Summary
Пространственное расстояние является ключевым параметром при оценке повреждения гипоксией/реоксигенацией в кокультурной модели отдельных эндотелиальных и кардиомиоцитарных клеточных слоев, впервые предполагая, что оптимизация пространственной среды кокультуры необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли эндотелиальных клеток в защите кардиомиоцитов.
Abstract
Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире. Реперфузия вызывает дополнительные травмы, помимо ишемии. Эндотелиальные клетки (ЭК) могут защищать кардиомиоциты (КМ) от реперфузионного повреждения посредством клеточных взаимодействий. Кокультуры могут помочь исследовать роль клеточно-клеточных взаимодействий. Смешанная кокультура является простейшим подходом, но ограничена, поскольку изолированные методы лечения и последующие анализы отдельных типов клеток невозможны. Чтобы выяснить, могут ли ЭК дозозависимо ослаблять повреждение клеток СМ и может ли эта защита быть дополнительно оптимизирована путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями, мы использовали эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослой мыши для тестирования трех типов вставок клеточной культуры, которые варьировались в их межклеточном слое на расстоянии 0,5, 1,0 мм и 2,0 мм соответственно. При только КМ клеточное повреждение, оцениваемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ), значительно увеличивалось во время гипоксии и далее при реоксигенации, когда расстояние составляло 2,0 мм по сравнению с 0,5 и 1,0 мм. Когда ЭК и КМ находились в почти прямом контакте (0,5 мм), наблюдалось лишь легкое ослабление повреждения реоксигенации КМ после гипоксии. Это затухание было значительно увеличено, когда пространственное расстояние составляло 1,0 мм. С расстоянием 2,0 мм ЕС ослабляли повреждение СМ как во время гипоксии, так и гипоксии / реоксигенации, что указывает на то, что для эк необходимы достаточные культурные дистанцирования для перекрестных помех с КМ, так что секретируемые сигнальные молекулы могут циркулировать и полностью стимулировать защитные пути. Наши результаты впервые показывают, что оптимизация пространственной среды кокультуры ЕС / СМ необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли ЭК в CM-защите от моделируемой ишемии / реперфузионного повреждения. Цель настоящего доклада состоит в том, чтобы предоставить исследователям поэтапный подход к использованию этой важной модели в своих интересах.
Introduction
Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире 1,2. Тем не менее, процесс лечения реперфузии сам по себе может вызвать гибель кардиомиоцитов, известную как травма ишемии / реперфузии миокарда (ИК), для которой до сих пор нет эффективного средства3. Было предложено, чтобы эндотелиальные клетки (ЭК) защищали кардиомиоциты (КМ) посредством секреции паракринных сигналов, а также межклеточных взаимодействий4.
Модели клеточных кокультур широко использовались для исследования роли аутокринных и/или паракринных клеточно-клеточных взаимодействий в функции и дифференцировке клеток. Среди кокультурных моделей смешанная кокультура является самой простой, где два разных типа клеток находятся в прямом контакте в пределах одного культурального отсека при желаемом соотношении клеток5. Тем не менее, раздельное лечение между типами клеток и последующий анализ одного типа клеток неосуществимы, учитывая смешанную популяцию.
Предыдущие исследования показали, что гипоксические и ишемические инсульты вызывают значительное повреждение целостности клеточной мембраны, измеряемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Эта травма усугубляется при реоксигенации, имитируя реперфузионную травму 6,7,8. Целью текущего протокола была проверка гипотез о том, что присутствие EC может дозозависимо ослаблять утечку CM клеточной мембраны, вызванную гипоксией и реоксигенацией (HR), и что защитный эффект EC может быть оптимизирован путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями. Таким образом, мы использовали три типа вставок клеточной культуры: эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослых мышей. Вставки под брендом Corning, Merck Millipore и Greiner Bio-One позволили нам создать три различных условия перекрестных помех клеточной культуры с расстояниями между клеточными линиями 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответственно. В каждом случае на каждую вставку было нанесено 100 000 ЭК.
