Summary
空间距离是评估分离内皮和心肌细胞层共培养模型中缺氧/再氧合损伤的关键参数,首次表明优化共培养空间环境对于为测试内皮细胞在心肌细胞保护中的作用提供有利的 体外 模型是必要的。
Abstract
缺血性心脏病是全世界死亡和残疾的主要原因。再灌注可导致缺血以外的其他损伤。内皮细胞(EC)可以通过细胞间相互作用保护心肌细胞(CM)免受再灌注损伤。共培养可以帮助研究细胞 - 细胞相互作用的作用。混合共培养是最简单的方法,但由于分离处理和单细胞类型的下游分析不可行,因此受到限制。为了研究ECs是否可以以剂量依赖性方式衰减CM细胞损伤,以及是否可以通过改变两个细胞系之间的接触距离来进一步优化这种保护,我们使用小鼠原发冠状动脉内皮细胞和成年小鼠心肌细胞来测试三种类型的细胞培养插入物,其细胞间层距离在0.5, 分别为 1.0 毫米和 2.0 毫米。在仅CM中,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放评估的细胞损伤在缺氧期间和再氧合后显着增加,当距离为2.0 mm时,与0.5和1.0 mm相比。当EC和CM几乎直接接触(0.5 mm)时,缺氧后CM的再氧合损伤只有轻度衰减。当空间距离为1.0 mm时,这种衰减显着增加,当距离为2.0 mm时,EC在缺氧和缺氧/再氧合期间都减轻了CM损伤,表明ECs需要足够的培养距离才能与CM串扰,以便分泌的信号分子可以循环并充分刺激保护途径。我们的研究结果首次表明,优化EC/CM共培养空间环境对于测试EC在模拟缺血/再灌注损伤CM保护中的作用提供了有利的 体外 模型。本报告的目标是为调查人员提供一种循序渐进的方法,以利用这一重要模型来发挥自己的优势。
Introduction
缺血性心脏病是全世界死亡和残疾的主要原因1,2。然而,再灌注的治疗过程本身可引起心肌细胞死亡,称为心肌缺血/再灌注(IR)损伤,对此仍然没有有效的补救措施3。内皮细胞(EC)已被建议通过分泌旁分泌以及细胞间相互作用来保护心肌细胞(CMs) 4。
细胞共培养模型已被广泛用于研究自分泌和/或旁分泌细胞 - 细胞相互作用对细胞功能和分化的作用。在共培养模型中,混合共培养是最简单的,其中两种不同类型的细胞以所需的细胞比5在单个培养室内直接接触。然而,鉴于混合群体,细胞类型之间的单独处理和单细胞类型的下游分析并不容易实现。
先前的研究表明,缺氧和缺血性损伤对细胞膜的完整性造成显着损害,通过乳酸脱氢酶(LDH)的释放来测量。这种损伤在复氧时加重,类似于再灌注损伤6,7,8。当前方案的目标是测试假设,即EC的存在可以剂量依赖性地衰减由缺氧和再氧合(HR)引起的CM的细胞膜泄漏,并且可以通过改变两个细胞系之间的接触距离来优化EC的保护作用。因此,我们采用了三种类型的细胞培养插入物和小鼠原发性冠状动脉内皮细胞和成年小鼠心肌细胞。这些由康宁、默克密理博和格瑞纳Bio-One品牌设计的插入物使我们能够创建三种不同的细胞培养串扰条件,细胞间距离分别为0.5、1.0和2.0 mm。在每种情况下,每个刀片镀100,000个EC。
此外,为了确定共培养中ECs的密度是否有助于该模型中的HR损伤衰减,我们研究了EC浓度与CM释放LDH之间的剂量 - 反应关系。
本报告为调查人员提供了一种循序渐进的方法,使他们能够利用这一重要模型。
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Protocol
1. 实验准备/电镀
- 根据制造商的说明维护CM和EC。
- 当两个细胞系从供应商处到达时,解冻它们。用新鲜培养基洗涤后,将板放入T25烧瓶中。建议从购买细胞的同一供应商处购买每种细胞培养基。第二天,用培养基刷新细胞,并在汇合时使用。
- 将细胞培养箱保持在37°C,21%O2,5%CO2,74%N2 并保持加湿。
注意:从C57BL / 6小鼠的冠状动脉中分离出用于该方案的小鼠原发性冠状动脉内皮细胞,并且从成年C57BL / 6J小鼠心脏中分离成年小鼠心肌细胞并商业化获得(参见 材料表)。
- 在无菌条件下将CM板CM板放到24孔板(下层)的底部。24小时后,将ECs板放入共培养孔的插入物(或上部)中。EC电镀后24小时,将EC插入物置于CM板底座上,开始共培养期。使用前让细胞共培养至少12-24小时。下面详细介绍了这些步骤。
