Summary
Rumlig afstand er en nøgleparameter i vurderingen af hypoxi / reoxygeneringsskade i en co-kulturmodel af separate endotel- og kardiomyocytcellelag, hvilket for første gang tyder på, at optimering af co-kulturens rumlige miljø er nødvendig for at tilvejebringe en gunstig in vitro-model til test af endotelcellernes rolle i kardiomyocytbeskyttelse.
Abstract
Iskæmisk hjertesygdom er den førende dødsårsag og handicap på verdensplan. Reperfusion forårsager yderligere skade ud over iskæmi. Endotelceller (ECs) kan beskytte kardiomyocytter (PM'er) mod reperfusionsskade gennem celle-celleinteraktioner. Co-kulturer kan hjælpe med at undersøge rollen som celle-celle interaktioner. En blandet co-kultur er den enkleste tilgang, men er begrænset, da isolerede behandlinger og downstream-analyser af enkeltcelletyper ikke er mulige. For at undersøge, om EU'er kan dosisafhængigt dæmpe CM-celleskader, og om denne beskyttelse kan optimeres yderligere ved at variere kontaktafstanden mellem de to cellelinjer, brugte vi Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells og Adult Mouse Cardiomyocytes til at teste tre typer cellekulturindsatser, der varierede i deres intercellelagsafstand ved 0,5, Henholdsvis 1,0 og 2,0 mm. Kun ved CMs steg cellulær skade som vurderet ved laktatdehydrogenase (LDH) frigivelse signifikant under hypoxi og yderligere ved reoxygenering, når afstanden var 2,0 mm sammenlignet med 0,5 og 1,0 mm. Når EC'er og PM'er var i næsten direkte kontakt (0,5 mm), var der kun en mild dæmpning af CM'ernes reoxygeneringsskade efter hypoxi. Denne dæmpelse blev signifikant øget, når den rumlige afstand var 1,0 mm. Med en afstand på 2,0 mm dæmpede ECs CM-skade under både hypoxi og hypoxi/reoxygenering, hvilket indikerer, at tilstrækkelig kulturafstand er nødvendig for, at EC'er kan krydstale med CM'er, således at udskillede signalmolekyler kan cirkulere og fuldt ud stimulere beskyttelsesveje. Vores resultater tyder for første gang på, at optimering af EF/CM-samkulturens rumlige miljø er nødvendig for at tilvejebringe en gunstig in vitro-model til test af EC'ernes rolle i CM-beskyttelse mod simuleret iskæmi/reperfusionsskade. Målet med denne rapport er at give en trinvis tilgang for efterforskere til at bruge denne vigtige model til deres fordel.
Introduction
Iskæmisk hjertesygdom er den største dødsårsag og handicap på verdensplan 1,2. Imidlertid kan behandlingsprocessen for reperfusion i sig selv forårsage kardiomyocytdød, kendt som myokardieiskæmi / reperfusion (IR) skade, for hvilken der stadig ikke er noget effektivt middel3. Endotelceller (EC'er) er blevet foreslået at beskytte kardiomyocytter (PM'er) gennem udskillelse af parakrine signaler samt celle-til-celle-interaktioner4.
Celle-co-kultur modeller er blevet brugt i vid udstrækning til at undersøge rollen autokrine og / eller parakrine celle-celle interaktioner på cellefunktion og differentiering. Blandt co-kulturmodeller er blandet co-kultur den enkleste, hvor to forskellige typer celler er i direkte kontakt inden for et enkelt kulturrum ved et ønsket celleforhold5. Imidlertid er separate behandlinger mellem celletyper og downstream-analyse af en enkelt celletype ikke let gennemførlige i betragtning af den blandede population.
Tidligere undersøgelser viste, at hypoxiske og iskæmiske fornærmelser forårsager betydelig skade på cellemembranens integritet målt ved frigivelse af laktatdehydrogenase (LDH). Denne skade forværres ved reiltning, efterligner reperfusionsskade 6,7,8. Målet med den nuværende protokol var at teste hypoteserne om, at tilstedeværelsen af EC'er kan dosisafhængigt dæmpe cellemembranlækage af PM'er forårsaget af hypoxi og reoxygenering (HR), og at den beskyttende virkning af ECs kan optimeres ved at variere kontaktafstanden mellem de to cellelinjer. Således anvendte vi tre typer cellekulturindsatser og Musens primære koronararterieendotelceller og voksne muskardiomyocytter. Indsatserne, mærket af Corning, Merck Millipore og Greiner Bio-One, tillod os at skabe tre forskellige cellekultur crosstalk-betingelser med intercellelinjeafstande på henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm. 100.000 PC'er blev belagt pr. indsats i hvert tilfælde.
