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Biology

कार्डियक Ischemia / Reperfusion इन विट्रो की नकल करने के लिए एक सेल सह-संस्कृति मॉडल का विकास

Published: October 13, 2021 doi: 10.3791/62913
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

Summary

अलग-अलग एंडोथेलियल और कार्डियोमायोसाइट्स सेल परतों के सह-संस्कृति मॉडल में हाइपोक्सिया / रीऑक्सीजनेशन चोट का आकलन करने में स्थानिक दूरी एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, यह सुझाव देते हुए कि पहली बार, सह-संस्कृति स्थानिक वातावरण को अनुकूलित करना कार्डियोमायोसाइट्स सुरक्षा में एंडोथेलियल कोशिकाओं की भूमिका का परीक्षण करने के लिए एक अनुकूल इन विट्रो मॉडल प्रदान करने के लिए आवश्यक है।

Abstract

इस्केमिक हृदय रोग दुनिया भर में मृत्यु और विकलांगता का प्रमुख कारण है। Reperfusion ischemia से परे अतिरिक्त चोट का कारण बनता है। एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) सेल-सेल इंटरैक्शन के माध्यम से कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) को रिपरफ्यूजन चोट से बचा सकती हैं। सह-संस्कृतियां सेल-सेल इंटरैक्शन की भूमिका की जांच करने में मदद कर सकती हैं। एक मिश्रित सह-संस्कृति सबसे सरल दृष्टिकोण है, लेकिन एकल सेल प्रकारों के अलग-अलग उपचार और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के रूप में सीमित है। यह जांचने के लिए कि क्या ईसी सीएम सेल क्षति को खुराक-निर्भर रूप से क्षीण कर सकते हैं और क्या इस सुरक्षा को दो सेल लाइनों के बीच संपर्क दूरी को अलग करके और अनुकूलित किया जा सकता है, हमने माउस प्राथमिक कोरोनरी धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं और वयस्क माउस कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग तीन प्रकार के सेल संस्कृति आवेषणों का परीक्षण करने के लिए किया जो 0.5 पर उनके अंतर-सेल परत की दूरी में भिन्न था, 1.0, और 2.0 मिमी, क्रमशः। सीएम-केवल में, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) रिलीज द्वारा मूल्यांकन किए गए सेलुलर चोट में हाइपोक्सिया के दौरान काफी वृद्धि हुई और जब दूरी 0.5 और 1.0 मिमी की तुलना में 2.0 मिमी थी, तो पुन: ऑक्सीकरण पर आगे बढ़ गई। जब ईसी और सीएम लगभग सीधे संपर्क (0.5 मिमी) में थे, तो हाइपोक्सिया के बाद सीएम की रीऑक्सीजनेशन चोट का केवल एक हल्का क्षीणन था। इस क्षीणन में काफी वृद्धि हुई थी जब स्थानिक दूरी 1.0 मिमी थी 2.0 मिमी की दूरी के साथ, ईसी ने हाइपोक्सिया और हाइपोक्सिया / रीऑक्सीजनेशन दोनों के दौरान सीएम की चोट को क्षीण कर दिया, यह दर्शाता है कि ईसी के लिए सीएम के साथ क्रॉसस्टॉक करने के लिए पर्याप्त संस्कृति दूरी आवश्यक है, ताकि स्रावित सिग्नल अणु सुरक्षात्मक मार्गों को प्रसारित और पूरी तरह से उत्तेजित कर सकें। हमारे निष्कर्षों से पता चलता है, पहली बार, कि ईसी / सीएम सह-संस्कृति स्थानिक वातावरण को अनुकूलित करना सिम्युलेटेड इस्केमिया / reperfusion चोट के खिलाफ सीएम-सुरक्षा में ईसी की भूमिका का परीक्षण करने के लिए एक अनुकूल इन विट्रो मॉडल प्रदान करने के लिए आवश्यक है। इस रिपोर्ट का लक्ष्य जांचकर्ताओं को अपने लाभ के लिए इस महत्वपूर्ण मॉडल का उपयोग करने के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण प्रदान करना है।

Introduction

इस्केमिक हृदय रोग दुनिया भर में मृत्यु और विकलांगता का प्रमुख कारण है 1,2। हालांकि, reperfusion की उपचार प्रक्रिया ही कार्डियोमायोसाइट्स मौत का कारण बन सकती है, जिसे मायोकार्डियल इस्केमिया / reperfusion (IR) चोट के रूप में जाना जाता है, जिसके लिए अभी भी कोई प्रभावी उपायनहीं है। एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) को पैराक्राइन संकेतों के स्राव के साथ-साथ सेल-टू-सेल इंटरैक्शन के माध्यम से कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) की रक्षा करने का सुझाव दिया गयाहै।