Кроме того, чтобы определить, способствует ли плотность ЭК в кокультуре ослаблению повреждения ЧСС в этой модели, мы изучили зависимость доза-реакция между концентрацией ЕС и высвобождением НРС КМ. ЭК были покрыты на 25 000, 50 000 и 100 000 на вставку, соответственно, во вставке 2,0 мм.
В этом отчете представлен поэтапный подход для исследователей, чтобы использовать эту важную модель в своих интересах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Экспериментальная подготовка/покрытие
- Обслуживайте CM и EC в соответствии с инструкциями производителя.
- Оттаивайте обе клеточные линии, когда они поступают от поставщиков. Пластина в колбах Т25 после промывки свежей средой. Рекомендуется приобретать каждую среду для культивирования клеток у тех же поставщиков, у которых были приобретены клетки. На следующий день освежите клетки средой и используйте при слиянии.
- Поддерживают инкубатор клеточной культуры при температуре 37 °C с 21% O2, 5% CO2, 74%N2 и сохраняют его увлажненным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши, используемые в этом протоколе, выделены из коронарных артерий мышей C57BL/6, а кардиомиоциты взрослых мышей выделены из сердца взрослых мышей C57BL/6J и получены в коммерческих целях (см. Таблицу материалов).
- Плиты СМ в стерильных условиях на дно 24-луночных плит (нижний слой). Через 24 ч пластинчатые ЭК во вставку (или верхнюю часть) кокультурного колодца. Через 24 часа после нанесения покрытия EC поместите вставки EC на основания пластин CM, начиная период совместного культивирования. Дайте клеткам совместно культивировать в течение не менее 12-24 ч перед использованием. Эти шаги подробно описаны ниже.
- Оцените слияние клеточных линий СМ под световым микроскопом. Когда клетки окажутся на 90%-100% сливающимися в культуральных колбах, приступают к экспериментальному покрытию.
- Удалите среду из колб, содержащих сливающиеся клеточные культуры, и попробуйте 3-5 мл трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для колб Т25. Аккуратно перемешайте колбу, высиживают при 37 °C в течение 2-5 мин, а затем оценивают прогресс ферментатики под световым микроскопом. Как только клетки начнут округляться, используйте скребок для клеток, чтобы отделить клетки от поверхности.
- После отслоения инактивируют раствор трипсина, добавляя раствор трипсина/клетки в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл среды для колб T25. Центрифугируют клеточную суспензию при 120 х г в течение 2 мин с получением мягкой клеточной гранулы. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл среды.
- Чтобы выполнить подсчет клеток и подтвердить жизнеспособность клеток, смешайте аликвоту 10 мкл повторно суспендированных клеток и 10 мкл трипанового синего красителя. Подсчитайте живые клетки с помощью счетчика ячеек. Разбавьте клетки свежими обычными средами для достижения желаемой плотности посева. Объемы рассчитываются в зависимости от желаемой плотности семян и клеточной концентрации исходных растворов. Все гальванические покрытия должны выполняться в стерильных условиях.
- Пластинчатые КМ при плотности высева 300 000 на скважину на дно 24-луночной пластины, предварительно покрытой внеклеточным матриксом. Поддерживайте ячейки при 37 °C с 21% O2 и 5% CO2 в течение ночи.
- Через 24 ч пластинчатые ЭК во вставки с оптимальной плотностью покрытия 100 000 на вставку (площадь культивирования составляет 33,6мм2), (рисунок 1). После 24 ч покрытия ЕС поместите вставки ЕС внутрь скважин СМ, инициируя совместное культивирование. Дайте клеткам совместно культивировать в течение 12-24 ч перед проведением экспериментов.
- Убедитесь, что к моменту проведения экспериментов как КМ, так и ЭК достигли 80-90% слияния.
2. Гипоксия/реоксигенация для имитации ишемии/реперфузионного повреждения In Vitro
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены, как описано, не останавливайтесь между ними.
