Summary
Ruimtelijke afstand is een belangrijke parameter bij het beoordelen van hypoxie / reoxygenatieletsel in een co-cultuurmodel van afzonderlijke endotheel- en cardiomyocytencellagen, wat voor het eerst suggereert dat het optimaliseren van de co-culturele ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming.
Abstract
Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit. Reperfusie veroorzaakt extra letsel buiten ischemie. Endotheelcellen (EC's) kunnen cardiomyocyten (CM's) beschermen tegen reperfusieschade door cel-celinteracties. Coculturen kunnen helpen bij het onderzoeken van de rol van cel-cel interacties. Een gemengde co-kweek is de eenvoudigste benadering, maar is beperkt omdat geïsoleerde behandelingen en downstream-analyses van enkele celtypen niet haalbaar zijn. Om te onderzoeken of EC's dosisafhankelijk CM-celschade kunnen dempen en of deze bescherming verder kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren, gebruikten we muis primaire coronaire endotheelcellen en volwassen muis cardiomyocyten om drie soorten celkweekinzetstukken te testen die varieerden in hun intercellelijke laagafstand bij 0,5, Respectievelijk 1,0 en 2,0 mm. In CMs-only nam cellulair letsel zoals beoordeeld door lactaatdehydrogenase (LDH) afgifte significant toe tijdens hypoxie en verder na reoxygenatie wanneer de afstand 2,0 mm was in vergelijking met 0,5 en 1,0 mm. Wanneer EC's en CM's bijna direct contact hadden (0,5 mm), was er slechts een lichte demping van de reoxygenatieschade van CM's na hypoxie. Deze demping werd aanzienlijk verhoogd wanneer de ruimtelijke afstand 1,0 mm was. Met een afstand van 2,0 mm verzwakten EC's CM-letsel tijdens zowel hypoxie als hypoxie / reoxygenatie, wat aangeeft dat voldoende cultuurafstand nodig is voor EC's om te kruisverwijzingen met CM's, zodat uitgescheiden signaalmoleculen kunnen circuleren en beschermende paden volledig kunnen stimuleren. Onze bevindingen suggereren voor het eerst dat het optimaliseren van de EC / CM co-cultuur ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van EC's in CM-bescherming tegen gesimuleerde ischemie / reperfusieletsel. Het doel van dit rapport is om onderzoekers een stapsgewijze aanpak te bieden om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.
Introduction
Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit 1,2. Het behandelingsproces van reperfusie kan echter zelf de dood van cardiomyocyten veroorzaken, bekend als myocardiale ischemie / reperfusie (IR) -letsel, waarvoor er nog steeds geen effectieve remedie is3. Er is gesuggereerd dat endotheelcellen (EC's) cardiomyocyten (CMs) beschermen door de secretie van paracriene signalen, evenals cel-tot-cel interacties4.
Celcocultuurmodellen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van autocriene en /of paracriene cel-celinteracties op celfunctie en differentiatie te onderzoeken. Onder co-cultuurmodellen is gemengde co-cultuur de eenvoudigste, waarbij twee verschillende soorten cellen in direct contact staan binnen een enkel kweekcompartiment met een gewenste celverhouding5. Afzonderlijke behandelingen tussen celtypen en downstream-analyse van een enkel celtype zijn echter niet gemakkelijk haalbaar gezien de gemengde populatie.
Eerdere studies toonden aan dat hypoxische en ischemische beledigingen aanzienlijke schade toebrengen aan de integriteit van het celmembraan zoals gemeten door de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH). Dit letsel wordt verergerd bij reoxygenatie, waarbij reperfusieletselwordt nagebootst 6,7,8. Het doel van het huidige protocol was om de hypothesen te testen dat de aanwezigheid van EC's dosisafhankelijk celmembraanlekkage van CM's veroorzaakt door hypoxie en reoxygenatie (HR) kan dempen en dat het beschermende effect van EC's kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren. Daarom gebruikten we drie soorten celkweekinzetstukken en muis primaire coronaire endotheelcellen en cardiomyocyten van volwassen muizen. De inserts, gebrandmerkt door Corning, Merck Millipore en Greiner Bio-One, stelden ons in staat om drie verschillende celkweekkruisverwijzingen te creëren met intercellulaire afstanden van respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm. Per inzetstuk werden telkens 100.000 EC's verguld.