For at afgøre, om tætheden af EC'er i co-kultur bidrager til hr-skadedæmpning i denne model, undersøgte vi desuden dosis-respons-forholdet mellem EF-koncentration og LDH-frigivelse ved CM'er. EC'er blev belagt med henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 pr. indsats i 2,0 mm-indsatsen.
Denne rapport giver en trinvis tilgang for efterforskere til at bruge denne vigtige model til deres fordel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Eksperimentel forberedelse/plettering
- Vedligehold PM'er og PC'er i henhold til producentens anvisninger.
- Tø begge cellelinjer op, når de ankommer fra leverandører. Plade i T25-kolber efter at være blevet vasket med friske medier. Det anbefales at købe hvert cellekulturmedie fra de samme leverandører, som cellerne blev købt fra. Den næste dag skal du opdatere cellerne med medier og bruge dem, når de er sammenflydende.
- Oprethold cellekulturinkubatoren ved 37 ° C med 21%O2, 5% CO2, 74%N2 og hold den befugtet.
BEMÆRK: Musens primære koronararterieendotelceller, der anvendes i denne protokol, isoleres fra koronararterier af C57BL / 6-mus, og voksne muskardiomyocytter isoleres fra voksne C57BL / 6J musehjerter og opnås kommercielt (se materialetabel).
- Plade-CM'er under sterile forhold på bunden af 24-brønds plader (underordnet lag). 24 timer senere, plade PC'er i indsatsen (eller overlegen del) af co-kulturbrønden. 24 timer efter EF-belægning anbrings EC-indsatser på CM-pladebaser, idet co-kulturperioden påbegyndes. Lad cellerne co-kultur i mindst 12-24 timer før brug. Disse trin er beskrevet detaljeret nedenfor.
- Estimer CM-cellelinjesammenløb under et lysmikroskop. Når celler ser ud til at være 90%-100% sammenflydende i dyrkningskolber, fortsæt med eksperimentel plettering.
- Mediet fjernes fra kolberne, der indeholder sammenflydende cellekulturer, og trypsiniseres med 3-5 ml Trypsin/ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) for T25-kolber. Kolben omrøres forsigtigt, inkuberes ved 37 °C i 2-5 min., og den enzymatiske udvikling vurderes derefter under et lysmikroskop. Når cellerne begynder at runde op, skal du bruge en celleskraber til at løsne cellerne fra overfladen.
- Efter løsrivelse inaktiveres trypsinopløsningen ved at tilsætte trypsin/celleopløsningen til et 50 ml rør indeholdende 10 ml medier til T25-kolber. Centrifugering af cellesuspensionen ved 120 x g i 2 minutter for at opnå en blød cellepille. Fjern supernatanten, og ophæd pelleten igen i 5 ml medier.
- For at udføre celletælling og bekræfte cellelevedygtighed blandes en alikvote på 10 μL resuspenderede celler og 10 μL trypanblåt farvestof. Tæl de levende celler ved hjælp af en celletæller. Fortynd cellerne med friske regelmæssige medier for at opnå de ønskede såtætheder. Volumener beregnes afhængigt af den ønskede frøtæthed og cellekoncentration af stamopløsninger. Al plettering skal udføres under sterile forhold.
- Plade-PM'er ved såningstætheder på 300.000 pr. Brønd på bunden af en 24-brønds plade forbelagt med ekstracellulær matrix. Vedligehold cellerne ved 37 °C med 21 %O2 og 5 % CO2 natten over.
- Efter 24 timer plades EKSTRA'er i skær med en optimal belægningstæthed på 100.000 pr. indsats (dyrkningsarealet er 33,6 mm2) (figur 1). Efter 24 timers EC-plettering anbrings EC-indsatser inde i CM-brøndene og indleder samkultur. Tillad celler at co-kultur i 12-24 timer, før de udfører eksperimenterne.
- Sørg for, at både PM'er og EC'er, når eksperimenterne udføres, har nået 80%-90% sammenflydende.