- Подготовьте гипоксическую среду, налив ~25 мл среды в коническую трубку объемом 50 мл. Запечатайте верхнюю часть силиконовой мембраной и используйте стерилизованную пипетку, чтобы пробить отверстие. Создайте еще одно отверстие, на этот раз оставив пипетку погруженной примерно на 2/3 в среду.
- Промывайте среду гипоксическим газом (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99%N2) в течение 5 мин при расходе 30 л/мин. Это минимизирует O2 , растворенный в среде, когда начинается гипоксия (шаг 2.5).
- Отбросьте среду 24-луночных пластин или культуральных вкладышей, содержащих прикрепленные клетки, и очень осторожно промыть 100 мкл/лунку 10% фосфатного буферизованного физиологического раствора (PBS). После этого добавьте 500 мкл свежеприготовленной гипоксической среды в каждую лунку пластин или вкладышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гипоксия в среде прерывается как можно короче во время этой стадии, прежде чем истинная гипоксия для клеток и сред начнется на этапе 2.5.- В нормоксической контрольной группе заменить исходные среды свежими нормальными средами, содержащими глюкозу и сыворотку.
- Увлажните камеру гипоксии, поместив чашку Петри, наполненную стерильной водой, в камеру. Затем поместите пластины, содержащие гипоксические группы, в камеру.
- Промывайте камеру гипоксии гипоксическим газом (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99%N2) в течение 5 мин при расходе 30 л/мин. Поместите камеру в инкубатор при температуре 37 °C на 24 ч.
- После гипоксии культивируют КМ и ЭК в нормальных условиях. Для этого отбросьте старую среду пластин/вкладышей, замените ее нормальной средой (содержащей глюкозу и сыворотку; 500 мкл каждой лунки/вставки) и храните ее в инкубаторе в нормальных условиях культивирования (21% O2, 5% CO2, 74%N2, 37 °C) в течение 2 ч для имитации реперфузии.
- Чтобы контролировать любые эффекты замещения среды, изменяйте среду нормоксических клеток одновременно с изменением гипоксической среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен схематический обзор этого протокола.
3. Оценка конечных точек
- Перенесите среду клеточного культуры с 24-луночной пластины в 96-луночную пластину. Используют 200 мкл среды из каждой скважины 24-луночной плиты и равномерно распределяют на четыре скважины 96-луночной плиты соответственно. Используйте по одной пластине для нормоксии против гипоксии против ЧСС.
- Определить степень клеточного повреждения, например, путем измерения абсорбции ЛДГ с использованием набора для анализа цитотоксичности в соответствии с инструкциями производителя. Выполните анализ в 96-луночной пластине в соответствии с инструкциями в протоколе анализа.
4. Статистика
- Отображение параметрических данных в виде среднего/стандартного отклонения и непараметрических данных в виде прямоугольных графиков с медианным/межквартильным диапазоном. Следует проводить адекватные параметрические и непараметрические множественные сравнительные тесты с приемлемыми пост-специальными тестами для снижения вероятности ошибки типа 1. Значимость обычно устанавливается на уровне альфа 0,05 (двуххвостый).
- Для всех экспериментов, проведенных в текущем исследовании, выполните, по крайней мере, три хорошо воспроизведенных в течение одного эксперимента. Было от трех до шести повторений каждого эксперимента, используемого для статистического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Все три типа вставок (A, B, C), используемые в этом эксперименте, имеют одинаковый размер пор 0,4 мкм. Единственным различием между ними является высота вставки до основания, которая позволяет расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответственно (рисунок 3) и что они от разных поставщиков (подробнее см. Таблицу материалов).
Чтобы создать модель кокультуры in vitro с отдельными слоями двух клеточных линий, подвергающихся HR для моделирования ИК-повреждения, мы изучили целостность клеточной мембраны CM, совместно культивируемых с EC или без них. Использование отдельной вставки для ЕС, которая может быть размещена на различных расстояниях над слоем СМ, позволило нам также оценить дифференциальное влияние расстояния клеточного слоя на тяжесть повреждения мембраны в СМ. В отдельном наборе экспериментов мы варьировали плотность ЭК и, следовательно, отношение ЭК к КМ. Кроме того, чтобы дифференцировать смоделированную ишемию от моделируемого ИК-повреждения, проводились эксперименты в условиях 1) нормоксии, 2) только гипоксии и 3) ЧСС. Для этой модели мы использовали 24-часовую гипоксию с последующей 2-часовой реоксигенацией.
