Summary
Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à des températures aussi élevées que 70 °C, avant la congélation pour les expériences cryo-EM.
Abstract
Les grilles d’échantillons pour les expériences de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) sont généralement préparées à une température optimale pour le stockage d’échantillons biologiques, principalement à 4 °C et parfois à température ambiante. Récemment, nous avons découvert que la structure protéique résolue à basse température peut ne pas être fonctionnellement pertinente, en particulier pour les protéines d’archées thermophiles. Une procédure a été développée pour préparer des échantillons de protéines à des températures plus élevées (jusqu’à 70 ° C) pour l’analyse cryo-EM. Nous avons montré que les structures provenant d’échantillons préparés à des températures plus élevées sont fonctionnellement pertinentes et dépendent de la température. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à haute température, en utilisant 55 °C comme exemple. L’expérience a utilisé un appareil de vitrification modifié à l’aide d’un tube de centrifugation supplémentaire, et les échantillons ont été incubés à 55 ° C. Les procédures détaillées ont été affinées pour minimiser la condensation de vapeur et obtenir une fine couche de glace sur la grille. Des exemples d’expériences réussies et infructueuses sont fournis.
Introduction
La technologie cryo-EM pour résoudre les structures des complexes protéiques a continué à s’améliorer, en particulier dans le sens de l’obtention de structures à haute résolution 1,2. Entre-temps, le paysage de son application a également été élargi en variant les conditions d’échantillon telles que le pH ou les ligands avant le processus de vitrification3, qui implique la préparation de grilles d’échantillons suivie de la congélationplongeante 4,5. Une autre condition importante est la température. Bien que les expériences cryo-EM, comme la cristallographie aux rayons X, soient effectuées à basse température, la structure résolue par cryo-EM reflète la structure à l’état de solution avant la vitrification. Jusqu’à récemment, la majorité des études cryo-EM d’analyse par particules uniques (SPA) utilisent des échantillons conservés sur de la glace (c.-à-d. à 4 °C) avant la vitrification6, bien qu’un certain nombre d’études utilisent des échantillons à une température ambiante d’environ 7,8,9,10 ou aussi élevée que 42 °C 11. Dans un rapport récent, nous avons effectué des études dépendantes de la température de l’enzyme cétol-acide réductatosomerase (KARI) de l’archéon thermophile Sulfolobus solfataricus (Sso) à six températures différentes de 4 ° C à 70 ° C12. Nos études suggèrent qu’il est important de préparer des grilles d’échantillons à des températures fonctionnellement pertinentes et que la cryo-EM est la seule méthode structurelle pratiquement réalisable pour résoudre la structure du même complexe protéique à plusieurs températures.
La principale difficulté pour la vitrification à haute température est de minimiser la condensation de vapeur et d’obtenir de la glace mince. Nous rapportons ici le protocole détaillé utilisé pour préparer des grilles d’échantillons à haute température dans notre étude précédente du Sso-KARI 12. Nous supposons que les lecteurs ou les téléspectateurs ont déjà de l’expérience dans les procédures globales de préparation des échantillons et de traitement des données pour les expériences cryo-EM et mettons l’accent sur les aspects pertinents pour les températures élevées.
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Protocol
NOTE: Ce protocole vise à utiliser un appareil de vitrification commerciale modifié pour préparer les échantillons de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à des températures spécifiques, en particulier supérieures à 37 ° C. La configuration expérimentale globale est illustrée à la figure 1. Le protocole utilise 55 °C comme exemple. Pour les conditions spécifiques à d’autres températures, veuillez vous référer au tableau supplémentaire 2 de la référence12.
1. Préparation de l’appareil de vitrification
- Faites un trou de 1 cm dans un tube centrifuge de 50 ml à son extrémité fermée.
- Placer le tube dans la chambre de l’appareil de vitrification à la sortie d’eau ultrasonique, comme indiqué à la figure 2.
REMARQUE: Le but est de minimiser la condensation de l’eau en guidant la vapeur d’eau vers l’échangeur de chaleur à travers le tube avant d’atteindre toute la chambre. - Régler la température de l’appareil de vitrification à la température spécifiée (par exemple, 55 °C, comme illustré à la figure 3) et laisser la chambre de l’appareil de vitrification atteindre 55 °C et 100 % d’humidité relative. Laissez reposer pendant au moins une demi-heure pour stabiliser les conditions avant de commencer l’expérience.