2. Hypoxi / reoxygenering for at simulere iskæmi / reperfusionsskade in vitro
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres som beskrevet, ikke pause imellem.
- Forbered det hypoxiske medie ved at hælde ~ 25 ml medier i et 50 ml konisk rør. Luftforsegl toppen med en silikonemembran og brug en steriliseret pipette til at slå et hul. Opret endnu et hul, denne gang efterlader pipetten nedsænket ca. 2/3 i mediet.
- Skyl mediet med hypoxisk gas (0,0125%O2, 5% CO2, 94,99%N2) i 5 minutter med en strømningshastighed på 30 L/min. Dette minimererO2 opløst i medierne, når hypoxi starter (trin 2.5).
- Kassér mediet af de 24 brønds plader eller kulturindsatser, der indeholder vedhæftede celler, og vask med 100 μL/brønd af 10% fosfatbufret saltvand (PBS) meget forsigtigt. Derefter tilsættes 500 μL af det frisklavede hypoxiske medie til hver brønd af pladerne eller indsatserne.
BEMÆRK: Hypoxi i medierne afbrydes så kort som muligt under dette trin, før ægte hypoxi for celler og medier starter i trin 2.5.- I den normoxiske kontrolgruppe skal du erstatte det originale medie med friske normale medier indeholdende glucose og serum.
- Befugt hypoxikammeret ved at placere en petriskål fyldt med sterilt vand i kammeret. Placer derefter pladerne, der omfatter de hypoxiske grupper, i kammeret.
- Skyl hypoxikammeret med hypoxisk gas (0,0125%O2, 5% CO2, 94,99%N2) i 5 minutter ved en strøm på 30 L / min. Anbring kammeret i 37 °C-inkubatoren i 24 timer.
- Efter hypoxi dyrkes PM'er og PC'er under normale forhold. For at gøre dette skal du kassere pladernes/indsatsernes gamle medier, erstatte det med normale medier (indeholdende glucose og serum; 500 μL af hver brønd/indsats) og opbevare det i inkubatoren under normale dyrkningsbetingelser (21 %O2, 5 % CO2, 74 %N2, 37 °C) i 2 timer for at efterligne reperfusion.
- For at kontrollere for eventuelle virkninger af medieudskiftning skal du ændre mediet af normoxiske celler samtidig med, at det hypoxiske medie ændres.
BEMÆRK: Figur 2 giver et skematisk overblik over denne protokol.
3. Vurdering af slutpunkter
- Overfør cellekulturmediet fra pladen med 24 brønde til en plade med 96 brønde. Brug 200 μL medier fra hver brønd på 24-brøndspladen og fordel ligeligt i fire brønde af 96-brøndpladen i overensstemmelse hermed. Brug en plade hver til normoxia versus hypoxi versus HR.
- Bestem graden af cellulær skade, f.eks. ved at måle absorbans for LDH ved hjælp af et cytotoksicitetsanalysesæt efter producentens anvisninger. Udfør assayet i en 96-brønds plade som beskrevet i assayprotokollen.
4. Statistik
- Vis de parametriske data som middel-/standardafvigelse og ikke-parametriske data som boksdiagramter med median/interkvartilområde. Der bør udføres passende parametriske versus ikke-parametriske multiple sammenligningstest med acceptable post-hoc-test for at mindske risikoen for en type 1-fejl. Signifikans er typisk sat til en alfa på 0,05 (to-halet).
- For alle de eksperimenter, der udføres i den aktuelle undersøgelse, skal du udføre mindst tre brøndreplikater inden for et eksperiment. Der var tre til seks gentagelser af hvert eksperiment, der blev brugt til statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle tre typer indsatser (A, B, C), der anvendes i dette eksperiment, har samme porestørrelse på 0,4 μm. Den eneste forskel mellem dem er insert-to-base-højden, som gør det muligt for afstande mellem de to samkulturelle cellelag at være henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm (figur 3), og at de er fra forskellige leverandører (for detaljer se Tabel over materialer).