- 在光学显微镜下估计CM细胞系汇合度。当细胞在培养瓶中似乎有90%-100%融合时,继续进行实验接种。
- 从含有融合细胞培养物的烧瓶中取出培养基,并用3-5 mL胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)对T25烧瓶进行胰蛋白酶消化。轻轻搅拌烧瓶,在37°C下孵育2-5分钟,然后在光学显微镜下评估酶促进展。一旦细胞开始四舍五入,使用细胞刮刀将细胞从表面上分离。
- 分离后,通过将胰蛋白酶/细胞溶液加入含有10 mL培养基的50 mL管中以灭活胰蛋白酶溶液,用于T25烧瓶。将细胞悬浮液以120× g 离心2分钟,得到软细胞沉淀。除去上清液并将沉淀重悬于5mL培养基中。
- 为了进行细胞计数并确认细胞活力,混合10μL重悬细胞的等分试样和10μL台盼蓝染料。使用细胞计数器计数活细胞。用新鲜的常规培养基稀释细胞,以达到所需的接种密度。根据所需的种子密度和储备溶液的细胞浓度计算体积。所有电镀均应在无菌条件下进行。
- 将CM以每孔300,000的接种密度将CM板固定在预先包被细胞外基质的24孔板的底部。将细胞保持在37°C,用21%O2和 5%CO2 过夜。
- 24小时后,将ECs板放入刀片中,每个刀片的最佳电镀密度为100,000(培养面积为33.6 mm2),(图1)。EC电镀24小时后,将EC插入CM孔内,开始共培养。在进行实验之前,让细胞共培养12-24小时。
- 确保在进行实验时,CM和EC的汇合度均达到80%-90%。
2. 缺氧/再氧合模拟缺血/再灌注损伤 体外
注意:需要按照所述执行以下步骤,不要在两者之间暂停。
- 通过将〜25 mL培养基倒入50 mL锥形管中来制备缺氧培养基。用硅胶膜对顶部进行空气密封,并使用灭菌移液器打孔。创建另一个孔,这次将移液器浸入培养基中约2/3。
- 用缺氧气体(0.0125%O2,5%CO2,94.99%N2)以30 L / min的流速冲洗培养基5分钟。当缺氧开始时,这最大限度地减少了溶解在 培养基中的O 2(步骤2.5)。
- 丢弃含有附着细胞的24孔板或培养插入物的培养基,并用100μL /孔的10%磷酸盐缓冲盐水(PBS)非常温和地洗涤。然后,将500μL新鲜制备的缺氧培养基加入到板或插入物的每个孔中。
注意:在步骤2.5开始细胞和培养基的真正缺氧之前,培养基中的缺氧在此步骤中尽可能短暂地中断。- 在常氧对照组中,用含有葡萄糖和血清的新鲜正常培养基替换原始培养基。
- 通过在腔室内放置装满无菌水的培养皿来加湿缺氧室。接下来,将包含缺氧基团的板放入腔室中。
- 用缺氧气体(0.0125%O2,5%CO2,94.99%N2)以30 L / min的流量冲洗缺氧室5分钟。将室置于37°C培养箱中24小时。
- 缺氧后,在正常条件下培养CM和EC。为此,丢弃板/插入片段的旧培养基,用正常培养基(含有葡萄糖和血清;每个孔/插入片段的500μL)替换它,并在正常培养条件下将其储存在培养箱中(21%O2,5%CO2,74%N2,37°C)2小时以模拟再灌注。
- 为了控制培养基置换的任何影响,请在改变缺氧培养基的同时更换常氧细胞的培养基。
注: 图2 提供了该协议的原理图概述。
3. 终点评估
- 将细胞培养基从24孔板转移到96孔板中。使用来自24孔板的每个孔的200μL培养基,并相应地均匀分布到96孔板的四个孔中。对于正常氧、缺氧和心率,各使用一个板。
- 确定细胞损伤的程度,例如,按照制造商的说明,使用细胞毒性测定试剂盒测量LDH的吸光度。按照测定方案中的指示在96孔板中进行测定。
4. 统计
- 将参数数据显示为平均值/标准差,将非参数数据显示为具有中值/四分位距的箱形图。应执行充分的参数与非参数多重比较测试,并使用可接受的事后测试来降低 1 型错误的机会。显著性通常设置为 alpha 0.05(双尾)。
- 对于当前研究中进行的所有实验,在一个实验中至少进行三次井重复。用于统计分析的每个实验有三到六次重复。
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Representative Results