Om te bepalen of de dichtheid van EC's in co-cultuur bijdraagt aan hr-letselverzwakking in dit model, bestudeerden we bovendien de dosis-responsrelatie tussen EC-concentratie en LDH-afgifte door CM's. EC's werden geplateerd op respectievelijk 25.000, 50.000 en 100.000 per insert in de insert van 2,0 mm.
Dit rapport biedt een stapsgewijze aanpak voor onderzoekers om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentele voorbereiding/beplating
- Onderhoud CM's en EC's volgens de instructies van de fabrikant.
- Ontdooi beide cellijnen wanneer ze van leveranciers komen. Plaat in T25-kolven na het wassen met verse media. Het wordt aanbevolen om elk celkweekmedium te kopen bij dezelfde leveranciers waar de cellen zijn gekocht. Ververs de volgende dag de cellen met media en gebruik deze bij confluent.
- Houd de celkweekincubator op 37 °C met 21% O2, 5% CO2, 74% N2 en bevochtigd.
OPMERKING: De primaire coronaire endotheelcellen van de muis die in dit protocol worden gebruikt, worden geïsoleerd uit kransslagaders van C57BL / 6-muizen en cardiomyocyten van volwassen muizen worden geïsoleerd uit volwassen C57BL / 6J-muizenharten en commercieel verkregen (zie Tabel met materialen).
- Plaat-CMs onder steriele omstandigheden op de bodem van 24-well platen (inferieure laag). 24 uur later, plaat EC's in de insert (of een groter deel) van de co-kweekput. Plaats 24 uur na ec-beplating ec-inzetstukken op cm-plaatbodems, waarbij de cokweekperiode begint. Laat de cellen voor gebruik minstens 12-24 uur meekleven. Deze stappen worden hieronder in detail beschreven.
- Schat cm cellijn confluency onder een lichtmicroscoop. Wanneer cellen 90% -100% confluent lijken te zijn in kweekkolven, ga dan verder met experimentele plating.
- Verwijder de media uit de kolven met confluentcelculturen en trypsiniseren met 3-5 ml trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) voor T25-kolven. Roer de kolf voorzichtig, incubeer bij 37 °C gedurende 2-5 minuten en beoordeel vervolgens de enzymatische voortgang onder een lichtmicroscoop. Zodra de cellen beginnen af te ronden, gebruikt u een celschraper om de cellen van het oppervlak los te maken.
- Inactiveer na het losmaken de trypsine-oplossing door de trypsine/celoplossing toe te voegen aan een buis van 50 ml met 10 ml media voor T25-kolven. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 2 minuten bij 120 x g om een zachte celkorrel te verkrijgen. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 5 ml media.
- Om het tellen van cellen uit te voeren en de levensvatbaarheid van cellen te bevestigen, mengt u een aliquot van 10 μL geresuspendeerde cellen en 10 μL trypan blauwe kleurstof. Tel de levende cellen met behulp van een celteller. Verdun de cellen met verse reguliere media om de gewenste zaaidichtheden te bereiken. Volumes worden berekend afhankelijk van de gewenste zaaddichtheid en celconcentratie van stamoplossingen. Alle beplating moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.
- Plaat-CM's bij zaaidichtheden van 300.000 per put op de bodem van een 24-putplaat voorgecoat met extracellulaire matrix. Houd de cellen 's nachts op 37 °C met 21% O2 en 5% CO2 .
- Na 24 uur worden EC's in inserts geplaatst met een optimale beplatingsdichtheid van 100.000 per insert (kweekgebied is 33,6 mm2) (figuur 1). Plaats na 24 uur EC-beplating EC-inserts in de CM-putten, waardoor de co-kweek wordt gestart. Laat cellen 12-24 uur meekleven voordat de experimenten worden uitgevoerd.
- Zorg ervoor dat tegen de tijd dat experimenten worden uitgevoerd, zowel CM's als EC's 80% -90% samenvloeiing hebben bereikt.
2. Hypoxie/reoxygenatie om ischemie/reperfusieschade in vitro te simuleren
OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd zoals beschreven, pauzeer niet tussendoor.
- Bereid de hypoxische media voor door ~ 25 ml media in een conische buis van 50 ml te gieten. Luchtdicht de bovenkant af met een siliconenmembraan en gebruik een gesteriliseerde pipet om een gat te ponsen. Maak nog een gat, dit keer laat de pipet ongeveer 2/3 ondergedompeld in de media.