For at etablere en in vitro-co-kulturmodel med separate lag af to cellelinjer, der gennemgår HR for at simulere IR-skade, undersøgte vi cellemembranintegriteten af CM'er, der dyrkes sammen med eller uden EF'er. Brug af en separat indsats til PC'er, der kan placeres i forskellige afstande over CM-laget, gjorde det muligt for os også at vurdere de differentielle virkninger af cellelagsafstand på sværhedsgraden af membranskader i CM'erne. I et separat sæt eksperimenter varierede vi tætheden af EU'er og dermed forholdet mellem EC'er og PM'er. For at differentiere simuleret iskæmi fra simuleret IR-skade blev eksperimenter desuden udført under betingelser på 1) normoxia, 2) hypoxi kun og 3) HR. Til denne model brugte vi 24 timers hypoxi efterfulgt af 2 timers reoxygenering.
Variable afstande
0,5 mm afstand mellem cellelagene (Indsæt A)
Når PM'er blev dyrket alene, førte hypoxi til en signifikant øget LDH-frigivelse sammenlignet med normoxia, i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser (figur 4A)6. LDH blev dog kun mildt yderligere forøget ved 2 timers reoxygenering sammenlignet med gruppen kun hypoxi. Når EC'er og PM'er blev dyrket sammen på en afstand af 0,5 mm, blev stigningen i LDH-frigivelsen ved kun hypoxi ikke dæmpet, hvilket indikerer, at DE EC'erne ikke viste nogen beskyttende virkning (sammenlignet med CM'er alene gruppe under hypoxi-eneste betingelser). EØS'erne udøvede imidlertid en mild, men betydelig beskyttelse af DE CM'er under HR.
1,0 mm afstand mellem cellelagene (Indsæt B)
Det samme eksperiment blev udført som ovenfor, bortset fra at afstanden mellem de to cellelag blev øget til 1,0 mm (figur 4B). Vi fandt ud af, at LDH-frigivelsen også var signifikant øget i CMs - kun ved hypoxi. I modsætning til i 0,5 mm-indsatsen blev LDH-stigningen i kun CMs-only forstærket af HR over hypoxi-only. Desuden blev denne potensering mere hæmmet og næsten afskaffet af tilstedeværelsen af DE ECs under reoxygenering sammenlignet med CMs-only-gruppen.
2,0 mm afstand mellem cellelagene (Indsæt C)
Når co-kulturindsatser, der skaber en afstand på 2,0 mm mellem de to cellelinjer (figur 4C), blev anvendt, fandt vi også en signifikant stigning i LDH-frigivelsen ved CMs-only under hypoxi, i samme grad som i 0,5 mm- og 1,0 mm-eksperimenterne. Interessant nok var den yderligere stigning i LDH-frigivelse ved reoxygenering imidlertid endnu mere udtalt end i 1,0 mm-eksperimenterne. Begge disse stigninger blev dæmpet, men ikke afskaffet, af tilstedeværelsen af EU'er, hvilket tyder på, at i forhold til at anvende 0,5 eller 1,0 mm skær beskyttede DECC'er betydeligt CM'er mod skader under både hypoxi- og HR-forhold.
Variable EF-intensiteter
I et andet sæt eksperimenter blev koncentrationen af ECs belagt i 2,0 mm skær titreret til henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 celler pr. Indsats. LDH-frigivelse blev målt efter 24 timers hypoxi efterfulgt af 2 timers reoxygenering. Vores resultater viste, at stigende EC-intensitet i samkulturen førte til en dosisafhængig dæmpning af LDH-frigivelse forårsaget af HR (figur 5); ingen sådan effekt blev set under normoxiske forhold.