सेल फ़ंक्शन और भेदभाव पर ऑटोक्राइन और / या पैराक्राइन सेल-सेल इंटरैक्शन की भूमिका की जांच करने के लिए सेल सह-संस्कृति मॉडल का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। सह-संस्कृति मॉडल में, मिश्रित सह-संस्कृति सबसे सरल है, जहां दो अलग-अलग प्रकार की कोशिकाएं वांछित सेल अनुपात5 पर एक एकल संस्कृति डिब्बे के भीतर सीधे संपर्क में होती हैं। हालांकि, सेल प्रकारों और एक एकल सेल प्रकार के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के बीच अलग-अलग उपचार मिश्रित आबादी को देखते हुए आसानी से संभव नहीं हैं।

पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि हाइपोक्सिक और इस्केमिक अपमान कोशिका झिल्ली की अखंडता को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचाते हैं जैसा कि लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) की रिहाई से मापा जाता है। यह चोट reoxygenation पर खराब हो जाती है, reperfusion चोट 6,7,8 की नकल। वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य परिकल्पनाओं का परीक्षण करना था कि ईसी की उपस्थिति हाइपोक्सिया और रीऑक्सीजनेशन (एचआर) के कारण सीएम के सेल झिल्ली रिसाव को खुराक-निर्भर रूप से क्षीण कर सकती है और यह कि ईसी के सुरक्षात्मक प्रभाव को दो सेल लाइनों के बीच संपर्क दूरी को बदलकर अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रकार, हमने तीन प्रकार के सेल कल्चर आवेषण और माउस प्राथमिक कोरोनरी धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं और वयस्क माउस कार्डियोमायोसाइट्स को नियोजित किया। आवेषण, कॉर्निंग, मर्क मिलिपोर, और ग्रीनर बायो-वन द्वारा ब्रांडेड, ने हमें क्रमशः 0.5, 1.0 और 2.0 मिमी की अंतर-सेल लाइन दूरी के साथ तीन अलग-अलग सेल संस्कृति क्रॉसस्टॉक स्थितियों को बनाने की अनुमति दी। प्रत्येक मामले में प्रति सम्मिलित 100,000 ईसी मढ़वाया गया था।

इसके अलावा, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या सह-संस्कृति में ईसी का घनत्व इस मॉडल में एचआर चोट क्षीणन में योगदान देता है, हमने सीएम द्वारा ईसी एकाग्रता और एलडीएच रिलीज के बीच खुराक-प्रतिक्रिया संबंध का अध्ययन किया। ईसी को क्रमशः 2.0 मिमी डालने में 25,000, 50,000 और 100,000 प्रति सम्मिलित पर चढ़ाया गया था।

यह रिपोर्ट जांचकर्ताओं को अपने लाभ के लिए इस महत्वपूर्ण मॉडल का उपयोग करने के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण प्रदान करती है।

