Desarrollo de un modelo de cocultivo celular para imitar la isquemia/reperfusión cardíaca in vitro

Resumen

La distancia espacial es un parámetro clave en la evaluación de la lesión por hipoxia/reoxigenación en un modelo de cocultivo de capas separadas de células endoteliales y cardiomiocitarias, lo que sugiere, por primera vez, que la optimización del entorno espacial de cocultivo es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las células endoteliales en la protección de los cardiomiocitos.

Resumen

La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo. La reperfusión causa lesiones adicionales más allá de la isquemia. Las células endoteliales (CE) pueden proteger a los cardiomiocitos (CM) de la lesión por reperfusión a través de las interacciones célula-célula. Los cocultivos pueden ayudar a investigar el papel de las interacciones célula-célula. Un cocultivo mixto es el enfoque más simple, pero es limitado ya que los tratamientos aislados y los análisis posteriores de tipos de células individuales no son factibles. Para investigar si las CE pueden atenuar el daño de las células CM dependiendo de la dosis y si esta protección puede optimizarse aún más variando la distancia de contacto entre las dos líneas celulares, utilizamos células endoteliales de la arteria coronaria primaria de ratón y cardiomiocitos de ratón adulto para probar tres tipos de insertos de cultivo celular que variaron en su distancia de capa intercelular a 0,5, 1,0 y 2,0 mm, respectivamente. Solo en los CM, la lesión celular evaluada por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) aumentó significativamente durante la hipoxia y más adelante tras la reoxigenación cuando la distancia fue de 2,0 mm en comparación con 0,5 y 1,0 mm. Cuando los CE y los CM estaban en contacto casi directo (0,5 mm), solo hubo una atenuación leve de la lesión por reoxigenación de los CM después de la hipoxia. Esta atenuación aumentó significativamente cuando la distancia espacial fue de 1,0 mm. Con una distancia de 2,0 mm, las CE atenuaron la lesión de CM durante la hipoxia y la hipoxia / reoxigenación, lo que indica que es necesario un distanciamiento de cultivo suficiente para que las CE se diaguen con los CM, de modo que las moléculas de señal secretadas puedan circular y estimular completamente las vías protectoras. Nuestros hallazgos sugieren, por primera vez, que la optimización del entorno espacial de cocultivo CE/CM es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las CE en la protección contra la CM contra la lesión simulada de isquemia/reperfusión. El objetivo de este informe es proporcionar un enfoque paso a paso para que los investigadores utilicen este importante modelo a su favor.

Introducción

La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo ^1,2. Sin embargo, el proceso de tratamiento de la reperfusión puede causar la muerte de los cardiomiocitos, conocida como lesión por isquemia/reperfusión (IR) miocárdica, para la cual todavía no existe un remedio efectivo³. Se ha sugerido que las células endoteliales (CE) protegen los cardiomiocitos (CM) a través de la secreción de señales paracrinas, así como las interacciones de célula a célula⁴.

Los modelos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para investigar el papel de las interacciones célula-célula autocrina y /o paracrina en la función y diferenciación celular. Entre los modelos de cocultivo, el cocultivo mixto es el más simple, donde dos tipos diferentes de células están en contacto directo dentro de un solo compartimento de cultivo en una proporción celular deseada⁵. Sin embargo, los tratamientos separados entre tipos de células y el análisis posterior de un solo tipo de célula no son fácilmente factibles dada la población mixta.

Estudios previos indicaron que los insultos hipóxicos e isquémicos causan un daño significativo a la integridad de la membrana celular medido por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). Esta lesión empeora con la reoxigenación, imitando la lesión por reperfusión ^6,7,8. El objetivo del protocolo actual era probar las hipótesis de que la presencia de CE puede atenuar la pérdida de CM en la membrana celular causada por hipoxia y reoxigenación (HR) y que el efecto protector de las CE puede optimizarse variando la distancia de contacto entre las dos líneas celulares. Por lo tanto, empleamos tres tipos de insertos de cultivo celular y células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón y cardiomiocitos de ratón adulto. Los insertos, marcados por Corning, Merck Millipore y Greiner Bio-One, nos permitieron crear tres condiciones de diafonía de cultivo celular diferentes con distancias de línea intercelular de 0.5, 1.0 y 2.0 mm, respectivamente. Se enchaparon 100.000 CE por inserto en cada caso.