Figur 1: Skematisk indsats inde i brønden. Indsatserne med PC'erne (op til 100.000 celler pr. Indsats) overføres til pladerne med 24 brønde med PM'erne (300.000 pr. Brønd) i bunden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksperimentelt design. Celler dyrkes under normale iltforhold (21%O2) og opdeles derefter i to grupper: En normoxisk kontrolgruppe vil fortsat blive dyrket under normale forhold i yderligere 24 timer, mens hypoxigruppen vil blive dyrket i et hypoxikammer i 24 timer med kun 0,01%O2 og ingen glucose. Efter disse 24 timers interventioner opdateres begge grupper af celler med medier og dyrkes kontinuerligt i et 21%O2-miljø i yderligere 2 timer, reoxygeneringsfasen, før de til sidst udfører endepunktsassayet (e), f.eks. LDH-analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Billeder og skemaer over de tre forskellige indsatser. Afstanden mellem endotelcellerne i indsatsen og kardiomyocytterne i bunden af brønden kan varieres ved hjælp af forskellige indsatser. Alle tre typer indsatser, der anvendes her, har samme porestørrelse på 0,4 μm. Den eneste forskel mellem dem er insert-to-base-højden, som gør det muligt for afstandene mellem de to samkulturelle cellelag at være henholdsvis 0,5 (A), 1,0 (B) og 2,0 mm (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sammenligning af tre typer kulturindsatser ved vurdering af frigivelsen af laktatdehydrogenase (LDH; i absorbansenheder [au]) under normoxiske (venstre), hypoxi-only (center) og hypoxi/reoxygeneringsbetingelser (højre) for kardiomyocytter alene (CM; hvid), endotelceller alene (EC; sort) og co-kulturer af CM med EC (kontrolmønster). (A) 0,5 mm afstand, (B) 1,0 mm afstand, C) 2,0 mm afstand mellem de to forskellige cellelag. ECs blev belagt med en densitet på 100.000 celler pr. Indsats, PM'er med en densitet på 300.000 celler pr. Brønd. Data er gennemsnitlige ± standardafvigelse, n = 4 pr. Gruppe. Statistik: ANOVA efterfulgt af Student-Newman-Keuls post-hoc test. P < 0,05 (tohalet) angivet med vandrette stænger mellem hvert sammenlignet par. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Koncentration af samdyrkede endotelceller (EF; 25: 25.000 celler pr. indsats; 50: 50.000 celler pr. indsats; 100: 100.000 celler pr. indsats) dosisafhængigt påvirket beskyttelse af kardiomyocytter (CM) mod hypoxi/reoxygeneringsskade (højre) sammenlignet med normoxiske tilstande (venstre) som det fremgår af frigivelse af lactatdehydrogenase (LDH; i absorbansenheder [au]). EC'er havde ingen effekt på LDH-frigivelse under normoxiske forhold. Data er gennemsnitlige ± standardafvigelse, n = 4 pr. Gruppe. Statistik: ANOVA efterfulgt af Student-Newman-Keuls post-hoc test. P < 0,05 (tohalet) angivet med vandrette stænger mellem hvert sammenlignet par. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Celle co-kultur modeller er blevet brugt til at studere cellulære mekanismer for kardiobeskyttelse. Hvordan man skaber to separate lag med en meningsfuld afstand mellem dem, er således afgørende for udviklingen af en passende co-kulturmodel. En udfordring ved at studere simuleret IR, dvs. HR, skade er, at ikke kun iskæmi (hypoxi) selv, men også reperfusion (reoxygenering) forværrer cellulær dysfunktion. Derfor skal en realistisk model afspejle disse egenskaber ved f.eks. at påvise tilstrækkelig øget skade ved reoxygenering efter hypoxi i modsætning til hypoxi alene, men stadig tillade dæmpning af skade med cellebeskyttende lægemidler eller strategier som i vores tilfælde tilstedeværelsen af EF'er. Interessant nok synes afstanden mellem de to cellelag at spille en vigtig rolle i udviklingen af en passende co-kulturmodel. Vi var i stand til at påvise, at en afstand på 1,0 mm og en afstand på 2,0 mm mellem EC'er og PM'er tillod den forventede HR-skaderespons, men endnu vigtigere, at kun 2,0 mm gav et konsekvent gunstigt resultat for beskyttelse mod cellulær skade ved tilstedeværelsen af EC'er under både hypoxiske og HR-forhold.
Ændringer og fejlfinding af metoden
Celle-celle-interaktioner i co-kulturmodeller påvirkes af flere variabler såsom antallet af forskellige co-dyrkede populationer, graden af lighed mellem celletyperne, graden af fysisk adskillelse mellem dem, forskellen mellem befolkningens lokale miljøer, mængden af kulturer og timing overvejelse af co-kulturen 9,10,11,12 . Der findes afvejninger mellem disse faktorer. Disse interaktioner påvirkes stærkt af miljøet, som igen bestemmes af protokollen og opsætningen. Det er afgørende at udvikle eksperimentelle modeller, der er replikerbare, målbare og sammenlignelige. Vores tilgang var at kontrollere og begrænse antallet af variabler, der kan forstyrre konsistensen af de data, der opnås fra forskellige eksperimenter udført på forskellige tidspunkter ved at plettere et nøjagtigt antal celler ved hjælp af det samme forhold mellem to samdyrkede cellelinjer, de samme volumener af cellekulturmediet og assayreagenser osv., Med undtagelse af de tre forskellige cellekulturindsatser.