本实验中使用的所有三种类型的插入物(A,B,C)具有相同的0.4μm孔径。它们之间的唯一区别是插入物到碱基的高度,这使得两个共培养的细胞层之间的距离分别为0.5,1.0和2.0 mm(图3),并且它们来自不同的供应商(有关详细信息,请参阅 材料表)。
为了建立一种 体外 共培养模型,其中两个细胞系的单独层经历HR以模拟IR损伤,我们检查了使用或不具有EC共培养的CM的细胞膜完整性。使用单独的插入物进行EC,该插入物可以放置在CM层上方的不同距离,这使我们能够评估细胞层距离对CM中膜损伤严重程度的差异影响。在另一组实验中,我们改变了EC的密度,从而改变了EC与CM的比率。此外,为了区分模拟缺血和模拟红外损伤,在1)正常氧,2)仅缺氧和3)HR的条件下进行了实验。对于该模型,我们使用24小时缺氧,然后进行2小时再氧合。
可变距离
电池层之间的距离为 0.5 mm(插入件 A)
当单独培养CM时,与正常氧相比,缺氧导致LDH释放显着增加,这与我们以前的研究一致(图4A)6。然而,与仅缺氧组相比,2h复氧后乳酸脱氢酶仅轻度进一步增加。当ECs和CM在0.5 mm距离处共同培养时,仅缺氧引起的LDH释放的增加没有减弱,表明EC没有显示出任何保护作用(与仅缺氧条件下的单独CM组相比)。然而,EC在HR期间对CM施加了温和但显着的保护。
1.0 mm 电池层之间的距离(插入件 B)
进行了与上述相同的实验,除了两个细胞层之间的距离增加到1.0mm(图4B)。我们发现,仅缺氧的CM中的LDH释放也显着增加。然而,与 0.5 mm 刀片不同,仅 CM 中的 LDH 增加是由 HR 而非仅缺氧增强的。此外,与仅使用CM组相比,这种增强作用在再氧合期间由于EC的存在而受到更多抑制和几乎消除。
2.0 mm 电池层之间的距离(插入 C)
当使用在两个细胞系之间产生2.0mm距离的共培养插入片段(图4C)时,我们还发现在缺氧期间仅CM释放的LDH显着增加,其程度与0.5 mm和1.0 mm实验相同。然而,有趣的是,通过再氧合作用释放LDH的额外增加甚至比1.0毫米实验更明显。这两种增加都被EC的存在所减弱,尽管没有被废除,这表明与使用0.5或1.0 mm插入物不同,EC显着保护CM在仅缺氧和HR条件下免受伤害。
可变 EC 强度
在另一组实验中,将2.0 mm插入物中接种的ECs浓度分别滴定为每个插入片段25,000,50,000和100,000个细胞。缺氧24 h后测定LDH释放,然后复氧2 h。我们的结果表明,共培养物中EC强度的增加导致HR引起的LDH释放的剂量依赖性衰减(图5);在常氧条件下未见这种效应。
图1:孔内插入物的示意图。 带有EC的插入片段(每个插入片段最多100,000个细胞)被转移到底部具有CM(每孔300,000个)的24孔板中。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:实验设计。 细胞在正常氧气条件下(21%O2)培养,然后分成两组:常氧对照组将继续在正常条件下再培养24小时,而缺氧组将在缺氧室中培养24小时,只有0.01%O2 ,没有葡萄糖。在这些24小时干预之后,用培养基刷新两组细胞,并在21%O2 环境中连续培养2小时,再氧合阶段,然后最终进行终点测定,例如LDH分析。 请点击此处查看此图的大图。
图3:三种不同刀片的图像和原理图。 插入片段中的内皮细胞与孔底部的心肌细胞之间的距离可以通过使用不同的插入片段来改变。这里使用的所有三种类型的刀片都具有相同的0.4μm孔径。它们之间的唯一区别是插入物到碱基的高度,这使得两个共培养细胞层之间的距离分别为0.5(A),1.0(B)和2.0mm(C)。 请点击此处查看此图的大图。
图4:三种类型的培养插入物在正常氧(左),仅缺氧(中心)和缺氧/再氧条件下(右)对单独心肌细胞(CM;白色),仅内皮细胞(EC;黑色)和CM与EC(检查模式)共培养物的释放的三种类型的培养插入物的比较。 (A)0.5 mm距离,(B)1.0 mm距离, (C)两个不同电池层之间的距离为2.0毫米。以每孔100,000个细胞的密度接种EC,以每孔300,000个细胞的密度接种CM。数据均±标准偏差,每组 n = 4。统计数据:方差分析,然后是Student-Newman-Keuls事后测试。P <0.05(双尾),由每个比较对之间的水平条表示。 请点击此处查看此图的大图。