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Protocol

1. प्रयोगात्मक तैयारी /

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सीएम और ईसी बनाए रखें।
    1. जब वे विक्रेताओं से आते हैं तो दोनों सेल लाइनों को पिघलाएं। ताजा मीडिया के साथ धोया जा रहा है के बाद T25 फ्लास्क में प्लेट. प्रत्येक सेल संस्कृति मीडिया को उन्हीं विक्रेताओं से खरीदने की सिफारिश की जाती है जिनसे कोशिकाओं को खरीदा गया था। अगले दिन, मीडिया के साथ कोशिकाओं को ताज़ा करें और confluent होने पर उपयोग करें।
    2. सेल कल्चर इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस पर 21% O2, 5% CO2, 74% N2 के साथ बनाए रखें और इसे humidified रखें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली माउस प्राथमिक कोरोनरी धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं को C57BL / 6 चूहों की कोरोनरी धमनियों से अलग किया जाता है, और वयस्क माउस कार्डियोमायोसाइट्स वयस्क C57BL / 6J माउस दिल से अलग होते हैं और व्यावसायिक रूप से प्राप्त होते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. 24-अच्छी तरह से प्लेटों (अवर परत) के तल पर बाँझ परिस्थितियों के तहत प्लेट सीएम। 24 घंटे बाद, सह-संस्कृति के सम्मिलित (या बेहतर भाग) में प्लेट ईसी अच्छी तरह से। ईसी चढ़ाना के बाद 24 घंटे, ईसी को सीएम प्लेट बेस पर डालें, सह-संस्कृति अवधि शुरू करें। उपयोग से पहले कोशिकाओं को कम से कम 12-24 घंटे के लिए सह-संस्कृति की अनुमति दें। इन चरणों को नीचे विस्तार से वर्णित किया गया है।
    1. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सीएम सेल लाइन confluency का अनुमान लगाएं। जब कोशिकाएं संस्कृति फ्लास्क में 90% -100% confluent प्रतीत होती हैं, तो प्रयोगात्मक चढ़ाना के साथ आगे बढ़ें।
    2. confluent सेल संस्कृतियों युक्त फ्लास्क से मीडिया को हटा दें और T25 फ्लास्क के लिए ट्रिप्सिन / एथिलीनेडियामिनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 3-5 मिलीलीटर के साथ ट्रिप्सिनाइज़ करें। फ्लास्क को धीरे से उत्तेजित करें, 2-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एंजाइमेटिक प्रगति का आकलन करें। एक बार जब कोशिकाएं गोल होना शुरू हो जाती हैं, तो सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
    3. टुकड़ी के बाद, T25 फ्लास्क के लिए मीडिया के 10 मिलीलीटर युक्त 50 मिलीलीटर ट्यूब में ट्रिप्सिन / सेल समाधान जोड़कर ट्रिप्सिन समाधान को निष्क्रिय करें। एक नरम सेल गोली प्राप्त करने के लिए 2 मिनट के लिए 120 x g पर सेल निलंबन centrifuge. supernatant निकालें और मीडिया के 5 mL में गोली resuspend.
    4. सेल की गिनती करने और सेल व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए, पुन: निलंबित कोशिकाओं के 10 μL और ट्रिपैन ब्लू डाई के 10 μL का एक एलीकोट मिलाएं। एक सेल काउंटर का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं की गणना करें। वांछित सीडिंग घनत्व प्राप्त करने के लिए ताजा नियमित मीडिया के साथ कोशिकाओं को पतला करें। वॉल्यूम की गणना वांछित बीज घनत्व और स्टॉक समाधानों की सेल एकाग्रता के आधार पर की जाती है। सभी चढ़ाना बाँझ परिस्थितियों के तहत किया जाना चाहिए।
    5. प्लेट सीएम 300,000 प्रति अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के नीचे के सीडिंग घनत्व पर पूर्व-लेपित एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के साथ लेपित। 21% O 2 और 5% CO 2 रात भर के साथ 37 °C पर कोशिकाओं को बनाए रखें।
    6. 24 घंटे के बाद, प्लेट ईसी प्रति सम्मिलित 100,000 के इष्टतम चढ़ाना घनत्व पर आवेषण में (संस्कृति क्षेत्र 33.6 मिमी2 है), (चित्रा 1)। ईसी चढ़ाना के 24 घंटे के बाद, सीएम कुओं के अंदर ईसी आवेषण रखें, सह-संस्कृति की शुरुआत करें। प्रयोगों को करने से पहले कोशिकाओं को 12-24 घंटे के लिए सह-संस्कृति की अनुमति दें।
    7. सुनिश्चित करें कि, जब तक प्रयोग किए जाते हैं, तब तक सीएम और ईसी दोनों 80% -90% confluency तक पहुंच गए हैं।

2. हाइपोक्सिया / reoxygenation इन विट्रो में ischemia / reperfusion चोट अनुकरण करने के लिए

नोट:: निम्न चरणों को वर्णित के रूप में निष्पादित करने की आवश्यकता है, के बीच में विराम न दें।

  1. एक 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में मीडिया के ~ 25 mL डालने के द्वारा hypoxic मीडिया तैयार करें। एक सिलिकॉन झिल्ली के साथ शीर्ष को एयर-सील करें और एक छेद को पंच करने के लिए एक निष्फल पिपेट का उपयोग करें। एक और छेद बनाएँ, इस बार पिपेट को मीडिया में लगभग 2/3 जलमग्न छोड़ दें।
  2. हाइपोक्सिक गैस (0.0125% O2, 5% CO2, 94.99% N2) के साथ मीडिया को 30 L / मिनट की प्रवाह दर पर 5 मिनट के लिए फ्लश करें। यह हाइपोक्सिया शुरू होने पर मीडिया में भंग ओ2 को कम करता है (चरण 2.5)।
  3. संलग्न कोशिकाओं वाले 24-अच्छी तरह से प्लेटों या संस्कृति आवेषण के मीडिया को छोड़ दें और 10% फॉस्फेट बफ़र्ड सेलाइन (पीबीएस) के 100 μL / अच्छी तरह से धोएं। बाद में, प्लेटों या आवेषण के प्रत्येक कुएं में ताजा तैयार हाइपोक्सिक मीडिया के 500 μL जोड़ें।
    नोट:: मीडिया में हाइपोक्सिया इस चरण के दौरान यथासंभव संक्षेप में बाधित होता है इससे पहले कि कक्षों और मीडिया के लिए सही हाइपोक्सिया चरण 2.5 में प्रारंभ होता है।
    1. Normoxic नियंत्रण समूह में, ग्लूकोज और सीरम युक्त ताजा सामान्य मीडिया के साथ मूल मीडिया की जगह।
  4. कक्ष के भीतर बाँझ पानी से भरा एक पेट्री-डिश रखकर हाइपोक्सिया कक्ष को ह्यूमिडिफाई करें। इसके बाद, हाइपोक्सिक समूहों वाली प्लेटों को कक्ष में रखें।
  5. हाइपोक्सिक गैस (0.0125% O 2, 5% CO 2, 94.99% N2) के साथ हाइपोक्सिया चैंबर को 30 L / min के प्रवाह पर 5 मिनट के लिए फ्लश करें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कक्ष रखें।
  6. हाइपोक्सिया के बाद, सामान्य परिस्थितियों में सीएम और ईसी की खेती करें। ऐसा करने के लिए, प्लेटों / आवेषण के पुराने मीडिया को छोड़ दें, इसे सामान्य मीडिया (ग्लूकोज और सीरम युक्त; प्रत्येक अच्छी तरह से / सम्मिलित करने के 500 μL) के साथ बदलें और इसे सामान्य संस्कृति परिस्थितियों (21% O2, 5% CO2, 74% N2, 37 °C) के तहत इनक्यूबेटर में स्टोर करें।
  7. मीडिया प्रतिस्थापन के किसी भी प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए, हाइपोक्सिक मीडिया के रूप में एक ही समय में normoxic कोशिकाओं के मीडिया को बदलें।
    नोट:: चित्र 2 इस प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध अवलोकन प्रदान करता है।

