Summary
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת רשתות דגימה בטמפרטורות של עד 70 מעלות צלזיוס, לפני שקיפאון הצניחה לניסויי cryo-EM.
Abstract
רשתות הדגימות לניסויים במיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) מוכנות בדרך כלל בטמפרטורה אופטימלית לאחסון דגימות ביולוגיות, לרוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולעיתים בטמפרטורת החדר. לאחרונה גילינו שמבנה החלבון שנפתר בטמפרטורה נמוכה עשוי שלא להיות רלוונטי מבחינה תפקודית, במיוחד עבור חלבונים מארכאה תרמופילית. פותח הליך להכנת דגימות חלבון בטמפרטורות גבוהות יותר (עד 70 מעלות צלזיוס) לניתוח cryo-EM. הראינו שהמבנים מדגימות שהוכנו בטמפרטורות גבוהות יותר רלוונטיים מבחינה פונקציונלית ותלויים בטמפרטורה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת רשתות מדגם בטמפרטורה גבוהה, תוך שימוש ב- 55 מעלות צלזיוס כדוגמה. הניסוי עשה שימוש במנגנון ויטריפיקציה ששונה באמצעות צינור צנטריפוגה נוסף, ודגימות דוגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. הנהלים המפורטים היו מכווננים כדי למזער את עיבוי האדים ולקבל שכבה דקה של קרח על הרשת. דוגמאות לניסויים מוצלחים ולא מוצלחים מסופקים.
Introduction
טכנולוגיית cryo-EM לפתרון מבנים של קומפלקסים חלבונים המשיכה להשתפר, במיוחד בכיוון של קבלת מבנים ברזולוציה גבוהה 1,2. בינתיים, הנוף של היישום שלה הורחב גם על ידי שינוי תנאי הדגימה כגון pH או ליגנדות לפני תהליך vitrification3, הכולל הכנת רשתות דגימה ואחריו הקפאת צלילה 4,5. תנאי חשוב נוסף הוא הטמפרטורה. למרות שניסויי cryo-EM, כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, מבוצעים בטמפרטורות נמוכות, המבנה שנפתר על ידי cryo-EM משקף את המבנה במצב התמיסה לפני הוויטריפיקציה. עד לאחרונה, רוב מחקרי הקריו-EM של ניתוח חלקיקים בודדים (SPA) משתמשים בדגימות שנשמרות על קרח (כלומר, ב-4 מעלות צלזיוס) לפני ויטריפיקציה6, אם כי מספר מחקרים משתמשים בדגימות בטמפרטורת החדרסביב 7,8,9,10 או עד 42 מעלות צלזיוס 11. בדו"ח שפורסם לאחרונה, ביצענו מחקרים תלויי טמפרטורה של האנזים קטול-חומצה רדוקטויזומראז (KARI) מהארכיאון התרמופילי סולפולובוס סולפטריקוס (Sso) בשש טמפרטורות שונות מ-4 מעלות צלזיוס עד 70 מעלות צלזיוס12. המחקרים שלנו מצביעים על כך שחשוב להכין רשתות דגימה בטמפרטורות רלוונטיות מבחינה פונקציונלית וכי cryo-EM היא השיטה המבנית היחידה האפשרית למעשה לפתרון המבנה של אותו קומפלקס חלבונים בטמפרטורות מרובות.
הקושי העיקרי לוויטריפיקציה בטמפרטורות גבוהות הוא למזער את עיבוי האדים ולהשיג קרח דק. כאן אנו מדווחים על הפרוטוקול המפורט המשמש להכנת רשתות מדגם בטמפרטורות גבוהות במחקר הקודם שלנו על Sso-KARI 12. אנו מניחים שהקוראים או הצופים כבר מנוסים בהליכי הכנת המדגם הכוללים ועיבוד הנתונים לניסויים cryo-EM ומדגישים את ההיבטים הרלוונטיים לטמפרטורה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה נועד להשתמש במנגנון ויטריפיקציה מסחרי שונה כדי להכין את דגימות מיקרוסקופיית הקריו-אלקטרונים (cryo-EM) בטמפרטורות ספציפיות, גבוהות במיוחד מ-37 מעלות צלזיוס. מערך הניסוי הכולל מוצג באיור 1. הפרוטוקול משתמש ב-55 מעלות צלזיוס כדוגמה. לגבי התנאים הספציפיים בטמפרטורות אחרות, עיין בטבלה משלימה 2 בהפניה12.