Переменные расстояния
Расстояние между слоями ячеек 0,5 мм (вставка A)
Когда КМ культивировали в одиночку, гипоксия приводила к значительному увеличению высвобождения ЛДГ по сравнению с нормоксией, что согласуется с нашими предыдущими исследованиями (рисунок 4A)6. Тем не менее, ЛДГ был лишь незначительно увеличен после 2-часовой реоксигенации по сравнению с группой, поддерживающей только гипоксию. Когда ЕС и КМ совместно культивировали вместе на расстоянии 0,5 мм, увеличение высвобождения ЛДГ только в результате гипоксии не ослабевало, что указывает на то, что ЭК не проявляли никакого защитного эффекта (по сравнению с одной только группой КМ в условиях только гипоксии). Тем не менее, EC оказывали мягкую, но значительную защиту на CM во время HR.
Расстояние между слоями ячеек 1,0 мм (вставка B)
Был проведен тот же эксперимент, что и выше, за исключением того, что расстояние между двумя слоями клеток было увеличено до 1,0 мм (рисунок 4B). Мы обнаружили, что высвобождение ЛДГ также было значительно увеличено в КМ только за счет гипоксии. Однако, в отличие от вставки 0,5 мм, увеличение LDH только в СМ было потенцировано HR над гипоксией. Более того, это потенцирование было более ингибировано и почти отменено присутствием ЭК во время реоксигенации по сравнению с группой, состоящей только из КМ.
Расстояние между слоями ячейки 2,0 мм (вставка C)
Когда использовались кокультурные вставки, которые создают расстояние 2,0 мм между двумя клеточными линиями (рисунок 4C), мы также обнаружили значительное увеличение высвобождения ЛДГ только КМ во время гипоксии, в той же степени, что и в экспериментах на 0,5 мм и 1,0 мм. Интересно, однако, что дополнительное увеличение высвобождения ЛДГ при реоксигенации было еще более выраженным, чем в экспериментах на 1,0 мм. Оба эти увеличения были ослаблены, хотя и не отменены, присутствием EC, что указывает на то, что в отличие от использования 0,5 или 1,0 мм вставок, EC значительно защищали CM от травм как в условиях гипоксии, так и в условиях HR.
Переменная интенсивность ЕС
В другой серии экспериментов концентрация ЭК, покрытых вставками диаметром 2,0 мм, была титрована до 25 000, 50 000 и 100 000 клеток на вставку соответственно. Высвобождение ЛДГ измеряли после 24-часовой гипоксии с последующим 2-часовым реоксигенированием. Наши результаты показали, что увеличение интенсивности ЭК в кокультуре приводило к дозозависимому ослаблению высвобождения ЛДГ, вызванному ЧСС (рисунок 5); в нормоксических условиях такого эффекта не наблюдалось.
