vänster atriumtryck också är 0-20 mmHg.
- Uppnå villkor för zon 3:
- Använd de två katetrar som är anslutna till kanylens sidoportar som är säkrade i lungartären, vänster förmak och tryckgivare för att mäta arteriella (Pa) och venösa (Pv) tryck.
- Ställ in baslinjetrycket på nivån för lung hilum (Zero-reference).
- Utför experimenten under ventilationsförhållanden i zon 3. För att uppnå detta, vänta i 10-15 min för att få en jämvikt som kännetecknas av ett isogravimetriskt tillstånd.
- Se till att ventrycket är högre än alveolartrycket (Palv) och att artärtrycket förblir högre än båda (Pa > Pv > Palv) för att zon 3-förhållanden ska uppstå.
- Se till att lungornas vikt förblir konstant och arteriella och vänstra förmakstryck är stabila för att uppnå zon 3-förhållanden för att öppna upp ett maximalt antal lungkärl och bibehålla den mikrovaskulära sänghalten under experimentet.
OBS: Mätningen av Kfc som indikator på lungödem har ingen variation mellan ett manuellt och ett automatiskt perfusionssystem.
- Elektronisk kontroll och signalbehandling: Se till att andningsflödet, viktförändringar, mikrovaskulärt tryck, tidvattenvolym, kärlbeständighet bland annat registreras på en flera centrala elektronikenheter som integrerar signaler som kommer från givare och visar dem på utvärderingssystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det isolerade lungperfusionssystemet möjliggör organmanipulation för biopsi, provsamling från perfusion och datainsamling i realtid av fysiologiska parametrar. Det isolerade systemet kan användas för att testa många hypoteser som involverar olika funktioner och lungfenomen, från metabolisk och enzymatisk aktivitet till ödembildning och konserveringsperioder för lungtransplantationer.
Figur 1 visar ett diagram över det helt monterade isolerade lungperfusionssystemet tillsammans med ventilationssystemet och det beräknade datainsamlinget. Perfusionskomponenten i systemet säkerställer att perfusatet ständigt strömmar genom de isolerade lungorna. Lungartären kanyleras för att ge inflödesperfusion, medan perfusatutflöde tillhandahålls genom att cannulating hjärtats vänstra atrium. Perfusatet passeras med hjälp av rullpumpen så att perfusat passerar genom värmeväxlaren, sedan genom bubbelfällan in i lungartären och slutligen in i lungvaskulära sängen. Ventilationskomponenten i systemet gör att ventilationsmediet ständigt kan flöda förbi pneumotachometerns distala ände direkt via trakeal cannula in i lungorna.
Figur 2 visar koncentrationen av MAO (figur 2A) och 5-HT (figur 2B) i en isolerad lunga bevarad vid 4 °C till 24 timmar. Serotonin och monoaminoxidas nivåer fastställdes från intravaskulära vätskeprover som erhållits vid olika tidpunkter och analyseras av ELISA. 5-HT koncentrationen toppade efter 15 min bevarande och sedan minskade under de nästa 6 h. Efteråt visade perfusion nivåer en icke-statistiskt signifikant ökning fram till den 24: e timmen. MAO nivåer visade ett liknande beteende, toppade efter 15 minuters bevarande, sedan minska under de kommande sex timmarna upp till den 24: e timmen12. Figur 3 visar frisättningshastigheter på 5 HT och MAO, uttryckta i procent av det ursprungliga värdet, mätt genom 24 timmar i en isolerad lungpreparat vid 4 °C. Under den första timmen av bevarande, 5-HT nivåer steg högre än MAO och minskade inom 6 h efter att ha återerövrats av endotel celler och trombocyter samt MAO medierade katabolism12.
Figur 4 visar NEP (optisk densitet/mg protein/min) och ACE enzymatisk aktivitet (optisk densitet/mg protein/min) genom tiden i en isolerad lungpreparat. NEP aktivitet (figur 4A) fastställdes genom spektrofotometrisk analys med N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly som NEP substrat följt av enalapril tillägg för att hämma ACE. ACE-aktivitet (figur 4B) fastställdes genom spektrofotometrisk analys med enalapril som ACE-substrat, följt av fosforamidontillskott för att hämma NEP. Eftersom båda lösningarna innehöll enalapril beräknades ACE-aktiviteten som skillnaden i fluorescens mellan prover med och utan enalapril13.