1. הכנת מנגנון הוויטריפיקציה
- צור חור של 1 ס"מ בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בקצה הסגור שלו.
- הניחו את הצינור בתא מנגנון הוויטריפיקציה בשקע המים העל-קולי, כפי שמוצג באיור 2.
הערה: המטרה היא למזער את עיבוי המים על ידי הנחיית אדי מים למחליף החום דרך הצינור לפני שהם מגיעים לכל התא. - הגדירו את טמפרטורת מנגנון הוויטריפיקציה לטמפרטורה שצוינה (למשל, 55 מעלות צלזיוס, כפי שמוצג באיור 3), ואפשרו לתא מנגנון הוויטריפיקציה להגיע ל-55 מעלות צלזיוס וללחות יחסית של 100%. תן לו לעמוד לפחות חצי שעה כדי לייצב את התנאים לפני תחילת הניסוי.
2. חימום המדגם והכלים
- מניחים את אמבט המים על פלטה חמה ומכוונים את הפלטה לטמפרטורה הרצויה (כאן 55 מעלות צלזיוס). בדוק עם מדחום כדי לוודא שהמים מגיעים ל -55 מעלות צלזיוס.
- דגירה של הדגימה באמבט המים וחמם מראש את קצה הפיפטה בקצה הפלטה למשך 2 דקות או יותר לפני ניסוי ההכתמה.
הערה: הגדרת הטמפרטורה הגבוהה ביותר עבור תא מנגנון הוויטריפיקציה היא 60 °C. כדי להכין רשתות טמפרטורה גבוהות יותר לניסוי cyro-EM (למשל, 70 מעלות צלזיוס), הדגימה דוגרת באמבט המים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס, והממוצע בין טמפרטורת הדגימה לטמפרטורת מנגנון הוויטריפיקציה מוערך כטמפרטורה בפועל של הדגימה ברשת (70 מעלות צלזיוס במקרה זה). עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים ומגבלות על אומדן זה.
3. הכנה לניסוי הכתמים
- Glow לפרוק רשת הנתמכת בפחמן חורי ב-25 mA למשך 30 שניות, או חלופה לערכים בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש.
- לדגום את הפינצטה עם הרשת במנגנון vitrification במשך 2 דקות או יותר.
- מלאו את מיכל האתאן באתאן על פי הנהלים הסטנדרטיים. אל תתנו לאתאן לעלות על גדותיו.
הערה: שלב זה אורך כ-10 דקות ויש לעקוב אחריו מיד עם ניסוי הכתם כדי למנוע קפיאה. - הכניסו את נייר הסינון של הוויטריפיקציה לתא מנגנון הוויטריפיקציה לא לפני 5 דקות לפני ניסוי ההכתמה.
הערה: הצבת נייר הסינון בתא מוקדם מדי תגרום לו להיות רטוב מדי.
4. ניסוי הכתמה
הערה: כשאתם מחזיקים את הרשת, ודאו שהרשת יציבה ושיש אזור מגע מינימלי עם הפינצטה (איור 4). זה נעשה כדי לשמור על יעילות הקירור הטובה ביותר של אתאן וכדי למנוע קרח שאינו זגוגי.
- השתמש בקצה פיפטה כדי להחיל 7-9 μL של הדגימה על הרשת. לאחר מכן המתן 1-2 שניות, כתם במשך 1-1.5 שניות, וצלל במהירות את הדגימה לאתאן נוזלי.