Рисунок 1: Схема вставки внутри скважины. Вставки с ЭК (до 100 000 ячеек на вставку) переносятся на 24-луночные пластины с СМ (300 000 на скважину) на дне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальное проектирование. Клетки культивируются в нормальных кислородных условиях (21% O 2), а затем разделяются на две группы: нормоксическая контрольная группа будет продолжать культивироваться в нормальных условиях еще 24 ч, тогда как группа гипоксии будет культивироваться в гипоксической камере в течение 24 ч только с 0,01% O2 и без глюкозы. После этих 24-часовых вмешательств обе группы клеток обновляют средой и постоянно культивируют в среде 21%O2 в течение еще 2 ч, фазы реоксигенации, прежде чем в конечном итоге провести анализ (анализы) конечной точки, например, анализ LDH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Изображения и схемы трех различных вставок. Расстояние между эндотелиальными клетками во вставке и кардиомиоцитами в нижней части лунки можно варьировать, используя различные вставки. Все три типа вставок, используемых здесь, имеют одинаковый размер пор 0,4 мкм. Единственным различием между ними является высота вставки до основания, которая позволяет расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5 (A), 1,0 (B) и 2,0 мм (C) соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сравнение трех типов культуральных вставок при оценке высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ; в единицах абсорбции [au]) при нормоксических (слева), только гипоксия (в центре) и условиях гипоксии/реоксигенации (справа) только для кардиомиоцитов (CM; белый), только эндотелиальных клеток (EC; черный) и ко-культур CM с EC (контрольный рисунок). (A) расстояние 0,5 мм, (B) расстояние 1,0 мм, (C) Расстояние 2,0 мм между двумя различными слоями ячеек. ЕС были покрыты плотностью 100 000 клеток на вставку, КМ при плотности 300 000 клеток на лунку. Данные являются средними ± стандартным отклонением, n = 4 на группу. Статистика: ANOVA, за которой следует тест Student-Newman-Keuls post-hoc. P < 0,05 (двуххвостый), обозначенный горизонтальными полосами между каждой сравниваемой парой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Концентрация совместно культивируемых эндотелиальных клеток (ЕС; 25: 25 000 клеток на вставку; 50: 50 000 клеток на вставку; 100: 100 000 клеток на вставку) дозозависимая защита кардиомиоцитов (СМ) от гипоксии/резоксигенационного повреждения (справа) по сравнению с нормоксическими состояниями (слева), о чем свидетельствует высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ; в единицах абсорбции [au]). ЕС не оказывали никакого влияния на высвобождение ЛДГ в нормоксических условиях. Данные являются средними ± стандартным отклонением, n = 4 на группу. Статистика: ANOVA, за которой следует тест Student-Newman-Keuls post-hoc. P < 0,05 (двуххвостый), обозначенный горизонтальными полосами между каждой сравниваемой парой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в протоколе
Модели клеточной кокультуры были использованы для изучения клеточных механизмов кардиопротекции. Таким образом, способ создания двух отдельных слоев со значимым расстоянием между ними имеет решающее значение для разработки подходящей модели совместной культуры. Проблема в изучении смоделированного ИК, то есть ЧСС, травмы заключается в том, что не только сама ишемия (гипоксия), но и реперфузия (реоксигенация) усугубляет клеточную дисфункцию. Поэтому реалистичная модель должна отражать эти характеристики, например, демонстрируя достаточно повышенное повреждение путем реоксигенации после гипоксии, в отличие от гипоксии, но все же допуская ослабление повреждения клеточными защитными препаратами или стратегиями, такими как, в нашем случае, присутствие ЭК. Интересно, что расстояние между двумя клеточными слоями, по-видимому, играет важную роль в разработке подходящей модели кокультуры. Мы смогли продемонстрировать, что расстояние в 1,0 мм и 2,0 мм между ЭК и КМ позволило получить ожидаемую реакцию на травму ЧСС, но, что более важно, только 2,0 мм дали стабильно благоприятный результат для защиты от клеточных травм присутствием ЭК как в гипоксических, так и в ЧСС условиях.
Модификации и устранение неполадок метода
На клеточно-клеточные взаимодействия в моделях кокультур влияют множественные переменные, такие как количество различных кокультивируемых популяций, степень сходства типов клеток, степень физического разделения между ними, разница между локальными средами популяции, объем культур и учет сроков кокультуры 9,10,11,12 . Между этими факторами существуют компромиссы. На эти взаимодействия сильно влияет окружающая среда, которая, в свою очередь, определяется протоколом и настройкой. Крайне важно разработать экспериментальные модели, которые являются воспроизводимыми, измеримыми и сопоставимыми. Наш подход состоял в том, чтобы контролировать и ограничивать количество переменных, которые могут нарушить согласованность данных, полученных из различных экспериментов, проведенных в разное время, путем покрытия точного количества клеток, используя одно и то же соотношение двух совместно культивируемых клеточных линий, одинаковых объемов среды клеточной культуры и реагентов для анализа и т. Д., За исключением трех разных вставок клеточной культуры.