3. समापन बिंदु मूल्यांकन

  1. सेल संस्कृति मीडिया को 24-अच्छी तरह से प्लेट से 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें। 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से मीडिया के 200 μL का उपयोग करें और तदनुसार, 96-अच्छी तरह से प्लेट के चार कुओं में समान रूप से वितरित करें। Normoxia बनाम हाइपोक्सिया बनाम मानव संसाधन के लिए प्रत्येक एक प्लेट का उपयोग करें।
  2. सेलुलर चोट की डिग्री निर्धारित करें, उदाहरण के लिए, निर्माता के निर्देशों के बाद एक cytotoxicity परख किट का उपयोग कर LDH के लिए absorbance को मापने के द्वारा। परख प्रोटोकॉल में निर्देश के रूप में एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में परख प्रदर्शन.

4. सांख्यिकी

  1. पैरामीट्रिक डेटा को माध्य/मानक विचलन और गैर-पैरामीट्रिक डेटा के रूप में माध्यिका/अंतर-चतुर्थक श्रेणी के साथ बॉक्स प्लॉट के रूप में प्रदर्शित करें. एक प्रकार -1 त्रुटि के लिए मौका कम करने के लिए स्वीकार्य पोस्ट-हॉक परीक्षणों के साथ पर्याप्त पैरामीट्रिक बनाम गैर-पैरामीट्रिक एकाधिक तुलना परीक्षण किए जाने चाहिए। महत्व आमतौर पर 0.05 (दो पूंछ) के अल्फा पर सेट किया जाता है।
  2. वर्तमान अध्ययन में किए गए सभी प्रयोगों के लिए, एक प्रयोग के भीतर कम से कम तीन अच्छी तरह से प्रतिकृति प्रदर्शन करें। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक प्रयोग के तीन से छह पुनरावृत्ति थे।

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Representative Results

इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सभी तीन प्रकार के आवेषण (ए, बी, सी) में 0.4 μm का समान छिद्र आकार होता है। उनमें से एकमात्र अंतर सम्मिलित-से-आधार ऊंचाई है, जो दो सह-सुसंस्कृत सेल परतों के बीच की दूरी को क्रमशः 0.5, 1.0 और 2.0 मिमी होने की अनुमति देता है, (चित्रा 3) और वे विभिन्न विक्रेताओं से हैं (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।

आईआर चोट का अनुकरण करने के लिए एचआर से गुजरने वाली दो सेल लाइनों की अलग-अलग परतों के साथ एक इन विट्रो सह-संस्कृति मॉडल स्थापित करने के लिए, हमने ईसी के साथ या बिना सह-सुसंस्कृत सीएम की कोशिका झिल्ली अखंडता की जांच की। ईसी के लिए एक अलग सम्मिलित करें जो सीएम परत के ऊपर विभिन्न दूरी पर रखा जा सकता है, का उपयोग करके हमें सीएम में झिल्ली क्षति की गंभीरता पर सेल परत की दूरी के विभेदक प्रभावों का आकलन करने की भी अनुमति दी गई। प्रयोगों के एक अलग सेट में, हमने ईसी के घनत्व को अलग-अलग किया और इस प्रकार ईसी से सीएम का अनुपात। इसके अलावा, सिम्युलेटेड आईआर चोट से सिम्युलेटेड इस्केमिया को अलग करने के लिए, प्रयोगों को 1) नॉर्मोक्सिया, 2) हाइपोक्सिया केवल, और 3) एचआर की शर्तों के तहत किया गया था। इस मॉडल के लिए, हमने 24 एच हाइपोक्सिया का उपयोग किया, इसके बाद 2 एच रीऑक्सीजनेशन हुआ।