Además, para determinar si la densidad de LAS CE en el cocultivo contribuye a la atenuación de la lesión de la FC en este modelo, estudiamos la relación dosis-respuesta entre la concentración de CE y la liberación de LDH por los CM. Las CE se enchaparon en 25.000, 50.000 y 100.000 por inserto, respectivamente, en el inserto de 2,0 mm.

Este informe proporciona un enfoque paso a paso para que los investigadores utilicen este importante modelo a su favor.

Protocolo

1. Preparación/emplatado experimental

1. Mantenga los CM y ECs de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Descongele ambas líneas celulares cuando lleguen de los vendedores. Placa en matraces T25 después de ser lavada con medios frescos. Se recomienda comprar cada medio de cultivo celular de los mismos proveedores a los que se compraron las células. Al día siguiente, actualice las celdas con medios y úselos cuando sean confluentes.
   2. Mantener la incubadora de cultivo celular a 37 °C con 21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂ y mantenerla humidificada.
      NOTA: Las células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón utilizadas en este protocolo se aíslan de las arterias coronarias de ratones C57BL/6, y los cardiomiocitos de ratón adultos se aíslan de corazones de ratón adultos C57BL/6J y se obtienen comercialmente (ver Tabla de materiales).
2. Placas CM en condiciones estériles en el fondo de placas de 24 pocillos (capa inferior). 24 h más tarde, placa eCs en el inserto (o porción superior) del pozo de co-cultivo. 24 h después del recubrimiento EC, coloque los insertos EC sobre las bases de la placa CM, comenzando el período de cocultivo. Permita que las células se coculten durante al menos 12-24 h antes de su uso. Estos pasos se describen en detalle a continuación.
   1. Estimar la confluencia de la línea celular CM bajo un microscopio de luz. Cuando las células parezcan ser 90% -100% confluentes en matraces de cultivo, proceda con el recubrimiento experimental.
   2. Retire los medios de los matraces que contienen cultivos celulares confluentes y tripsinize con 3-5 ml de ácido tripsina/etilendiaminotetraacético (EDTA) para los matraces T25. Agite el matraz suavemente, incube a 37 ° C durante 2-5 min y luego evalúe el progreso enzimático bajo un microscopio de luz. Una vez que las celdas comiencen a redondearse, use un raspador de celdas para separar las celdas de la superficie.
   3. Después del desprendimiento, inactive la solución de tripsina agregando la solución de tripsina/célula a un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de medios para los matraces T25. Centrifugar la suspensión celular a 120 x g durante 2 min para obtener un pellet de células blandas. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 ml de medios.
   4. Para realizar el conteo celular y confirmar la viabilidad celular, mezcle una alícuota de 10 μL de células resuspendidas y 10 μL de colorante azul tripano. Cuente las células vivas usando un contador de células. Diluya las células con medios regulares frescos para lograr las densidades de siembra deseadas. Los volúmenes se calculan en función de la densidad de semillas deseada y la concentración celular de las soluciones madre. Todo el recubrimiento debe realizarse en condiciones estériles.
   5. Placas CM a densidades de siembra de 300,000 por pozo en el fondo de una placa de 24 pocillos pre-recubierta con matriz extracelular. Mantenga las células a 37 °C con 21% de O_{2 y} 5% de CO₂ durante la noche.
   6. Después de 24 h, las CE de placa se insertan a una densidad óptima de chapado de 100.000 por inserto (el área de cultivo es de 33,6 mm²), (Figura 1). Después de 24 h de recubrimiento EC, coloque insertos EC dentro de los pozos CM, iniciando el cocultivo. Permita que las células coculten durante 12-24 h antes de realizar los experimentos.
   7. Asegúrese de que, para cuando se realicen los experimentos, tanto los CM como los CE hayan alcanzado una confluencia del 80% al 90%.

2. Hipoxia/reoxigenación para simular lesión por isquemia/reperfusión in vitro

NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse como se describe, no se detenga en el medio.