Ограничения метода
Наша модель хорошо работает с ЭК и КМ, вероятно, благодаря повсеместному присутствию ЭК в сердечно-сосудистой системе. Насколько хорошо другие типы клеточных линий, представляющих потенциальный интерес, взаимодействуют с КМ, нейронами или другими клетками, представляющими интерес для изучения in vitro , еще предстоит оценить, поскольку различные клеточные линии могут по-разному взаимодействовать в среде кокультуры. Одним из различий между совместно культивируемыми клеточными популяциями могут быть их экологические отношения, например, если они являются естественными конкурентами или кооператорами. Кроме того, как и во всех других моделях клеток in vitro , сгенерированное повреждение клеток в эксперименте может не представлять фактическое патофизиологическое состояние повреждения in vivo. Кроме того, мы признаем, что испытанные расстояния между ЭК и КМ в 0,5, 1,0 и 2,0 мм не воспроизводят их расстояние in vivo; для данной модели in vitro ; Тем не менее, наши результаты описывают последствия оптимального дистанцирования между двумя клеточными слоями, которые должны быть изучены учеными, которые хотели бы воспользоваться этим методом.
Значение метода по отношению к существующим/альтернативным методам
Существующие/альтернативные способы совместного культивирования включают прямое смешивание клеточных линий или создание разделенной среды со степенью разделения, такой как использование трансвеллерных пластин13, микрофлюидных платформ14 или трехмерных каркасов15, среди которых трансвеллерные пластины являются наименее дорогими и простыми из доступных. Несмотря на естественные ограничения, кокультуры очень актуальны для исследований лекарственных средств, поскольку они обеспечивают более репрезентативную модель ткани in vivo и позволяют проводить высокопроизводительное тестирование и углубленный мониторинг влияния лекарств на клеточно-клеточные взаимодействия16. Наша модель была точно откалибрована с использованием четко определенных пространственных расстояний между EC и CM, вместо полной и неконтролируемой смеси двух разных типов клеток. Более того, эта модель позволяет проводить раздельное лечение и анализ отдельных типов клеток, чего невозможно добиться в смешанной кокультуре, не говоря уже о in vivo. Поскольку ИК-повреждение включает в себя отдельные процессы ЧСС, эта модель хорошо подходит для изучения клеточных механизмов ишемии / гипоксии против реперфузии / повреждения рексигенации отдельно. Наши данные свидетельствуют о том, что это может быть очень ценная и эффективная модель клеточной кокультуры, которая будет использоваться в смоделированных исследованиях ИК-повреждений. Наши наблюдения ясно показывают, что оптимальное пространственное расстояние, в нашем случае 2,0 мм, необходимо для того, чтобы ЭК перекрестно взаимодействовали с КМ в этой конкретной модели совместной культуры, так что потенциально секретируемые сигнальные молекулы ЕС могут эффективно циркулировать для незаконной защиты КМ от травм только гипоксией и / или HR.
Важность и потенциал применения методов в конкретных областях исследований
Наша модель указывает на важность объединения ЭК коронарной артерии мыши с КМ мыши для улучшения исследования защитных мер против повреждения ЧСС; что изменение пространственного расстояния кокультур демонстрирует эффективный способ лучшего понимания пространственных условий, влияющих на защитное действие ЭК на травмы КМ, вызванные ЧСС; и что плотность ЭК или отношение ЕС к КМ положительно коррелируют со степенью защиты от травм чсс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана, в частности, Службой исследований и разработок биомедицинской лаборатории Министерства по делам ветеранов США (I01 BX003482) и институциональными фондами M.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
References
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).
- Gottlieb, R. A. Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).
- Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease. The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury. Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Martindale, J. J., Metzger, J. M. Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).
- vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device. Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).
- Bidarra, S. J., et al. Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells. Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PloS One. 6, 25661 (2011).
- Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures. PloS One. 7, 31711 (2012).
- Miki, Y., et al. The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6, 25661 (2011).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).