- Spoel de media gedurende 5 minuten met hypoxisch gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99% N2) met een debiet van 30 l/min. Dit minimaliseert O2 opgelost in de media wanneer hypoxie begint (stap 2.5).
- Gooi de media van de 24-well platen of kweekinzetstukken met aangehechte cellen weg en was met 100 μL/putje van 10% Phosphate Buffered Saline (PBS) heel voorzichtig. Voeg daarna 500 μL van de vers bereide hypoxische media toe aan elk putje van de platen of inserts.
OPMERKING: Hypoxie in de media wordt tijdens deze stap zo kort mogelijk onderbroken voordat echte hypoxie voor cellen en media begint in stap 2.5.- Vervang in de normoxische controlegroep de oorspronkelijke media door verse normale media die glucose en serum bevatten.
- Bevochtig de hypoxiekamer door een petrischaal gevuld met steriel water in de kamer te plaatsen. Plaats vervolgens de platen bestaande uit de hypoxische groepen in de kamer.
- Spoel de hypoxiekamer met hypoxisch gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99% N2) gedurende 5 minuten bij een debiet van 30 L/min. Plaats de kamer gedurende 24 uur in de incubator van 37 °C.
- Kweek na hypoxie CM's en EC's onder normale omstandigheden. Om dit te doen, gooit u de oude media van de platen/inserts weg, vervangt u deze door normale media (met glucose en serum; 500 μL van elke put/insert) en bewaart u deze gedurende 2 uur in de incubator onder normale kweekomstandigheden (21% O2, 5% CO2, 74% N2, 37 °C) om reperfusie na te bootsen.
- Om de effecten van mediavervanging te controleren, verandert u de media van normoxische cellen op hetzelfde moment dat de hypoxische media worden gewijzigd.
OPMERKING: Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van dit protocol.
3. Eindpuntbeoordeling
- Breng de celkweekmedia van de 24-putplaat over in een 96-putplaat. Gebruik 200 μL media uit elke put van de 24-well plaat en verdeel dienovereenkomstig in vier putten van de 96-well plaat. Gebruik elk één plaat voor normoxie versus hypoxie versus HR.
- Bepaal de mate van cellulair letsel, bijvoorbeeld door de absorptie voor LDH te meten met behulp van een cytotoxiciteitstestkit volgens de instructies van de fabrikant. Voer de test uit in een 96-well plaat zoals geïnstrueerd in het assayprotocol.
4. Statistieken
- Geef de parametrische gegevens weer als gemiddelde/standaarddeviatie en niet-parametrische gegevens als boxplots met mediaan/interkwartielbereik. Er moeten adequate parametrische versus niet-parametrische meervoudige vergelijkingstests met aanvaardbare post-hoctests worden uitgevoerd om de kans op een type-1-fout te verkleinen. Significantie wordt meestal ingesteld op een alfa van 0,05 (tweezijdig).
- Voor alle experimenten die in de huidige studie zijn uitgevoerd, moet u ten minste drie goed repliceren uitvoeren binnen één experiment. Er waren drie tot zes herhalingen van elk experiment dat werd gebruikt voor statistische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle drie de soorten inserts (A, B, C) die in dit experiment worden gebruikt, hebben dezelfde poriegrootte van 0,4 μm. Het enige verschil tussen hen is de insert-to-base hoogte, waardoor afstanden tussen de twee samengekweekte cellagen respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm kunnen zijn (figuur 3) en dat ze van verschillende leveranciers zijn (zie tabel met materialen voor details).
Om een in vitro co-kweekmodel op te zetten met afzonderlijke lagen van twee cellijnen die HR ondergaan om IR-letsel te simuleren, onderzochten we de celmembraanintegriteit van CM's die met of zonder EC's werden gekweekt. Door gebruik te maken van een aparte insert voor EC's die op verschillende afstanden boven de CM-laag kunnen worden geplaatst, konden we ook de differentiële effecten van cellaagafstand op de ernst van membraanschade in de CM's beoordelen. In een aparte reeks experimenten varieerden we de dichtheid van EC's en dus de verhouding tussen EC's en CM's. Bovendien, om gesimuleerde ischemie te onderscheiden van gesimuleerd IR-letsel, werden experimenten uitgevoerd onder omstandigheden van 1) normoxie, 2) alleen hypoxie en 3) HR. Voor dit model gebruikten we 24 uur hypoxie, gevolgd door 2 uur reoxygeatie.