2. Réchauffer l’échantillon et les outils
- Placez le bain-marie sur une plaque chauffante et réglez la plaque chauffante à la température souhaitée (ici 55 °C). Vérifiez avec un thermomètre que l’eau atteint 55 °C.
- Incuber l’échantillon au bain-marie et préchauffer l’embout de la pipette sur le bord de la plaque chauffante pendant 2 minutes ou plus avant l’expérience de buvardage.
REMARQUE: Le réglage de température le plus élevé pour la chambre de l’appareil de vitrification est de 60 ° C. Pour préparer des grilles de température plus élevées pour l’expérience cyro-EM (par exemple, 70 °C), l’échantillon est incubé dans le bain-marie à 80 °C, et la moyenne entre la température de l’échantillon et la température de l’appareil de vitrification est estimée à la température réelle de l’échantillon sur la grille (70 °C dans ce cas). Voir la section Discussion pour plus de détails et les limites de cette estimation.
3. Préparation à l’expérience de buvard
- Décharge luminescente d’une grille supportée par du carbone à 25 mA pendant 30 s, ou alternative aux valeurs en fonction du dispositif utilisé.
- Incuber la pince à épiler avec la grille dans l’appareil de vitrification pendant 2 minutes ou plus.
- Remplissez le récipient d’éthane avec de l’éthane selon les procédures standard. Ne laissez pas l’éthane déborder.
REMARQUE: Cette étape prend environ 10 minutes et doit être suivie immédiatement avec l’expérience de buvard pour éviter le gel. - Placez le papier filtre de vitrification dans la chambre de l’appareil de vitrification au plus tôt 5 minutes avant l’expérience de buvardage.
REMARQUE: Placer le papier filtre dans la chambre trop tôt le rendra trop humide.
4. Expérience de buvard
REMARQUE : Lorsque vous tenez la grille, assurez-vous qu’elle est stable et qu’il y a une zone de contact minimale avec la pince à épiler (Figure 4). Ceci est fait pour maintenir la meilleure efficacité de refroidissement de l’éthane et pour éviter la glace non vitreuse.
- Utilisez une pointe de pipette pour appliquer 7 à 9 μL de l’échantillon sur la grille. Ensuite, attendez 1-2 s, épongez pendant 1-1,5 s et plongez rapidement l’échantillon à l’éthane liquide.
- Transférez la grille de l’éthane liquide à la boîte cryogénique, qui est stockée dans de l’azote liquide.
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée très soigneusement car la pince à épiler est encore chaude, de sorte que tout le réservoir de refroidissement est plein de vapeur à ce moment-là.
5. Contrôle de qualité des réseaux
- Coupez les grilles et téléchargez-les sur un instrument cryo-EM.
- Utilisez l’écran d’affichage de l’instrument cryo-EM et la fonction de faible dose du logiciel pour examiner l’état de la glace sur la grille et la distribution de l’échantillon sur la grille.
NOTE: Souvent, les grilles sont très sèches ou la couche de glace est trop épaisse. Le taux de réussite des grilles préparées à haute température est nettement inférieur à celui à température ambiante ou à 4 °C. Les résultats représentatifs des bonnes grilles et des grilles non satisfaisantes sont présentés dans la section suivante. - Si la qualité de la grille résultante n’est pas bonne, répétez le processus de préparation de la grille avec des conditions variées (telles que le temps d’attente, le temps de buvardage, etc.). Si la qualité de la grille résultante est bonne, répétez les mêmes étapes pour créer des grilles à une température différente.
6. Collecte des données
- Transférer les grilles de bonne qualité sur un instrument cryo-EM haute résolution.
- Effectuer la collecte et l’analyse des données selon les procédures établies.
REMARQUE: Comme indiqué dans notre publication précédente, la résolution de la structure n’est pas affectée par la température élevée12.