Begrænsninger af metoden
Vores model fungerer godt med EF'er og CM'er, sandsynligvis på grund af den allestedsnærværende tilstedeværelse af EF'er i det kardiovaskulære system. Hvor godt andre typer cellelinjer af potentiel interesse interagerer med CM'er, neuroner eller andre celler af interesse, der skal undersøges in vitro , skal endnu ikke evalueres, da forskellige cellelinjer kan interagere forskelligt i co-kulturmiljøet. En forskel mellem de samkultivkede cellepopulationer kan være deres økologiske forhold, f.eks. hvis de er naturlige konkurrenter eller samarbejdspartnere. Som i alle andre in vitro-cellemodeller repræsenterer den genererede cellulære skade i eksperimentet muligvis ikke den faktiske patofysiologiske tilstand af skade in vivo. Desuden anerkender vi, at de testede afstande mellem EF'er og PM'er på 0,5, 1,0 og 2,0 mm ikke gengiver deres afstand in vivo; for den givne in vitro-model Vores resultater beskriver imidlertid konsekvenserne af optimal afstand mellem to cellelag, der skal undersøges af forskere, der gerne vil drage fordel af denne teknik.
Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
De eksisterende/alternative co-dyrkningsmetoder omfatter direkte blanding af cellelinjer eller skabelse af adskilte omgivelser med en grad af adskillelse, f.eks. anvendelse af transwellplader13, mikrofluidiske platforme14 eller tredimensionelle stilladser15, blandt hvilke transbrøndplader er de billigste og lettest tilgængelige. På trods af naturlige begrænsninger er co-kulturer yderst relevante for lægemiddelforskning, fordi de giver en mere repræsentativ in vivo-lignende vævsmodel og giver mulighed for test med høj kapacitet og dybdegående overvågning af lægemiddeleffekter på celle-celle-interaktioner16. Vores model blev nøjagtigt kalibreret ved hjælp af veldefinerede rumlige afstande mellem EF'er og CM'er i stedet for en komplet og ukontrolleret blanding af to forskellige typer celler. Desuden tillader denne model separate behandlinger og analyser af individuelle typer celler, hvilket er umuligt at opnå i en blandet co-kultur, for ikke at nævne in vivo. Fordi IR-skade involverer separate HR-processer, er denne model velegnet til at studere de cellulære mekanismer for iskæmi / hypoxi vs reperfusion / reoxygeneringsskader separat. Vores data tyder på, at det kan være en meget værdifuld og effektiv cellekulturmodel, der skal bruges i simulerede IR-skadesundersøgelser. Vores observationer viser klart, at en optimal rumlig afstand, i vores tilfælde 2,0 mm, er nødvendig for, at EF'er kan krydstale med CM'er i denne specifikke co-kulturmodel, således at EF'ernes potentielt udskillede signalmolekyler kan cirkulere effektivt til ulovlig beskyttelse af CM'er mod skade forårsaget af hypoxi og/eller HR.
Betydning og potentiel anvendelse af metoderne inden for specifikke forskningsområder
Vores model indikerer betydningen af at kombinere MUS KORONARARTERIE-EF'ER MED MUSE-CM'ER FOR AT FORBEDRE UNDERSØGELSEN AF BESKYTTELSESFORANSTALTNINGER MOD HR-SKADER; at en variation i samkulturernes rumlige afstand viser en effektiv måde til bedre at forstå de rumlige forhold, der påvirker EF'ernes beskyttende virkning på CM-skader forårsaget af MEN; og at tætheden af EC'er eller EC-cm-forholdet er positivt korreleret med omfanget af beskyttelsen mod personskade på menneskerettighedslisten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) og af institutionelle midler til M.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
References
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).
- Gottlieb, R. A. Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).
- Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease. The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury. Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Martindale, J. J., Metzger, J. M. Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).
- vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device. Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).
- Bidarra, S. J., et al. Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells. Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PloS One. 6, 25661 (2011).
- Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures. PloS One. 7, 31711 (2012).
- Miki, Y., et al. The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6, 25661 (2011).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).