चर दूरी
सेल परतों के बीच 0.5 मिमी की दूरी (सम्मिलित करें A)
जब सीएम अकेले सुसंस्कृत थे, तो हाइपोक्सिया ने नॉर्मोक्सिया की तुलना में एलडीएच रिलीज में काफी वृद्धि की, जो हमारे पिछले अध्ययनों (चित्रा 4 ए) 6 के अनुरूप थी। हालांकि, एलडीएच को हाइपोक्सिया-केवल समूह की तुलना में 2h reoxygenation पर केवल हल्के से आगे बढ़ाया गया था। जब ईसी और सीएम को 0.5 मिमी की दूरी पर एक साथ सह-सुसंस्कृत किया गया था, तो हाइपोक्सिया द्वारा एलडीएच रिलीज में वृद्धि केवल क्षीण नहीं थी, यह दर्शाती है कि ईसी ने कोई सुरक्षात्मक प्रभाव नहीं दिखाया (हाइपोक्सिया-केवल स्थितियों के तहत अकेले सीएम समूह की तुलना में)। हालांकि, ईसी ने एचआर के दौरान सीएम पर एक हल्का लेकिन महत्वपूर्ण सुरक्षा लागू की।

सेल परतों के बीच 1.0 मिमी की दूरी (सम्मिलित करें B)
एक ही प्रयोग ऊपर के रूप में किया गया था, सिवाय इसके कि दो सेल परतों के बीच की दूरी को 1.0 मिमी (चित्रा 4 बी) तक बढ़ा दिया गया था। हमने पाया कि एलडीएच रिलीज को सीएम में भी काफी वृद्धि हुई थी- केवल हाइपोक्सिया-केवल द्वारा। हालांकि, 0.5 मिमी डालने के विपरीत, सीएम-केवल में एलडीएच वृद्धि को हाइपोक्सिया-केवल पर एचआर द्वारा potentiated किया गया था। इसके अलावा, इस potentiation अधिक बाधित किया गया था और लगभग सीएम-केवल समूह की तुलना में reoxygenation के दौरान ECs की उपस्थिति से समाप्त कर दिया गया था।

सेल परतों के बीच 2.0 मिमी की दूरी (सम्मिलित करें C)
जब दो सेल लाइनों (चित्रा 4 सी) के बीच 2.0 मिमी की दूरी बनाने वाले सह-संस्कृति आवेषण का उपयोग किया गया था, तो हमें सीएम द्वारा एलडीएच रिलीज की एक महत्वपूर्ण वृद्धि भी मिली- केवल हाइपोक्सिया के दौरान, 0.5 मिमी- और 1.0 मिमी-प्रयोगों के समान डिग्री तक। दिलचस्प बात यह है कि, हालांकि, reoxygenation द्वारा एलडीएच रिलीज में अतिरिक्त वृद्धि 1.0 मिमी प्रयोगों की तुलना में और भी अधिक स्पष्ट थी। इन दोनों वृद्धिओं को क्षीण कर दिया गया था, हालांकि ईसी की उपस्थिति से समाप्त नहीं किया गया था, यह दर्शाता है कि 0.5 या 1.0 मिमी आवेषण का उपयोग करने के लिए अलग- अलग, ईसी ने हाइपोक्सिया-केवल और एचआर दोनों स्थितियों के तहत सीएम को चोट से काफी बचाया।