Figur 5 visar effekten av lungkonservering i kapillärpermeabilitet (mKfc) genom en period av 24 h i det isolerade lungperfusionssystemet i kaninmodellen. En kontrollgrupp (n = 6), bedömd omedelbart efter skörden, hade en mKfc på 2,8 ± 0,8 (mL/min/cmH2O/g) standardfel, däremot drabbades den perfuserade lungan av en progressiv ökning på mKfc poäng 7,5 ± 1,4 (n = 6) vid 6 h, 10,8 ± 2,3 (n = 6) vid 12 h och nådde 16,3 (n) vid 12 h och nådde 16,3 (n) vid 12 h och nådde 16,3 (n) vid 12 h och nådde 16,3 ± 16,3 (n= 6) vid 6 h, 10,8 ± 2,3 (n = 6) vid 12 h och nådde 16,3 ± 16,3 (n= 6) vid 6 h, 10,8 ± 2,3 (n = 6) vid 12 h och nådde 16,3 ± 16, 10,8 ± 2,3 (n = 6) vid 12 h och nådde 16,3 (n) vid 12 h och nådde 16,3 ± 12 h och nådde 16,3 ± 16,3 (n= 6) vid 6 h, 10,8 ± 2,3 (n = 6) vid 12 h och nådde 16,3 (n) vid 12 h och nådde 16,3 ± 1
Figur 6 visar effekten av olika tillsatser i kapillärpermeabiliteten hos det isolerade lungperfusionssystemet under olika förhållanden. En plötslig tryckökning på 10 cmH2O genereras av en partiell obstruktion av det venösa utflödet för att mäta kapillärbäddens permeabilitet genom kapillärfiltreringskoefficienten (Kfc). För att mäta Kfc var utflödesslangen som går ut ur vänster kammare till Krebs reservoar delvis fastklämd. Därefter bibehölls den partiella klämman i 3 minuter och såg till att tryckökningen nådde 10 cmH2O. Fastspänningen släpptes och det normala flödet fortsatte. Denna manöver registrerades som en ökning av kranskärlens tryck och en lung vikt augmentation. Den sista parametern betraktas som KFC.
Bild 1: Diagram för det isolerade lungperfusionssystemet. Denna siffra har ändrats från Hugo Sachs Elektronik (HSE), Harvard Apparatus14. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Koncentration av serotonin (5-HT) och monoaminoxidas (MAO) som är involverade i lungmetabolism och vaskulär permeabilitet. Koncentrationen av (A) MAO och (B) 5-HT i en isolerad lunga bevarad vid 4°C till 24 h. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Frisättningshastigheter för serotonin (5-HT) och monoaminoxidas (MAO). Frisättningshastigheterna på 5-HT och MAO, uttryckta som en procentandel av det ursprungliga värdet, mätt genom 24 h i en isolerad lungpreparat vid 4 °C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Enzymatisk aktivitet hos neutralt endopeptidas (NEP) och Angiotensinkonverteringsenzym (ACE). Enzymatisk aktivitet av (A) NEP och (B) ACE genom tiden i en isolerad lunga bevarad vid 4 °C till 24 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Lungkonserveringseffekt vid kapillärpermeabilitet (mKfc). Data visar effekten av lungkonservering i kapillärpermeabilitet (mKfc) genom en period av 24 h i det isolerade lungperfusionssystemet i kaninmodellen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Effekten av olika tillsatser i kapillärpermeabiliteten. Effekten av olika tillsatser i kapillärpermeabiliteten hos det isolerade lungperfusionssystemet under olika förhållanden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete visar en allmän bild av det isolerade lungperfusionssystemet, en viktig teknik inom lungfysiologiforskning. Det isolerade lungperfusionssystemet erbjuder en stor grad av mångsidighet i dess användningsområden och möjliggör utvärdering av flera parametrar som är relevanta vid testning av ett brett spektrum av hypoteser15. Ett isolerat lungsystem är ett verktyg med världsomspännande närvaro som under det senaste decenniet ytterligare har etablerat sin relevans för organspecifika utvärderingar och även utvidgat dess användbarhet som en förlängning av den senaste tekniken och nya terapier som involverar mesenkymala stamceller16 och CRISPR/Cas9 genomteknik17, bland andra. Nuvarande ex vivo lungperfusion forskningsområden täcker i stort sett antiinflammatoriska strategier, ventilation skada förvaltning och förebyggande, anti-avstötning behandling och anti-pulmonell ödem prestanda15.
En korrekt montering av apparaten krävs för att garantera korrekt datainsamling. Som visas i figur 1 består hela systemet av en våt kammare för undertryck fäst vid ett ventilationssystem och ett perfusionssystem som efterliknar lungornas andnings- respektive cirkulationsfunktioner. Båda systemen är anslutna till ett dataförvärvssystem som gör det möjligt att lägga till mätenheter som kan skräddarsys för behoven i alla protokoll. Den kirurgiska processen för att skörda hjärt-lungblocket bör utföras snabbt, helst av erfaren personal, för att undvika ytterligare vävnadsskada för att hålla lungan så intakt som möjligt så att den fysiologiska funktionen kan fortsätta utan ytterligare störningar under experimentet. Systemet möjliggör också perfusionsprovsamling i realtid som kan användas för att bestämma effekten av vissa molekyler i olika lungfunktioner (till exempel heparineffekt på lungkonservering).