Variabele afstanden
0,5 mm afstand tussen de cellagen (Insert A)
Wanneer CM's alleen werden gekweekt, leidde hypoxie tot een significant verhoogde LDH-afgifte in vergelijking met normoxie, in overeenstemming met onze eerdere studies (figuur 4A)6. De LDH was echter slechts licht verder verhoogd na 2 uur reoxygenatie in vergelijking met de hypoxie-only groep. Wanneer EC's en CM's samen werden gekweekt op een afstand van 0,5 mm, was de toename van de LDH-afgifte door hypoxie alleen niet verzwakt, wat aangeeft dat de EC's geen beschermend effect vertoonden (vergeleken met CMs alleen groep onder de hypoxie-only omstandigheden). EC's oefenden echter een milde maar significante bescherming uit op CM's tijdens HR.
1,0 mm afstand tussen de cellagen (Insert B)
Hetzelfde experiment werd uitgevoerd als hierboven, behalve dat de afstand tussen de twee cellagen werd vergroot tot 1,0 mm (figuur 4B). We ontdekten dat de LDH-afgifte ook significant was verhoogd in CM's - alleen door hypoxie- alleen. In tegenstelling tot in de insert van 0,5 mm, werd de LDH-toename in CMs-only echter versterkt door HR over alleen hypoxie. Bovendien werd deze potentiëring meer geremd en bijna afgeschaft door de aanwezigheid van de EC's tijdens reoxygenatie in vergelijking met de CMs-only groep.
2,0 mm afstand tussen de cellagen (Insert C)
Wanneer co-kweek inserts werden gebruikt die een afstand van 2,0 mm tussen de twee cellijnen creëren (figuur 4C), vonden we ook een significante toename van LDH-afgifte door CM's - alleen tijdens hypoxie, in dezelfde mate als in de 0,5 mm- en de 1,0 mm-experimenten. Interessant is echter dat de extra toename van LDH-afgifte door reoxygenatie nog meer uitgesproken was dan in de 1,0 mm-experimenten. Beide verhogingen werden verzwakt, maar niet afgeschaft, door de aanwezigheid van EC's, wat aangeeft dat ec's, anders dan het gebruik van inserts van 0,5 of 1,0 mm, CM's aanzienlijk beschermden tegen letsel onder zowel hypoxie-only als HR-omstandigheden.
Variabele EC-intensiteiten
In een andere reeks experimenten werd de concentratie van EC's verguld in inserts van 2,0 mm getitreerd tot respectievelijk 25.000, 50.000 en 100.000 cellen per insert. LDH-afgifte werd gemeten na 24 uur hypoxie gevolgd door 2 uur reoxygenatie. Onze resultaten toonden aan dat toenemende EC-intensiteit in de co-cultuur leidde tot een dosisafhankelijke verzwakking van LDH-afgifte veroorzaakt door HR (figuur 5); een dergelijk effect werd niet waargenomen onder normoxische omstandigheden.