चर ईसी तीव्रता
प्रयोगों के एक अलग सेट में, 2.0 मिमी आवेषण में मढ़वाया ईसी की एकाग्रता को क्रमशः 25,000, 50,000 और 100,000 कोशिकाओं को प्रति सम्मिलित करने के लिए टिटरेट किया गया था। एलडीएच रिलीज को 24 घंटे हाइपोक्सिया के बाद मापा गया था, जिसके बाद 2 एच रीऑक्सीजनेशन किया गया था। हमारे परिणामों से पता चला है कि सह-संस्कृति में ईसी तीव्रता में वृद्धि ने एचआर (चित्रा 5) के कारण एलडीएच रिलीज की खुराक-निर्भर क्षीणन का नेतृत्व किया; Normoxic परिस्थितियों के तहत ऐसा कोई प्रभाव नहीं देखा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: कुएं के अंदर डालने की योजनाबद्ध। ECs के साथ आवेषण (प्रति सम्मिलित 100,000 कोशिकाओं तक) को उनके तल पर सीएम (300,000 प्रति अच्छी तरह से) के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोगात्मक डिजाइन. कोशिकाओं को सामान्य ऑक्सीजन की स्थिति (21% ओ 2) के तहत सुसंस्कृत किया जाता है, और फिर दो समूहों में विभाजित किया जाता है: एक नॉर्मोक्सिक नियंत्रण समूह को एक और 24 घंटे के लिए सामान्य परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जाना जारी रहेगा, जबकि हाइपोक्सिया समूह को केवल 0.01% ओ 2 और कोई ग्लूकोज के साथ 24 घंटे के लिए हाइपोक्सिया कक्ष में सुसंस्कृत किया जाएगा। इन 24 ज हस्तक्षेपों के बाद, कोशिकाओं के दोनों समूहों को मीडिया के साथ ताज़ा किया जाता है और एक और 2 घंटे के लिए21 % ओ 2 वातावरण में लगातार सुसंस्कृत किया जाता है, पुन: ऑक्सीकरण चरण, अंततः समापन बिंदु परख (एस) का संचालन करने से पहले, उदाहरण के लिए, एलडीएच विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: तीन अलग-अलग आवेषणों की छवियां और योजनाबद्ध। सम्मिलित करने में एंडोथेलियल कोशिकाओं और कुएं के नीचे कार्डियोमायोसाइट्स के बीच की दूरी को विभिन्न आवेषणों का उपयोग करके भिन्न किया जा सकता है। यहां उपयोग किए जाने वाले सभी तीन प्रकार के आवेषणों में 0.4 μm का एक ही छिद्र आकार होता है। उनमें से एकमात्र अंतर सम्मिलित-से-आधार ऊंचाई है, जो दो सह-सुसंस्कृत सेल परतों के बीच की दूरी को क्रमशः 0.5 (ए), 1.0 (बी), और 2.0 मिमी (सी) होने की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच; अवशोषण इकाइयों में [एयू]) की रिहाई का आकलन करने में तीन प्रकार की संस्कृति आवेषण की तुलना नॉर्मोक्सिक (बाएं), हाइपोक्सिया-केवल (केंद्र), और हाइपोक्सिया / रीऑक्सीजनेशन स्थितियों (दाएं) के लिए अकेले कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम; सफेद), एंडोथेलियल कोशिकाओं अकेले (ईसी; ब्लैक), और ईसी (चेक पैटर्न) के साथ सीएम की सह-संस्कृतियों को शामिल किया जाता है। (ए) 0.5 मिमी दूरी, (बी) 1.0 मिमी दूरी, (सी) दो अलग-अलग सेल परतों के बीच 2.0 मिमी की दूरी। ईसी को प्रति सम्मिलित 100,000 कोशिकाओं के घनत्व पर मढ़वाया गया था, प्रति अच्छी तरह से 300,000 कोशिकाओं के घनत्व पर सीएम। डेटा मानक विचलन ± माध्य है, n = 4 प्रति समूह। सांख्यिकी: एनोवा छात्र-न्यूमैन-Keuls पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद के बाद। पी < 0.05 (दो-पूंछ) प्रत्येक तुलना जोड़ी के बीच क्षैतिज सलाखों द्वारा इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: सह-सुसंस्कृत एंडोथेलियल कोशिकाओं की एकाग्रता (ईसी; 25: 25,000 कोशिकाएं प्रति सम्मिलित; 50: 50,000 कोशिकाएं प्रति सम्मिलित; 100: 100,000 कोशिकाएं प्रति सम्मिलित) खुराक-निर्भर रूप से प्रभावित कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) के खिलाफ हाइपोक्सिया / रीऑक्सीजनेशन चोट (दाएं) के खिलाफ नॉर्मोक्सिक स्थितियों (बाएं) की तुलना में, जैसा कि लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) की रिहाई से स्पष्ट है; अवशोषण इकाइयों में [au]। ईसी का नॉर्मोक्सिक परिस्थितियों में एलडीएच रिलीज पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। डेटा मानक विचलन ± माध्य है, n = 4 प्रति समूह। सांख्यिकी: एनोवा छात्र-न्यूमैन-Keuls पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद के बाद। पी < 0.05 (दो-पूंछ) प्रत्येक तुलना जोड़ी के बीच क्षैतिज सलाखों द्वारा इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
कार्डियोप्रोटेक्शन के सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए सेल सह-संस्कृति मॉडल का उपयोग किया गया है। उनके बीच एक सार्थक दूरी के साथ दो अलग-अलग परतों को कैसे बनाया जाए, इस प्रकार, एक उपयुक्त सह-संस्कृति मॉडल के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। सिम्युलेटेड आईआर, यानी, एचआर, चोट का अध्ययन करने में एक चुनौती यह है कि न केवल इस्केमिया (हाइपोक्सिया) ही बल्कि reperfusion (reoxygenation) सेलुलर शिथिलता को भी बढ़ाता है। इसलिए, एक यथार्थवादी मॉडल को इन विशेषताओं को प्रतिबिंबित करने की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए, अकेले हाइपोक्सिया के विपरीत हाइपोक्सिया के बाद रीऑक्सीजनेशन द्वारा पर्याप्त रूप से बढ़ी हुई चोट का प्रदर्शन करना, लेकिन अभी भी सेल-सुरक्षात्मक दवाओं या रणनीतियों के साथ चोट के क्षीणन की अनुमति देता है, जैसे कि हमारे मामले में, ईसी की उपस्थिति। दिलचस्प बात यह है कि दो सेल परतों के बीच की दूरी एक उपयुक्त सह-संस्कृति मॉडल विकसित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि ईसी और सीएम के बीच 1.0 मिमी और 2.0 मिमी की दूरी ने अपेक्षित एचआर चोट प्रतिक्रिया की अनुमति दी, लेकिन, अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि केवल 2.0 मिमी ने हाइपोक्सिक और एचआर दोनों स्थितियों के तहत ईसी की उपस्थिति से सेलुलर चोट सुरक्षा के लिए लगातार अनुकूल परिणाम प्राप्त किया।

