Desarrollo de un modelo de cocultivo celular para imitar la isquemia/reperfusión cardíaca in vitro

La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo ^1,2. Sin embargo, el proceso de tratamiento de la reperfusión puede causar la muerte de los cardiomiocitos, conocida como lesión por isquemia/reperfusión (IR) miocárdica, para la cual todavía no existe un remedio efectivo³. Se ha sugerido que las células endoteliales (CE) protegen los cardiomiocitos (CM) a través de la secreción de señales paracrinas, así como las interacciones de célula a célula⁴.

Los modelos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para investigar el papel de las interacciones célula-célula autocrina y /o paracrina en la función y diferenciación celular. Entre los modelos de cocultivo, el cocultivo mixto es el más simple, donde dos tipos diferentes de células están en contacto directo dentro de un solo compartimento de cultivo en una proporción celular deseada⁵. Sin embargo, los tratamientos separados entre tipos de células y el análisis posterior de un solo tipo de célula no son fácilmente factibles dada la población mixta.

Estudios previos indicaron que los insultos hipóxicos e isquémicos causan un daño significativo a la integridad de la membrana celular medido por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). Esta lesión empeora con la reoxigenación, imitando la lesión por reperfusión ^6,7,8. El objetivo del protocolo actual era probar las hipótesis de que la presencia de CE puede atenuar la pérdida de CM en la membrana celular causada por hipoxia y reoxigenación (HR) y que el efecto protector de las CE puede optimizarse variando la distancia de contacto entre las dos líneas celulares. Por lo tanto, empleamos tres tipos de insertos de cultivo celular y células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón y cardiomiocitos de ratón adulto. Los insertos, marcados por Corning, Merck Millipore y Greiner Bio-One, nos permitieron crear tres condiciones de diafonía de cultivo celular diferentes con distancias de línea intercelular de 0.5, 1.0 y 2.0 mm, respectivamente. Se enchaparon 100.000 CE por inserto en cada caso.

Además, para determinar si la densidad de LAS CE en el cocultivo contribuye a la atenuación de la lesión de la FC en este modelo, estudiamos la relación dosis-respuesta entre la concentración de CE y la liberación de LDH por los CM. Las CE se enchaparon en 25.000, 50.000 y 100.000 por inserto, respectivamente, en el inserto de 2,0 mm.

Este informe proporciona un enfoque paso a paso para que los investigadores utilicen este importante modelo a su favor.