Figuur 1: Schema van de insert in de put. De inserts met de EC's (tot 100.000 cellen per insert) worden overgebracht naar de 24-well platen met de CMs (300.000 per put) op hun bodem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimenteel ontwerp. Cellen worden gekweekt onder normale zuurstofomstandigheden (21% O2) en vervolgens opgesplitst in twee groepen: een normoxische controlegroep zal nog 24 uur onder normale omstandigheden worden gekweekt, terwijl de hypoxiegroep gedurende 24 uur in een hypoxiekamer wordt gekweekt met slechts 0,01% O2 en geen glucose. Na deze 24-uursinterventies worden beide groepen cellen ververst met media en continu gekweekt in een 21% O2-omgeving gedurende nog eens 2 uur, de reoxygenatiefase, voordat uiteindelijk de eindpunttest (en) wordt uitgevoerd, bijvoorbeeld LDH-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Afbeeldingen en schema's van de drie verschillende inserts. De afstand tussen de endotheelcellen in de insert en de cardiomyocyten aan de onderkant van de put kan worden gevarieerd door verschillende inserts te gebruiken. Alle drie de soorten inserts die hier worden gebruikt, hebben dezelfde poriegrootte van 0,4 μm. Het enige verschil tussen hen is de insert-to-base hoogte, waardoor de afstanden tussen de twee samen gekweekte cellagen respectievelijk 0,5 (A), 1,0 (B) en 2,0 mm (C) kunnen zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van drie soorten kweekinzetstukken bij de beoordeling van de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH; in absorptie-eenheden [au]) onder normoxische (links), alleen hypoxie (midden) en hypoxie/reoxygenatiecondities (rechts) voor cardiomyocyten alleen (CM; wit), endotheelcellen alleen (EC; zwart) en coculturen van CM met EC (controlepatroon). (A) 0,5 mm afstand, (B) 1,0 mm afstand, C) 2,0 mm afstand tussen de twee verschillende cellagen. EC's werden verguld met een dichtheid van 100.000 cellen per insert, CM's met een dichtheid van 300.000 cellen per put. De gegevens zijn gemiddeld ± standaarddeviatie, n = 4 per groep. Statistiek: ANOVA gevolgd door Student-Newman-Keuls post-hoc test. P < 0,05 (tweezijdig) aangegeven door horizontale balken tussen elk vergeleken paar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Concentratie van co-gekweekte endotheelcellen (EC; 25: 25.000 cellen per insert; 50:50.000 cellen per insert; 100: 100.000 cellen per insert) dosisafhankelijke beïnvloede bescherming van cardiomyocyten (CM) tegen hypoxie/reoxygenatieschade (rechts) in vergelijking met normoxische omstandigheden (links), zoals blijkt uit de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH; in absorptie-eenheden [au]). EC's hadden geen effect op de LDH-afgifte onder normoxische omstandigheden. De gegevens zijn gemiddeld ± standaarddeviatie, n = 4 per groep. Statistiek: ANOVA gevolgd door Student-Newman-Keuls post-hoc test. P < 0,05 (tweezijdig) aangegeven door horizontale balken tussen elk vergeleken paar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen in het protocol
Celco-cultuurmodellen zijn gebruikt om cellulaire mechanismen van cardioprotectie te bestuderen. Het creëren van twee afzonderlijke lagen met een betekenisvolle afstand ertussen is dus cruciaal voor de ontwikkeling van een geschikt co-cultuurmodel. Een uitdaging bij het bestuderen van gesimuleerde IR, d.w.z. HR, letsel is dat niet alleen ischemie (hypoxie) zelf, maar ook reperfusie (reoxygenatie) cellulaire disfunctie verergert. Daarom moet een realistisch model deze kenmerken weerspiegelen door bijvoorbeeld voldoende verhoogd letsel door reoxygenatie na hypoxie aan te tonen in tegenstelling tot hypoxie alleen, maar nog steeds verzwakking van letsel mogelijk te maken met celbeschermende geneesmiddelen of strategieën zoals, in ons geval, de aanwezigheid van EC's. Interessant is dat de afstand tussen de twee cellagen een belangrijke rol lijkt te spelen bij het ontwikkelen van een geschikt co-kweekmodel. We konden aantonen dat een afstand van 1,0 mm en een afstand van 2,0 mm tussen EC's en CM's de verwachte HR-letselrespons mogelijk maakte, maar, nog belangrijker, dat slechts 2,0 mm een consistent gunstig resultaat opleverde voor cellulaire letselbescherming door de aanwezigheid van EC's onder zowel hypoxische als HR-omstandigheden.
Wijzigingen en probleemoplossing van de methode
Cel-cel interacties in co-cultuur modellen worden beïnvloed door meerdere variabelen zoals het aantal verschillende co-gekweekte populaties, de mate van gelijkenis van de celtypen, de mate van fysieke scheiding tussen hen, het verschil tussen populatie lokale omgevingen, het volume van culturen en timing rekening houdend met de co-cultuur 9,10,11,12 . Er bestaan afwegingen tussen deze factoren. Deze interacties worden sterk beïnvloed door de omgeving, die op zijn beurt wordt bepaald door het protocol en de opstelling. Het is van cruciaal belang om experimentele modellen te ontwikkelen die repliceerbaar, meetbaar en vergelijkbaar zijn. Onze aanpak was om het aantal variabelen te controleren en te beperken dat de consistentie van de gegevens verkregen uit verschillende experimenten die op verschillende tijdstippen werden uitgevoerd, kan verstoren door een nauwkeurig aantal cellen te platen, met dezelfde verhouding van twee co-gekweekte cellijnen, dezelfde volumes van de celkweekmedia en assay-reagentia, enz., Met uitzondering van de drie verschillende celkweekinzetstukken.