विधि के संशोधन और समस्या निवारण
सह-संस्कृति मॉडल में सेल-सेल इंटरैक्शन कई चरों से प्रभावित होते हैं जैसे कि अलग-अलग सह-सुसंस्कृत आबादी की संख्या, सेल प्रकारों की समानता की डिग्री, उनके बीच भौतिक अलगाव की डिग्री, जनसंख्या स्थानीय वातावरण के बीच का अंतर, संस्कृतियों की मात्रा और सह-संस्कृति के समय पर विचार 9,10,11,12 . इन कारकों के बीच व्यापार-बंद मौजूद हैं। ये इंटरैक्शन पर्यावरण से दृढ़ता से प्रभावित होते हैं, जो बदले में प्रोटोकॉल और सेट-अप द्वारा निर्धारित किया जाता है। प्रयोगात्मक मॉडल विकसित करना महत्वपूर्ण है जो प्रतिकृति, औसत दर्जे का और तुलनीय है। हमारा दृष्टिकोण चर की संख्या को नियंत्रित करने और सीमित करने के लिए था जो कोशिकाओं की एक सटीक संख्या चढ़ाना के माध्यम से अलग-अलग समय पर किए गए विभिन्न प्रयोगों से प्राप्त डेटा की स्थिरता को बाधित कर सकता है, दो सह-सुसंस्कृत सेल लाइनों के समान अनुपात का उपयोग करके, सेल संस्कृति मीडिया और परख अभिकर्मकों के समान वॉल्यूम, आदि, तीन अलग-अलग सेल संस्कृति आवेषण के अपवाद के साथ।

विधि की सीमाएँ
हमारा मॉडल ईसी और सीएम के साथ अच्छी तरह से काम करता है, संभवतः कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम में ईसी की सर्वव्यापी उपस्थिति के लिए बकाया है। संभावित ब्याज की अन्य प्रकार की सेल लाइनें सीएम, न्यूरॉन्स, या विट्रो में अध्ययन किए जाने वाले ब्याज की अन्य कोशिकाओं के साथ कितनी अच्छी तरह से बातचीत करती हैं, इसका मूल्यांकन किया जाना बाकी है क्योंकि विभिन्न सेल लाइनें सह-संस्कृति वातावरण में अलग-अलग बातचीत कर सकती हैं। सह-सुसंस्कृत सेल आबादी के बीच एक अंतर उनके पारिस्थितिक संबंध हो सकता है, उदाहरण के लिए, यदि वे प्राकृतिक प्रतियोगी या सहकर्मी हैं। इसके अलावा, अन्य सभी इन विट्रो सेल मॉडल के रूप में, प्रयोग में उत्पन्न सेलुलर क्षति विवो में चोट की वास्तविक pathophysiological स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकती है। इसके अलावा, हम स्वीकार करते हैं कि 0.5, 1.0 और 2.0 मिमी के ईसी और सीएम के बीच परीक्षण की गई दूरी विवो में उनकी रिक्ति को पुन: पेश नहीं करती है; दिए गए इन विट्रो मॉडल के लिए; हालांकि, हमारे परिणाम वैज्ञानिकों द्वारा अध्ययन किए जाने वाले दो सेल परतों के बीच इष्टतम दूरी के निहितार्थों का वर्णन करते हैं जो इस तकनीक का लाभ उठाना चाहते हैं।