1. Preparación/emplatado experimental

1. Mantenga los CM y ECs de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Descongele ambas líneas celulares cuando lleguen de los vendedores. Placa en matraces T25 después de ser lavada con medios frescos. Se recomienda comprar cada medio de cultivo celular de los mismos proveedores a los que se compraron las células. Al día siguiente, actualice las celdas con medios y úselos cuando sean confluentes.
   2. Mantener la incubadora de cultivo celular a 37 °C con 21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂ y mantenerla humidificada.
      NOTA: Las células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón utilizadas en este protocolo se aíslan de las arterias coronarias de ratones C57BL/6, y los cardiomiocitos de ratón adultos se aíslan de corazones de ratón adultos C57BL/6J y se obtienen comercialmente (ver Tabla de materiales).
2. Placas CM en condiciones estériles en el fondo de placas de 24 pocillos (capa inferior). 24 h más tarde, placa eCs en el inserto (o porción superior) del pozo de co-cultivo. 24 h después del recubrimiento EC, coloque los insertos EC sobre las bases de la placa CM, comenzando el período de cocultivo. Permita que las células se coculten durante al menos 12-24 h antes de su uso. Estos pasos se describen en detalle a continuación.
   1. Estimar la confluencia de la línea celular CM bajo un microscopio de luz. Cuando las células parezcan ser 90% -100% confluentes en matraces de cultivo, proceda con el recubrimiento experimental.
   2. Retire los medios de los matraces que contienen cultivos celulares confluentes y tripsinize con 3-5 ml de ácido tripsina/etilendiaminotetraacético (EDTA) para los matraces T25. Agite el matraz suavemente, incube a 37 ° C durante 2-5 min y luego evalúe el progreso enzimático bajo un microscopio de luz. Una vez que las celdas comiencen a redondearse, use un raspador de celdas para separar las celdas de la superficie.
   3. Después del desprendimiento, inactive la solución de tripsina agregando la solución de tripsina/célula a un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de medios para los matraces T25. Centrifugar la suspensión celular a 120 x g durante 2 min para obtener un pellet de células blandas. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 ml de medios.
   4. Para realizar el conteo celular y confirmar la viabilidad celular, mezcle una alícuota de 10 μL de células resuspendidas y 10 μL de colorante azul tripano. Cuente las células vivas usando un contador de células. Diluya las células con medios regulares frescos para lograr las densidades de siembra deseadas. Los volúmenes se calculan en función de la densidad de semillas deseada y la concentración celular de las soluciones madre. Todo el recubrimiento debe realizarse en condiciones estériles.
   5. Placas CM a densidades de siembra de 300,000 por pozo en el fondo de una placa de 24 pocillos pre-recubierta con matriz extracelular. Mantenga las células a 37 °C con 21% de O_{2 y} 5% de CO₂ durante la noche.
   6. Después de 24 h, las CE de placa se insertan a una densidad óptima de chapado de 100.000 por inserto (el área de cultivo es de 33,6 mm²), (Figura 1). Después de 24 h de recubrimiento EC, coloque insertos EC dentro de los pozos CM, iniciando el cocultivo. Permita que las células coculten durante 12-24 h antes de realizar los experimentos.
   7. Asegúrese de que, para cuando se realicen los experimentos, tanto los CM como los CE hayan alcanzado una confluencia del 80% al 90%.

2. Hipoxia/reoxigenación para simular lesión por isquemia/reperfusión in vitro

NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse como se describe, no se detenga en el medio.

1. Prepare los medios hipóxicos vertiendo ~ 25 ml de medios en un tubo cónico de 50 ml. Selle al aire la parte superior con una membrana de silicona y use una pipeta esterilizada para perforar un agujero. Cree otro agujero, esta vez dejando la pipeta sumergida aproximadamente 2/3 en el medio.
2. Enjuague el medio con gas hipóxico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) durante 5 min a un caudal de 30 L/min. Esto minimiza el O₂ disuelto en el medio cuando comienza la hipoxia (paso 2.5).
3. Deseche los medios de las placas de 24 pocillos o insertos de cultivo que contienen células adheridas y lave con 100 μL/pocillo de solución salina tamponada con fosfato al 10% (PBS) muy suavemente. Después, agregue 500 μL de los medios hipóxicos recién preparados a cada pocillo de las placas o insertos.
   NOTA: La hipoxia en los medios se interrumpe lo más brevemente posible durante este paso antes de que comience la hipoxia verdadera para las células y los medios en el paso 2.5.
   1. En el grupo de control normóxico, reemplace el medio original con medios normales frescos que contengan glucosa y suero.
4. Humidifique la cámara de hipoxia colocando una placa de Petri llena de agua estéril dentro de la cámara. A continuación, coloque las placas que comprenden los grupos hipóxicos en la cámara.
5. Enjuague la cámara de hipoxia con gas hipóxico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) durante 5 min a un caudal de 30 L/min. Coloque la cámara en la incubadora de 37 °C durante 24 h.
6. Después de la hipoxia, cultive CM y CE en condiciones normales. Para ello, deseche el medio viejo de las placas/insertos, reemplácelo por medio normal (que contenga glucosa y suero; 500 μL de cada pocillo/inserto) y guárdelo en la incubadora en condiciones normales de cultivo (21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂, 37 °C) durante 2 h para imitar la reperfusión.
7. Para controlar cualquier efecto del reemplazo de medios, cambie los medios de las células normóxicas al mismo tiempo que se cambian los medios hipóxicos.
   Nota : la figura 2 proporciona una descripción general esquemática de este protocolo.