- מעבירים את הרשת מאתאן נוזלי לקופסת הקריו, המאוחסנת בחנקן נוזלי.
הערה: שלב זה חייב להתבצע בזהירות רבה מכיוון שהפינצטה עדיין חמה, כך שמיכל מיכל הקירור מלא באדים בשלב זה.
5. בדיקת איכות לרשתות
- גזור את הרשתות והעלה אותן למכשיר cryo-EM.
- השתמש במסך התצוגה של מכשיר cryo-EM ובפונקציית המינון הנמוך של התוכנה כדי לסנן את מצב הקרח ברשת ואת התפלגות הדגימה ברשת.
הערה: לעתים קרובות, הרשתות יבשות מאוד, או ששכבת הקרח עבה מדי. שיעור ההצלחה של הרשתות שהוכנו בטמפרטורות גבוהות נמוך משמעותית מזה שבטמפרטורת החדר או 4 מעלות צלזיוס. תוצאות מייצגות של רשתות טובות ורשתות לא משביעות רצון מוצגות בסעיף הבא. - אם איכות הרשת המתקבלת אינה טובה, חזור על תהליך הכנת הרשת בתנאים מגוונים (כגון זמן המתנה, זמן הכתמה וכו '). אם איכות הרשת המתקבלת טובה, חזור על אותם שלבים כדי ליצור רשתות בטמפרטורה שונה.
6. איסוף נתונים
- העבר את הרשתות באיכות טובה למכשיר cryo-EM ברזולוציה גבוהה.
- ביצוע איסוף נתונים וניתוח נתונים על פי נהלים שנקבעו.
הערה: כפי שמוצג בפרסום הקודם שלנו, הרזולוציה של המבנה אינה מושפעת מהטמפרטורה הגבוהה12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירת ההגדלה הנמוכה מוצגת באיור 5A,B. לוח A הוא דוגמה לרשת מוצלחת. יש שיפוע קרח משמאל למעלה (עבה יותר) לימין למטה (דק יותר או ריק). רשת כזו מקלה על מציאת עובי מתאים של שכבת הקרח באזור האמצעי המתאים לאיסוף נתונים, כגון הקופסאות הכחולות והירוקות. הרשת B יבשה מדי. לריבועים ברשת יש ניגודיות בהירה, כלומר שכבת הקרח דקה מדי או שאין שכבת קרח כלל. רק שני הריבועים המצוינים על ידי החצים האדומים מתאימים לאיסוף נתונים.
יתר על כן, דוגמאות לתמונות במינון נמוך מרשתות שונות מוצגות באיור 5C,D. התמונה בלוח C מראה שרוב הקרח הוא בצורה גבישית, ולא מתאים לאיסוף נתונים. מצד שני, תמונה בלוח D מראה ששכבת הקרח נמצאת ברובה במצב אמורפי, המתאים לאיסוף נתונים.
שימו לב שמדובר במאמר קצר המתמקד בהכנת רשת בטמפרטורות גבוהות. הרשת מכילה רק את הדוגמה לאיסוף נתונים. לרשת טובה יש סיכוי טוב, אם כי לא סיכוי מובהק, לייצר נתונים טובים לפתרון מבנה ברזולוציה גבוהה. נתוני cryo-EM האמיתיים והמבנים הסופיים עבור הדוגמאות המתוארות במאמר זה מתוארים כבר במאמר שפורסם12. בקיצור, השגנו רשתות מספיק טובות לאיסוף נתונים, פתרנו את המבנים של שני מתחמי Sso-KARI בשש טמפרטורות שונות כל אחד, והשווינו את המבנים מטמפרטורות שונות עבור כל מתחם, כמו גם את המבנים בין שני הקומפלקסים מאותה טמפרטורה. התוצאות מצביעות על כך שהמבנה של כל קומפלקס תלוי טמפרטורה ושהשינויים תלויי הטמפרטורה שונים בין שני הקומפלקסים. חשוב לציין שהשינויים המבניים העוקבים מתואמים היטב עם שינויי הטמפרטורה העוקבים, המהווים אינדיקציה חזקה להצלחת הכנת רשת הדגימה התלויה בטמפרטורה.