Beperkingen van de methode
Ons model werkt goed met EC's en CM's, waarschijnlijk te danken aan de alomtegenwoordige aanwezigheid van EC's in het cardiovasculaire systeem. Hoe goed andere soorten cellijnen van potentieel belang interageren met CM's, neuronen of andere cellen die van belang zijn om in vitro te worden bestudeerd, moet nog worden geëvalueerd, omdat verschillende cellijnen anders kunnen interageren in de co-kweekomgeving. Een verschil tussen de co-gekweekte celpopulaties kan hun ecologische relatie zijn, bijvoorbeeld als ze natuurlijke concurrenten of coöperanten zijn. Ook, net als in alle andere in vitro celmodellen, vertegenwoordigt de gegenereerde cellulaire schade in het experiment mogelijk niet de werkelijke pathofysiologische toestand van letsel in vivo. Verder erkennen we dat de geteste afstanden tussen EC's en CM's van 0,5, 1,0 en 2,0 mm hun afstand in vivo niet reproduceren; voor het gegeven in vitro model; onze resultaten beschrijven echter de implicaties van optimale afstand tussen twee cellagen die moeten worden bestudeerd door wetenschappers die van deze techniek gebruik willen maken.
De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden
De bestaande/alternatieve co-kweekmethoden omvatten het direct mengen van cellijnen of het creëren van een gescheiden omgeving met een mate van scheiding, zoals het gebruik van transwellplaten13, microfluïdische platforms14 of driedimensionale steigers15, waarvan transwellplaten de minst dure en gemakkelijkst beschikbare zijn. Ondanks natuurlijke beperkingen zijn coculturen zeer relevant voor geneesmiddelenonderzoek omdat ze een representatiever in vivo-achtig weefselmodel bieden en testen met hoge doorvoer en diepgaande monitoring van geneesmiddeleffecten op cel-celinteractiesmogelijk maken 16. Ons model werd nauwkeurig gekalibreerd met behulp van goed gedefinieerde ruimtelijke afstanden tussen EC's en CM's, in plaats van een compleet en ongecontroleerde mengsel van twee verschillende soorten cellen. Bovendien maakt dit model afzonderlijke behandelingen mogelijk en analyseert het individuele soorten cellen, wat onmogelijk te bereiken is in een gemengde co-cultuur, om nog maar te zwijgen van in vivo. Omdat IR-letsel afzonderlijke HR-processen omvat, is dit model zeer geschikt om de cellulaire mechanismen van ischemie / hypoxie versus reperfusie / reoxygenatieschade afzonderlijk te bestuderen. Onze gegevens suggereren dat het een zeer waardevol en efficiënt celcocultuurmodel kan zijn dat kan worden gebruikt in gesimuleerde IR-letselstudies. Onze waarnemingen geven duidelijk aan dat een optimale ruimtelijke afstand, in ons geval 2,0 mm, nodig is voor EC's om te kruisen met CM's in dit specifieke co-cultuurmodel, zodat potentieel uitgescheiden signaalmoleculen door de EC's effectief kunnen circuleren tot ongeoorloofde bescherming van CM's tegen letsel door alleen hypoxie en / of HR.
Belang en potentiële toepassingen van de methoden in specifieke onderzoeksgebieden
Ons model geeft het belang aan van het combineren van ec's met kransslagaders van muizen met muis-CM's om het onderzoek naar beschermende maatregelen tegen HR-letsel te verbeteren; dat het variëren van de ruimtelijke afstand van coculturen een effectieve manier is om de ruimtelijke omstandigheden die van invloed zijn op de beschermende werking van EC's op CM-letsel veroorzaakt door HR beter te begrijpen; en dat de dichtheid van EC's of de EC-CM-verhouding positief gecorreleerd is met de mate van bescherming tegen HR-letsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Us Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) en door institutionele fondsen aan M.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
References
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).
- Gottlieb, R. A. Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).
- Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease. The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury. Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Martindale, J. J., Metzger, J. M. Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).
- vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device. Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).
- Bidarra, S. J., et al. Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells. Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PloS One. 6, 25661 (2011).
- Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures. PloS One. 7, 31711 (2012).
- Miki, Y., et al. The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6, 25661 (2011).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).