3. Evaluación de endpoints

1. Transfiera los medios de cultivo celular de la placa de 24 pocillos a una placa de 96 pocillos. Use 200 μL de medios de cada pozo de la placa de 24 pocillos y distribuya equitativamente en cuatro pozos de la placa de 96 pocillos, en consecuencia. Use una placa cada una para normoxia versus hipoxia versus HR.
2. Determine el grado de lesión celular, por ejemplo, midiendo la absorbancia de la LDH utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad siguiendo las instrucciones del fabricante. Realice el ensayo en una placa de 96 pocillos según las instrucciones del protocolo de ensayo.

4. Estadísticas

1. Muestre los datos paramétricos como media/desviación estándar y los datos no paramétricos como gráficos de caja con rango mediano/intercuartílico. Se deben realizar pruebas de comparaciones múltiples paramétricas versus no paramétricas adecuadas con pruebas post-hoc aceptables para disminuir la posibilidad de un error de tipo 1. La significación se establece típicamente en un alfa de 0.05 (dos colas).
2. Para todos los experimentos llevados a cabo en el estudio actual, realice al menos tres réplicas de pozos dentro de un experimento. Hubo de tres a seis repeticiones de cada experimento utilizado para el análisis estadístico.

Los tres tipos de insertos (A, B, C) utilizados en este experimento tienen el mismo tamaño de poro de 0,4 μm. La única diferencia entre ellos es la altura de inserción a base, que permite que las distancias entre las dos capas de células cocultivadas sean de 0,5, 1,0 y 2,0 mm, respectivamente, (Figura 3) y que sean de diferentes proveedores (para más detalles, consulte la Tabla de materiales).

Para establecer un modelo de cocultivo in vitro con capas separadas de dos líneas celulares sometidas a FC para simular la lesión por IR, examinamos la integridad de la membrana celular de los CM cocultivados con o sin CE. La utilización de un inserto separado para las CE que se puede colocar a distancias variadas por encima de la capa CM nos permitió también evaluar los efectos diferenciales de la distancia de la capa celular en la gravedad del daño de la membrana en los CM. En un conjunto separado de experimentos, variamos la densidad de las CE y, por lo tanto, la proporción de CE a CM. Además, para diferenciar la isquemia simulada de la lesión IR simulada, se llevaron a cabo experimentos en condiciones de 1) normoxia, 2) hipoxia solamente y 3) HR. Para este modelo, se utilizó hipoxia de 24 h, seguida de 2 h de reoxigenación.

Distancias variables
Distancia de 0,5 mm entre las capas de celda (Insertar A)
Cuando los CM se cultivaron solos, la hipoxia condujo a un aumento significativo de la liberación de LDH en comparación con la normoxia, consistente con nuestros estudios previos (Figura 4A)6. Sin embargo, la LDH solo aumentó ligeramente después de la reoxigenación de 2 horas en comparación con el grupo de hipoxia solamente. Cuando las CE y los CM se cocultivaron juntos a una distancia de 0,5 mm, el aumento en la liberación de LDH por hipoxia solamente no se atenuó, lo que indica que los CE no mostraron ningún efecto protector (en comparación con los CM solos en el grupo bajo las condiciones de hipoxia sola). Sin embargo, las CE ejercieron una protección leve pero significativa en los CM durante la FC.

Distancia de 1,0 mm entre las capas de celda (Insertar B)
El mismo experimento se realizó como el anterior, excepto que la distancia entre las dos capas celulares se incrementó a 1,0 mm (Figura 4B). Encontramos que la liberación de LDH también aumentó significativamente en los CM solo por hipoxia. Sin embargo, a diferencia del inserto de 0,5 mm, el aumento de la LDH en los CM solo fue potenciado por la FC sobre la hipoxia solamente. Además, esta potenciación fue más inhibida y casi abolida por la presencia de las CE durante la reoxigenación en comparación con el grupo de solo CM.