För att uppnå en korrekt fördelning av perfusionsflödet mellan lungkärl, nämligen kapillärer, bör zon 3-villkor upphandlas. Zon 1-förhållanden definieras som den region där artärtrycket sjunker under alveolartrycket, som vanligtvis närmar sig atmosfärstrycket. När detta händer platta kapillärerna, vilket gör blod eller perfusion flöde omöjligt. Under normala omständigheter kan zon 1 inte existera eftersom artärtrycket är tillräckligt för att garantera flödesfördelning. Zon 1-förhållanden kan dock uppstå om artärtrycket sjunker eller alveolartrycket ökar (som det gör under positiv tryckventilation). Zon 1-förhållanden leder till en ogenomsänkt ventilerad lunga som inte kan utföra ett gasutbyte. I zon 2-förhållanden är arteriellt tryck högre än alveolartrycket. Venöst tryck förblir dock under alveolartrycket vilket resulterar i ett perfusionsflöde som bestäms av skillnaden mellan arteriellt och alveolartryck. Det här beteendet kan modelleras med hjälp av ett Starling-motstånd. Zon 3-förhållanden bestäms av skillnaden mellan arteriella och venösa tryck. Ökningen av perfusionsflödet i zon 3 beror på att kapillärerna distend, konditionerar öppningen av ett maximalt antal lungkärl.
Systemets enhet består av sju moduler: två analoga givareförstärkare moduler (TAM-A) utrustade med en analog LED-stapelgrafsignal för att övervaka dynamiska signaler (blodtryck, andningsluftflöde, sammandragningskraft etc.), en digital givareförstärkaremodul (TAM-D) med en digital numerisk display utformad för att övervaka långsamt föränderliga pulsatila signaler; En servostyrenhet för perfusionsmodul (SCP) som fungerar tillsammans med TAM-A- och TAM-D-förstärkare för perfusionskontroll av isolerade organperfusioner med hjälp av den peristaltiska pumpen, kan pumphastigheten ställas in i konstant tryckläge eller styras manuellt genom SCP; En ödembalansmodul (EBM) som mäter lungvikten; en ventilationsstyrningsmodul (VCM) för att styra positiv och undertrycksventilation och en timerräknaremodul (TCM) som kan ställas in för att utlösa VCM för att utföra djupa inspirationscykler.
Den höga globala prevalensen av lung- och andningskärlek och begränsningarna av nuvarande terapeutiska alternativ tvingar fram en större efterfrågan på lungtransplantationer, eftersom det fortfarande är guldstandardbehandlingen för patienter med terminal lungsjukdom18. Ex-vivo lungperfusionssystemet representerar en utmärkt plattform för att testa riktade terapier inom både grundläggande och klinisk forskning. På klinisk nivå kan ex-vivo perfusionssystemet användas för att utvärdera transplantatvävnad utanför kroppen, vilket gör det möjligt att testa det isolerade organet före transplantation, vilket hjälper till att samla kliniska data för en mer exakt prognostisk om transplantationens effektivitet. Rationell användning av det isolerade lungperfusionssystemet kan bidra till att optimera lungtransplantation kirurgi, vilket gör dem till ett säkrare och mer valbara förfarande. Den isolerade lungmodellen är också användbar i grundforskningen av avancerade diagnos- och terapitekniker såsom instillation av mesenkymala stamceller och andra immunmedierade terapier; många rapporter har visat potentialen i ex-vivo perfusion teknik som en plattform för att göra ytterligare forskning om pulmonell bevarande i utvecklingen av tekniker för att undvika ischemi-reperfusion skada och pulmonell ödem, förlänga organ livskraft15. Vissa felsökning steg och begränsningar som är associerade med den isolerade lungmodellen är främst den kort tillgängliga tiden för denna teknik för eventuell ödem generation induceras av lymfatiska dränering begränsning samt den systemiska effekten av tekniken. Kapillärfiltreringskoefficienten (Kfc) är ett tillförlitligt kriterium för att mäta funktionaliteten hos bevarad lungvävnad och fastställa omfattningen av ödem genom tiden. Ingen skillnad har hittats mellan de manuella och automatiska bestämningarna av Kfc19.
När användningen av det isolerade lungperfusionssystemet populariseras och nya terapier förändrar det kliniska landskapet, blir ex-vivo perfusionstekniken ett valfritt val för att förbättra patientresultat i olika lungpatologier, samt att öka poolen av potentiella lungdonatorer utan att kompromissa med mottagarens säkerhet, vilket lovar en ny era inom lungbevarande och lungtransplantation. Uppkomsten av Covid-19-pandemin och ökningen av KOL: s prevalens18,20 i den globala befolkningen belyser behovet av ytterligare grundforskning om lungfysiologi, lungbevarande och lungtransplantation, samt preklinisk forskning om nya terapier med utsikt mot translationell medicin. Dessutom är ex-vivo-kaninmodellen en tillgänglig och praktisk modell för att utbilda invånare och studenter inom området pulmonologi, särskilt de som arbetar med thoraxkirurgi och ECMO. Alla laboratorier som deltar i andnings- eller thoracopulmonära forskningsprotokoll uppmuntras att överväga det isolerade lungperfusionssystemet som en del av sina dagliga verktyg för sina experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka ph.D. Bettina Sommer Cervantes för hennes stöd i skrivandet av detta manuskript, och Kitzia Elena Lara Safont för hennes stöd med illustrationerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M.
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D.
- Alquicira-Mireles, J. Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Biología thesis (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Doctorado en Ciencias Biomédicas thesis (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE). , Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021).
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