1. Prepare los medios hipóxicos vertiendo ~ 25 ml de medios en un tubo cónico de 50 ml. Selle al aire la parte superior con una membrana de silicona y use una pipeta esterilizada para perforar un agujero. Cree otro agujero, esta vez dejando la pipeta sumergida aproximadamente 2/3 en el medio.
2. Enjuague el medio con gas hipóxico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) durante 5 min a un caudal de 30 L/min. Esto minimiza el O₂ disuelto en el medio cuando comienza la hipoxia (paso 2.5).
3. Deseche los medios de las placas de 24 pocillos o insertos de cultivo que contienen células adheridas y lave con 100 μL/pocillo de solución salina tamponada con fosfato al 10% (PBS) muy suavemente. Después, agregue 500 μL de los medios hipóxicos recién preparados a cada pocillo de las placas o insertos.
   NOTA: La hipoxia en los medios se interrumpe lo más brevemente posible durante este paso antes de que comience la hipoxia verdadera para las células y los medios en el paso 2.5.
   1. En el grupo de control normóxico, reemplace el medio original con medios normales frescos que contengan glucosa y suero.
4. Humidifique la cámara de hipoxia colocando una placa de Petri llena de agua estéril dentro de la cámara. A continuación, coloque las placas que comprenden los grupos hipóxicos en la cámara.
5. Enjuague la cámara de hipoxia con gas hipóxico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) durante 5 min a un caudal de 30 L/min. Coloque la cámara en la incubadora de 37 °C durante 24 h.
6. Después de la hipoxia, cultive CM y CE en condiciones normales. Para ello, deseche el medio viejo de las placas/insertos, reemplácelo por medio normal (que contenga glucosa y suero; 500 μL de cada pocillo/inserto) y guárdelo en la incubadora en condiciones normales de cultivo (21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂, 37 °C) durante 2 h para imitar la reperfusión.
7. Para controlar cualquier efecto del reemplazo de medios, cambie los medios de las células normóxicas al mismo tiempo que se cambian los medios hipóxicos.
   Nota : la figura 2 proporciona una descripción general esquemática de este protocolo.

3. Evaluación de endpoints

1. Transfiera los medios de cultivo celular de la placa de 24 pocillos a una placa de 96 pocillos. Use 200 μL de medios de cada pozo de la placa de 24 pocillos y distribuya equitativamente en cuatro pozos de la placa de 96 pocillos, en consecuencia. Use una placa cada una para normoxia versus hipoxia versus HR.
2. Determine el grado de lesión celular, por ejemplo, midiendo la absorbancia de la LDH utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad siguiendo las instrucciones del fabricante. Realice el ensayo en una placa de 96 pocillos según las instrucciones del protocolo de ensayo.

4. Estadísticas

1. Muestre los datos paramétricos como media/desviación estándar y los datos no paramétricos como gráficos de caja con rango mediano/intercuartílico. Se deben realizar pruebas de comparaciones múltiples paramétricas versus no paramétricas adecuadas con pruebas post-hoc aceptables para disminuir la posibilidad de un error de tipo 1. La significación se establece típicamente en un alfa de 0.05 (dos colas).
2. Para todos los experimentos llevados a cabo en el estudio actual, realice al menos tres réplicas de pozos dentro de un experimento. Hubo de tres a seis repeticiones de cada experimento utilizado para el análisis estadístico.

Resultados

Los tres tipos de insertos (A, B, C) utilizados en este experimento tienen el mismo tamaño de poro de 0,4 μm. La única diferencia entre ellos es la altura de inserción a base, que permite que las distancias entre las dos capas de células cocultivadas sean de 0,5, 1,0 y 2,0 mm, respectivamente, (Figura 3) y que sean de diferentes proveedores (para más detalles, consulte la Tabla de materiales).