איור 1: מערך הניסוי הכולל להכנת דגימת cryo-EM בטמפרטורה גבוהה. הפריטים המוצגים כוללים מנגנון ויטריפיקציה, אינקובטור, טיימר, מיקום קצה פיפטה, מיכל קירור ופינצטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שינוי של תא מנגנון הוויטריפיקציה. צינור 50 מ"ל מותקן בשקע ריסוס קולי כפי שצוין על ידי החץ האדום12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הופעת מנגנון הוויטריפיקציה במהלך הניסוי. המסך מציג את הטמפרטורה ב 55 מעלות צלזיוס ואת הלחות ב 100%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: שימוש בפינצטה כדי לתפוס את הרשת. מומלץ שהפינצטה תאחז ברשת עם כמה שפחות מגע, אך עליה להיות מסוגלת להחזיק את הרשת ביציבות במהלך הפעולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תוצאות מייצגות: בדיקת רשת על ידי Cryo-EM. (A,B) מציג את המצב הכולל של הרשת. (C,D) מציגות דוגמאות של תמונות במינון נמוך מרשתות שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשלב 1 של הפרוטוקול, ודא שצינור הצנטריפוגה הותקן היטב ואינו נופל כאשר הניסוי בעיצומו. בשל הצטברות של מספר רב של טיפות מים בתא, אשר יכול לשנות את יכולת ספיחה של נייר הסינון, מומלץ כי הזמן הכולל של הניסוי לא יעלה על 30 דקות לאחר שתא מנגנון הוויטריפיקציה הגיע לטמפרטורת שיווי המשקל. אם זמן הפעולה עולה על 30 דקות, המפעיל צריך להחליף את נייר הסינון ולהמתין עד שהתא יאזן שוב את הטמפרטורה והלחות. בשלב 8 של הפרוטוקול, נפח הדגימה המוצע של 7-9 μL גדול מהרגיל מכיוון שאחרת, הדגימה מתאדה במהירות בטמפרטורה גבוהה, מה שמוביל לריבועים ריקים ברשת. מצד שני, מומלץ מאוד כי המדגם מוחל אינו עולה על 9 μL. אחרת, סביר מאוד שהדגימה תטפטף במהלך תהליך הזזת הפינצטה לפני ההכתמה. בסך הכל, המפתח להצלחה של טכניקה זו הוא אחיזה יציבה ומהירה של רשתות וביצוע נכון ויציב של כל פעולה מוגבלת בזמן. יתר על כן, מומלץ שכל סבב ניסויים יעסוק בטמפרטורה גבוהה ספציפית אחת בלבד. לפני שתמשיך לבצע את הניסוי בטמפרטורה אחרת, יש לשחזר את כל המערכות באופן מלא ולאפס אותן.
בשל הטמפרטורה הגבוהה והלחות הגבוהה של החדר, החלון מכוסה לעתים קרובות בערפל המוביל לקשיים בהשקת הניסוי. מומלץ להשתמש במעט סבונים כדי לנקות את החלון. אם הרשתות אינן טובות, הסיבות האפשריות הן שהשלבים שתוארו לעיל אינם מתבצעים במדויק ו/או שהצעדים נמשכים זמן רב מדי. נסה לחזור על הכנת רשתות מדגם בדייקנות ובמהירות. אם הרשתות עדיין לא טובות לאחר חזרות, נסה להתאים את התנאים. הבעיה השכיחה יותר שנצפתה בניסוי זה היא שאין קרח על הרשת בטמפרטורה הגבוהה. אם כן, נסו לקצר עוד יותר את זמן ההכתמה. מצד שני, אם הקרח עבה מדי, נסו להאריך את זמן ההכתמה.