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Representative Results
La vue d’ensemble du faible grossissement est illustrée à la figure 5A,B. Le panneau A est un exemple de grille réussie. Il y a un gradient de glace du haut à gauche (plus épais) au bas à droite (plus mince ou vide). Une telle grille facilite la recherche d’une épaisseur appropriée de la couche de glace dans la zone médiane adaptée à la collecte de données, comme les cases bleue et verte. La grille B est trop sèche. Les carrés de la grille ont un contraste lumineux, ce qui signifie que la couche de glace est trop mince ou qu’il n’y a pas de couche de glace du tout. Seuls les deux carrés indiqués par les flèches rouges conviennent à la collecte de données.
De plus, des exemples d’images à faible dose provenant de différentes grilles sont présentés à la figure 5C,D. L’image du panneau C montre que la majeure partie de la glace est sous forme cristalline, ne convenant pas à la collecte de données. D’autre part, l’image du panneau D montre que la couche de glace est principalement dans un état amorphe, adapté à la collecte de données.
Veuillez noter qu’il s’agit d’un court document axé sur la préparation du réseau à haute température. La grille contient uniquement l’échantillon pour la collecte de données. Une bonne grille a de bonnes chances, mais pas une chance certaine, de générer de bonnes données pour résoudre une structure à haute résolution. Les données réelles de cryo-EM et les structures finales des exemples décrits dans cet article sont déjà décrites dans l’articlepublié 12. En bref, nous avons obtenu des grilles suffisamment bonnes pour la collecte de données, résolu les structures de deux complexes Sso-KARI à six températures différentes chacun, et comparé les structures de différentes températures pour chaque complexe, ainsi que les structures entre les deux complexes à partir de la même température. Les résultats indiquent que la structure de chaque complexe dépend de la température et que les changements dépendants de la température sont différents entre les deux complexes. Il est important de noter que les changements structurels successifs sont bien corrélés avec les changements de température successifs, ce qui est une indication forte du succès de la préparation de la grille d’échantillonnage en fonction de la température.
Figure 1 : Configuration expérimentale globale pour la préparation d’échantillons cryo-EM à haute température. Les articles présentés comprennent un appareil de vitrification, un incubateur, une minuterie, le placement de l’embout de pipette, un réservoir de refroidissement et une pince à épiler. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Modification de la chambre de l’appareil de vitrification. Un tube de 50 mL est installé à la sortie de pulvérisation par ultrasons comme indiqué par la flèche rouge12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Aspect de l’appareil de vitrification au cours de l’expérience. L’écran affiche la température à 55 °C et l’humidité à 100%. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Utilisation d’une pince à épiler pour saisir la grille. Il est recommandé que la pince à épiler saisisse la grille avec le moins de contact possible, mais elle doit pouvoir maintenir la grille de manière stable pendant le processus de l’opération. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résultats représentatifs : vérification de la grille par Cryo-EM. (A,B) montrent l’état général de la grille. (C,D) montrent des exemples d’images à faible dose provenant de différentes grilles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
À l’étape 1 du protocole, assurez-vous que le tube de centrifugation a été bien installé et ne tombe pas lorsque l’expérience est en cours. En raison de l’accumulation d’un grand nombre de gouttelettes d’eau dans la chambre, ce qui pourrait modifier la capacité d’adsorption du papier filtre, il est recommandé de ne pas dépasser 30 minutes après que la chambre de l’appareil de vitrification ait atteint la température d’équilibre. Si le temps de fonctionnement dépasse 30 min, l’opérateur doit remplacer le papier filtre et attendre que la cabine équilibre à nouveau la température et l’humidité. À l’étape 8 du protocole, le volume d’échantillon suggéré de 7 à 9 μL est plus important que d’habitude, sinon l’échantillon s’évapore rapidement à haute température, ce qui entraîne des carrés vides sur la grille. D’autre part, il est fortement recommandé que l’échantillon appliqué ne dépasse pas 9 μL. Sinon, il est très probable que l’échantillon s’égouttera pendant le processus de déplacement de la pince à épiler avant le buvardage. Dans l’ensemble, une clé du succès de cette technique est la préhension stable et rapide des grilles et l’exécution correcte et stable de chaque action limitée dans le temps. En outre, il est recommandé que chaque série d’expériences ne porte que sur une température élevée spécifique. Avant de procéder à l’expérience à une autre température, tous les systèmes doivent être complètement récupérés et réinitialisés.