Para establecer un modelo de cocultivo in vitro

Discusión

Pasos críticos en el protocolo
Se han utilizado modelos de cocultivo celular para estudiar los mecanismos celulares de cardioprotección. Cómo crear dos capas separadas con una distancia significativa entre ellas es, por lo tanto, crucial para el desarrollo de un modelo de co-cultura adecuado. Un desafío en el estudio de la lesión por IR simulada, es decir, la FC, es que no solo la isquemia (hipoxia) en sí, sino también la reperfusión (reoxigenación) agrava la disfunción celular. Por lo tanto, un model...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cardiomiocitos de ratón adulto (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Aislado de tejido cardíaco de ratón adulto C57BL/6J
Contador de células automatizado Countess II	Invitrogen	A27977	Recuento de células para el cálculo del número
de células Cabina de bioseguridad	Nuaire	NU425400	Campana estéril de cultivo
celular Medio de congelación de cultivo celular	Cell Biologics Inc	6916	Se utiliza para la congelación de células para el almacenamiento a largo plazo de líneas celulares
Incubadora de cultivo celular	Nuaire	Nu-5500	Para proporcionar condiciones de vida celular normales (21%O2, 5%COCO2, 74%N2, 37° C, humidificado)
Incubadora de cultivo celular Tanque de gas	A-L Gases comprimidos	UN1013	Gas necesario para la incubadora de cultivo celular
Insertos de cultivo celular A (0,5 mm)	Corning Inc	353095	utilizado para el cocultivo EC-CM
Insertos de cultivo celular B (1,0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	utilizado para el cocultivo EC-CM
Insertos de cultivo celular C (2,0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Utilizado para el cocultivo EC-CM
Centrífuga	Anstel Enterprises Inc	4235	Para el recubrimiento y el paso de cultivos celulares
Matraces de cultivo celular CMs T25	Celprogen Inc	E11041-14	Utilizado para el cultivo regular de CMs, recubierto por el fabricante
CMs Medio de cultivo celular completo	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs medio de cultivo completo CMs Medio de
cultivo celular CMs completo libre de fenol	Celprogen Inc	M11041-14PN	Medio de cultivo CMs sin rojo de fenol utilizado durante la medición de LDH
CMs Placas de cultivo celular 96 pozo	Celprogen Inc	E11041-14-96pozo	Utilizado para experimentos de medición de LDH, recubierto por el fabricante
CMs Medio de cultivo celular de hipoxia	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	Cultivo celular de CMs en condiciones hipóxicas (sin glucosa ni suero)
Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess	Invitrogen	C10283	Portaobjetos de recuento utilizados para el contador de células
Cyquant LDH Kit	de citotoxicidadThermo Scientific	C20301	Kit de medición de LDH
Matraces de cultivo celular ECs T25	Fisher Scientific	FB012935	Se utiliza para ECs de cultivo regular
ECs Medio de cultivo celular	Cell Biologics Inc	M1168	ECs medio completo de cultivo ECs
cultivo celular completo libre de fenol	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs medio de cultivo sin rojo de fenol utilizado durante la medición de LDH
ECs Placas de cultivo celular de 96 pocillos	Fisher Scientific (Costar)	3370	Utilizado para experimentos de LDH medición
ECs Cultivo Solución de recubrimiento a base de gelatina	Cell Biologics Inc	6950	Se utiliza para el recubrimiento de matraces y placas para ECs ECs
Hipoxia Medio de cultivo celular Cell	Biologics Inc	GPF1168	ECs en condiciones hipóxicas (sin glucosa ni suero)
Suero fetal bovino (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI Aprobado por el USDA para cultivo y mantenimiento celular
Cámara de hipoxia	StemCell Technologies	27310	Para crear una condición hipóxica con un entorno de 0,01%O2
Medidor de flujo de cámara de hipoxia	StemCell Technologies	27311	Para conectar con el tanque de gas hipóxico para una velocidad de flujo de gas constante
Tanque de gas hipóxico (0.01%O2 cilindro)	A-L Gases comprimidos	UN1956	Se utiliza para lavar el medio hipóxico y la cámara (0.01%O2/5%CO2/94.99N2
)Microscopio	Nikon	TMS	Para observar la condición de la célula
Células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón (EC)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Aislado de la arteria coronaria de ratones C57BL/6
Tubos NUNC 15ML CONICL Fisher	Scientific	12565269	Para el proceso de cultivo celular, experimentos, preparación de soluciones, etc.
Tubos NUNC 50ML CONICL	Fisher Scientific	12565271	Para procesos de cultivo celular, experimentos, preparación de soluciones, etc.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Se utiliza para el lavado de células durante el cultivo o los experimentos
Lector de placas	BioTek Instrument	11120533	Lectura de placas colorimétricas o fluorométricas
Reacción 96 Bien Palte (transparente, sin tapa)	Fisher Scientific	12565226	Se utiliza para la lectura de placas de medición de LDH
Tripsina/EDTA para CM	Celprogen Inc	T1509-014	estéril filtrada y probada en cultivo de tejidos
para ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, probado en cutura celular