מגבלה של cryo-EM בטמפרטורה גבוהה היא כי טמפרטורת החימום המקסימלית על מנגנון vitrification הוא 60 °C (60 °F). כדי להגיע לטמפרטורה הגבוהה יותר, הדגימה חוממה מעל 60 מעלות צלזיוס (למשל, 80 מעלות צלזיוס), והממוצע בין טמפרטורת הדגימה לטמפרטורת הוויטריפיקציה הוערך כטמפרטורה האמיתית של הדגימה ברשת (70 מעלות צלזיוס, במקרה זה). יכול להיות אי דיוק מסוים על סמך הערכה זו. פתרון עתידי אפשרי הוא לבנות thermocouple כדי למדוד את טמפרטורת הרשת במדויק ממש לפני הקפאת הצניחה. מגבלה פוטנציאלית נוספת היא יציבות החלבון בטמפרטורות גבוהות. יש לבצע ניסוי נפרד באמצעות דיכרואיזם מעגלי כדי להבטיח שהחלבון יציב בטמפרטורה של ניסוי cryo-EM המתוכנן.
מגבלה נוספת היא שרק שני סוגים של מכשירי ויטריפיקציה זמינים מסחרית יכולים להיות מחוממים מעל 37 מעלות צלזיוס ועד 60 מעלות צלזיוס כאמור לעיל (למשל, תרמו פישר ויטרובוט ולייקה EM-GP). מנגנוני הוויטריפיקציה של ספקים אחרים מוגבלים לטמפרטורת החדר או מתכווננים רק בין 4 °C ל-37 °C. עם זאת, קבוצות מחקר יכולות לבנות מכשירי צלילה משלהם עם טווחי טמפרטורה מורחבים בעתיד.
הפרוטוקול שלנו שונה מפרוטוקוליםקיימים 4,5,6, במטרה להכין את הרשתות בטמפרטורות גבוהות מטמפרטורת החדר. מבלי לבצע את השינויים המתוארים כאן, הסיכוי להצלחה ביצירת רשתות דגימה טובות בטמפרטורה גבוהה המתאימות לאיסוף תמונות cryo-EM הוא קטן מאוד.
שני מאמרים בשנת 2019 הראו כי מבני חלבון הם תלויי טמפרטורה, בקורלציה עם התלות בטמפרטורה של פונקציות חלבון, בטווח של 4 °C עד 42 °C עבור ערוץ TRP TRPV311 ו 4 °C עד 70 °C עבור Sso-KARI 12. דיווחים אלה עשויים לעודד שינוי במחקרי cryo-EM בכך שמחקרים עתידיים נוספים יבוצעו בטמפרטורות רלוונטיות מבחינה תפקודית, בדרך כלל ב-37 מעלות צלזיוס. היציבות של החלבון המטוהר בטמפרטורה זו עלולה להוות דאגה. עם זאת, הוא נדרש לדגום את דגימת החלבון בטמפרטורה זו למשך 2 דקות בלבד על פי הפרוטוקול שלנו. לחלופין, ניתן להשיג מצבים פיזיולוגיים על ידי הדמיית חלבונים בתאים באמצעות טומוגרפיה וממוצע תת-טומו. יתר על כן, cryo-EM יכול לשמש כדי לחקור את המנגנון ואת ביניים של חלבון מתפתח בטמפרטורות גבוהות, ככל הנראה בטווח של 40 °C עד 80 °C (80 °F). כל המחקרים הללו ייהנו מהפרוטוקול המתואר כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר הרבה רמיגי מתרמו פישר סיינטיפיק על עצות מועילות. ניסויי הקריו-EM בוצעו במתקן האקדמיה סיניקה קריו-EM (ASCEM). ASCEM נתמך על ידי האקדמיה הסינית (מענק לא. AS-CFII-108-110) ופרויקט החלבון של טייוואן (מענק מס' AS-KPQ-109-TPP2). המחברים מודים גם לגב' הוי-ג'ו הואנג על הסיוע בהכנת הדגימה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