Distancia de 2,0 mm entre las capas de celda (Insertar C)
Cuando se utilizaron insertos de cocultivo que crean una distancia de 2,0 mm entre las dos líneas celulares (Figura 4C), también encontramos un aumento significativo de la liberación de LDH por CM,solo durante la hipoxia, en el mismo grado que en los experimentos de 0,5 mm y 1,0 mm. Curiosamente, sin embargo, el aumento adicional en la liberación de LDH por reoxigenación fue aún más pronunciado que en los experimentos de 1,0 mm. Ambos aumentos fueron atenuados, aunque no abolidos, por la presencia de CE, lo que indica que, a diferencia del uso de insertos de 0,5 o 1,0 mm, los CE protegieron significativamente a los CM de lesiones tanto en condiciones de hipoxia como de FC.

Intensidades EC variables
En un conjunto diferente de experimentos, la concentración de CE chapadas en insertos de 2,0 mm se tituló a 25.000, 50.000 y 100.000 células por inserto, respectivamente. La liberación de LDH se midió después de 24 h de hipoxia seguida de 2 h de reoxigenación. Nuestros resultados mostraron que el aumento de la intensidad de la CE en el cocultivo condujo a una atenuación dependiente de la dosis de la liberación de LDH causada por la FC (Figura 5); no se observó tal efecto en condiciones normóxicas.

Figura 1: Esquema de inserción dentro del pozo. Los insertos con las CE (hasta 100.000 celdas por inserto) se transfieren a las placas de 24 pocillos con los CM (300.000 por pozo) en su parte inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diseño experimental. Las células se cultivan en condiciones normales de oxígeno (21% O2), y luego se dividen en dos grupos: un grupo de control normóxico continuará cultivándose en condiciones normales durante otras 24 h, mientras que el grupo de hipoxia se cultivará en una cámara de hipoxia durante 24 h con solo 0.01% O2 y sin glucosa. Después de estas intervenciones de 24 h, ambos grupos de células se actualizan con medios y se cultivan continuamente en un entorno de 21% O2 durante otras 2 h, la fase de reoxigenación, antes de realizar finalmente los ensayos finales, por ejemplo, el análisis de LDH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes y esquemas de los tres insertos diferentes. La distancia entre las células endoteliales en el inserto y los cardiomiocitos en el fondo del pozo se puede variar mediante el uso de diferentes insertos. Los tres tipos de insertos utilizados aquí tienen el mismo tamaño de poro de 0,4 μm. La única diferencia entre ellos es la altura de inserción a base, que permite que las distancias entre las dos capas de células cocultivadas sean de 0.5 (A), 1.0 (B) y 2.0 mm (C), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Comparación de tres tipos de insertos de cultivo para evaluar la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH; en unidades de absorbancia [au]) en condiciones normóxicas (izquierda), hipoxia sola (centro) e hipoxia/reoxigenación (derecha) para cardiomiocitos solos (CM; blanco), células endoteliales solas (EC; negro) y cocultivos de CM con CE (patrón de control). (A) Distancia de 0,5 mm, (B) Distancia de 1,0 mm, (C) Distancia de 2,0 mm entre las dos capas de celdas diferentes. Los CE se enchaparon a una densidad de 100.000 células por inserto, los CM a una densidad de 300.000 células por pozo. Los datos son medios ± desviación estándar, n = 4 por grupo. Estadísticas: ANOVA seguido de la prueba post-hoc Student-Newman-Keuls. P < 0,05 (de dos colas) indicado por barras horizontales entre cada par comparado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Concentración de células endoteliales cocultivadas (CE; 25: 25.000 células por inserto; 50: 50.000 células por inserto; 100: 100.000 células por inserto) protección de cardiomiocitos (CM) afectada por la dosis contra la lesión por hipoxia/reoxigenación (derecha) en comparación con las condiciones normóxicas (izquierda) como lo demuestra la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH; en unidades de absorbancia [au]). Las CE no tuvieron ningún efecto sobre la liberación de LDH en condiciones normóxicas. Los datos son medios ± desviación estándar, n = 4 por grupo. Estadísticas: ANOVA seguido de la prueba post-hoc Student-Newman-Keuls. P < 0,05 (de dos colas) indicado por barras horizontales entre cada par comparado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.