En raison de la température élevée et de l’humidité élevée de la chambre, la fenêtre est souvent recouverte de brouillard, ce qui entraîne des difficultés à lancer l’expérience. L’utilisation d’un peu de savon est recommandée pour dégager la fenêtre. Si les grilles ne sont pas bonnes, les raisons possibles sont que les étapes décrites ci-dessus ne sont pas suivies avec précision et/ou que les étapes prennent trop de temps. Essayez de répéter la préparation des grilles d’échantillons avec précision et rapidité. Si les grilles ne sont toujours pas bonnes après les répétitions, essayez d’ajuster les conditions. Le problème le plus fréquent observé dans cette expérience est l’absence de glace sur la grille à haute température. Si c’est le cas, essayez de réduire davantage le temps de buvardage. Par contre, si la glace est trop épaisse, essayez d’augmenter le temps de buvardage.
Une limitation du cryo-EM à haute température est que la température de chauffage maximale sur l’appareil de vitrification est de 60 °C. Pour atteindre la température la plus élevée, l’échantillon a été chauffé au-dessus de 60 °C (p. ex. 80 °C), et la moyenne entre la température de l’échantillon et la température de vitrification a été estimée à la température réelle de l’échantillon sur la grille (70 °C, dans ce cas). Il pourrait y avoir une certaine inexactitude basée sur cette estimation. Une solution future possible consiste à construire un thermocouple pour mesurer la température du réseau avec précision juste avant le congélation. Une autre limitation potentielle est la stabilité de la protéine à haute température. Une expérience distincte utilisant le dichroïsme circulaire doit être effectuée pour s’assurer que la protéine est stable à la température pour l’expérience cryo-EM prévue.
Une autre limitation est que seuls deux types d’appareils de vitrification disponibles dans le commerce peuvent être chauffés à plus de 37 °C et jusqu’à 60 °C comme mentionné ci-dessus (par exemple, Thermo Fischer Vitrobot et Leica EM-GP). Les appareils de vitrification d’autres vendeurs sont soit limités à température ambiante, soit réglables uniquement entre 4 °C et 37 °C. Cependant, il est possible pour les groupes de recherche de construire leurs propres appareils plongeants avec des plages de température étendues à l’avenir.
Notre protocole est modifié à partir des protocoles existants 4,5,6, dans le but de préparer les grilles à des températures supérieures à la température ambiante. Sans apporter les modifications décrites ici, les chances de succès pour fabriquer de bonnes grilles d’échantillons à haute température adaptées à la collecte d’images cryo-EM sont très faibles.
Deux articles en 2019 ont démontré que les structures protéiques dépendent de la température, en corrélation avec la dépendance à la température des fonctions protéiques, dans la plage de 4 °C à 42 °C pour le canal TRP TRPV311 et de 4 °C à 70 °C pour Sso-KARI 12. Ces rapports sont susceptibles d’encourager un changement dans la recherche cryo-EM dans la mesure où davantage d’études futures seront effectuées à des températures fonctionnellement pertinentes, généralement à 37 ° C. La stabilité de la protéine purifiée à cette température pourrait être une préoccupation. Cependant, il est nécessaire d’incuber l’échantillon de protéines à cette température pendant seulement 2 minutes selon notre protocole. Alternativement, les conditions physiologiques peuvent être obtenues en imageant les protéines dans les cellules en utilisant la tomographie et la moyenne sous-tomo. De plus, la cryo-EM peut être utilisée pour étudier le mécanisme et les intermédiaires du déploiement des protéines à des températures élevées, probablement dans la plage de 40 °C à 80 °C. Ces études bénéficieront toutes du protocole décrit ici.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Hervé Remigy de Thermo Fisher Scientific pour ses précieux conseils. Les expériences cryo-EM ont été réalisées à l’Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). L’ASCEM est soutenue par l’Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) et Taiwan Protein Project (Grant No. AS-KPQ-109-TPP2). Les auteurs remercient également Mme Hui-Ju Huang pour son aide dans la préparation des échantillons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