मौजूदा/वैकल्पिक विधियों के संबंध में विधि का महत्व
मौजूदा / वैकल्पिक सह-संस्कृति विधियों में सेल लाइनों का प्रत्यक्ष मिश्रण या अलगाव की डिग्री के साथ अलग-अलग वातावरण बनाना शामिल है जैसे कि ट्रांसवेल प्लेटोंका उपयोग करना 13, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म14 या तीन आयामी मचान15, जिनमें से ट्रांसवेल प्लेटें कम से कम महंगी और सबसे आसान उपलब्ध हैं। प्राकृतिक सीमाओं के बावजूद, सह-संस्कृतियां दवा अनुसंधान के लिए अत्यधिक प्रासंगिक हैं क्योंकि वे विवो-जैसे ऊतक मॉडल में अधिक प्रतिनिधि प्रदान करते हैं और उच्च-थ्रूपुट परीक्षण और सेल-सेल इंटरैक्शन पर दवा के प्रभावों की गहराई से निगरानी करने की अनुमति देतेहैं। हमारे मॉडल को दो अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के पूर्ण और अनियंत्रित मिश्रण के बजाय ईसी और सीएम के बीच अच्छी तरह से परिभाषित स्थानिक दूरी का उपयोग करके सटीक रूप से कैलिब्रेट किया गया था। इसके अलावा, यह मॉडल अलग-अलग उपचार की अनुमति देता है और व्यक्तिगत प्रकार की कोशिकाओं का विश्लेषण करता है, जो एक मिश्रित सह-संस्कृति में प्राप्त करना असंभव है, न कि विवो में उल्लेख करने के लिए। क्योंकि आईआर चोट में अलग-अलग एचआर प्रक्रियाएं शामिल हैं, यह मॉडल इस्केमिया / हाइपोक्सिया बनाम reperfusion / reoxygenation क्षति के सेलुलर तंत्र का अलग से अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। हमारे डेटा से पता चलता है कि यह नकली आईआर चोट के अध्ययन में उपयोग किए जाने के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान और कुशल सेल सह-संस्कृति मॉडल हो सकता है। हमारी टिप्पणियों से स्पष्ट रूप से संकेत मिलता है कि हमारे मामले में 2.0 मिमी में एक इष्टतम स्थानिक दूरी, ईसी के लिए इस विशिष्ट सह-संस्कृति मॉडल में सीएम के साथ क्रॉसस्टॉक करने के लिए आवश्यक है, ताकि ईसी द्वारा संभावित रूप से स्रावित सिग्नलिंग अणु हाइपोक्सिया-केवल और / या एचआर द्वारा चोट के खिलाफ सीएम की अवैध सुरक्षा के लिए प्रभावी ढंग से प्रसारित हो सकें।

विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों में विधियों का महत्व और संभावित अनुप्रयोग
हमारा मॉडल एचआर चोट के खिलाफ सुरक्षात्मक उपायों की जांच में सुधार करने के लिए माउस सीएम के साथ माउस कोरोनरी धमनी ईसी के संयोजन के महत्व को इंगित करता है; कि सह-संस्कृतियों की स्थानिक दूरी को बदलना एचआर के कारण सीएम चोट पर ईसी की सुरक्षात्मक कार्रवाई को प्रभावित करने वाली स्थानिक स्थितियों को बेहतर ढंग से समझने का एक प्रभावी तरीका दर्शाता है; और यह कि ईसी का घनत्व या ईसी-टू-सीएम अनुपात एचआर चोट के खिलाफ सुरक्षा की सीमा तक सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को भाग में, अमेरिकी दिग्गजों के मामलों के जैव चिकित्सा प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास सेवा (I01 BX003482) और M.L.R. को संस्थागत धन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) Celprogen Inc 11041-14 Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II Invitrogen A27977 Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet Nuaire NU425400 Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium Cell Biologics Inc 6916 Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator Nuaire Nu-5500 To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank A-L Compressed Gases UN1013 Gas needed for cell culture incubator 
Cell Culture Inserts A (0.5 mm) Corning Inc 353095 Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm) Millicell Millipore PIHP01250 Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm) Greiner Bio-One 662640 Used for EC-CM co-culture
Centrifuge Anstel Enterprises Inc 4235 For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25 Celprogen Inc E11041-14 Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete Celprogen Inc M11041-14S CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free Celprogen Inc M11041-14PN CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well Celprogen Inc E11041-14-96well Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium Celprogen Inc M11041-14GFPN CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283 Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit Thermo Scientific  C20301 LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25 Fisher Scientific  FB012935 Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete Cell Biologics Inc M1168 ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free Cell Biologics Inc M1168PF ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well Fisher Scientific (Costar) 3370 Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution Cell Biologics Inc 6950 Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium Cell Biologics Inc GPF1168 ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific MT35011CV FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber StemCell Technologies 27310 To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter StemCell Technologies 27311 To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) A-L Compressed Gases UN1956 Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope  Nikon TMS To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) Cell Biologics Inc C57-6093 Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes Fisher Scientific 12565269 For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes Fisher Scientific 12565271 For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader BioTek Instrument 11120533 Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid) Fisher Scientific 12565226 Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs Celprogen Inc T1509-014 1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs Cell Biologics Inc 6914/0619 0.25%, cell cuture-tested

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References

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जीव विज्ञान अंक 176
कार्डियक Ischemia / Reperfusion <em>इन विट्रो</em> की नकल करने के लिए एक सेल सह-संस्कृति मॉडल का विकास
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Li, Z., Hampton, M. J. W., Barajas,… More

Li, Z., Hampton, M. J. W., Barajas, M. B., Riess, M. L. Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (176), e62913, doi:10.3791/62913 (2021).

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