图5:共培养的内皮细胞的浓度 (EC;25:每次插入物25,000个细胞;每次插入物50:50,000个细胞;每个插入片段100:100,000个细胞)的剂量依赖性影响心肌细胞(CM)免受缺氧/再氧损伤的保护(右),如乳酸脱氢酶(LDH;吸光度单位[au])的释放所证明的那样。EC对常氧条件下的LDH释放没有影响。数据均±标准偏差,每组 n = 4。统计数据:方差分析,然后是Student-Newman-Keuls事后测试。P <0.05(双尾),由每个比较对之间的水平条表示。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
协议中的关键步骤
细胞共培养模型已被用于研究心脏保护的细胞机制。因此,如何创建两个独立的层,它们之间有有意义的距离,对于开发合适的共培养模型至关重要。研究模拟IR(即HR损伤)的一个挑战是,不仅缺血(缺氧)本身,而且再灌注(再氧合)也会加重细胞功能障碍。因此,一个现实的模型需要反映这些特征,例如,证明缺氧后再氧合的损伤充分增加,而不是单独缺氧,但仍然允许用细胞保护药物或策略(例如,在我们的例子中,存在ECs)来减轻损伤。有趣的是,两个细胞层之间的距离似乎在开发合适的共培养模型方面起着重要作用。我们能够证明,1.0 mm和2.0 mm的距离在EC和CM之间允许预期的HR损伤反应,但更重要的是,只有2.0 mm在缺氧和HR条件下都存在EC,从而产生了持续的细胞损伤保护结果。
方法的修改和故障排除
共培养模型中的细胞- 细胞相互作用受多个变量的影响,例如不同共培养群体的数量,细胞类型的相似程度,它们之间的物理分离程度,群体局部环境之间的差异,培养物的体积和共培养物的时间考虑9,10,11,12.这些因素之间存在权衡取舍。这些相互作用受到环境的强烈影响,而环境又由协议和设置决定。开发可复制、可测量和可比较的实验模型至关重要。我们的方法是控制和限制可能破坏从不同时间进行的不同实验中获得的数据的一致性的变量数量,方法是使用相同比例的两种共培养细胞系,相同体积的细胞培养基和测定试剂等,但三种不同的细胞培养插入物除外。
方法的局限性
我们的模型适用于EC和CM,这可能是由于EC在心血管系统中无处不在。其他类型的潜在目标细胞系与CM,神经元或其他感兴趣的细胞 在体外 研究的相互作用程度尚待评估,因为不同的细胞系在共培养环境中可能以不同的方式相互作用。共培养细胞群之间的一个区别可能是它们的生态关系,例如,如果它们是天然的竞争者或合作者。此外,与所有其他 体外 细胞模型一样,实验中产生的细胞损伤可能不代表 体内损伤的实际病理生理学状态。此外,我们承认,经测试的EC和CM之间的0.5,1.0和2.0毫米之间的距离不会 在体内再现其间距;对于给定 的体外 模型;然而,我们的研究结果描述了两个细胞层之间最佳距离的影响,这些细胞层将由希望利用这种技术的科学家进行研究。
该方法相对于现有/替代方法的重要性
现有/替代的共培养方法包括直接混合细胞系或创建具有一定程度分离的分离环境,例如使用透孔板13,微流体平台14 或三维支架15,其中透孔板是最便宜和最容易获得的。尽管存在自然限制,但共培养物与药物研究高度相关,因为它们提供了更具代表性 的体内样组织模型,并允许高通量测试和深入监测药物对细胞 - 细胞相互作用的影响16。我们的模型使用ECs和CM之间明确定义的空间距离进行精确校准,而不是两种不同类型的细胞的完整和不受控制的混合物。此外,该模型允许单独处理和分析单个类型的细胞,这在混合共培养中是不可能实现的,更不用说 在体内了。由于红外损伤涉及单独的HR过程,因此该模型非常适合分别研究缺血/缺氧与再灌注/再氧合损伤的细胞机制。我们的数据表明,它可能是一种非常有价值和高效的细胞共培养模型,可用于模拟IR损伤研究。我们的观察清楚地表明,在这种特定的共培养模型中,EC与CM串扰是必要的最佳空间距离,在我们的例子中为2.0 mm,因此EC可能分泌的信号分子可以有效地循环,以保护CM免受仅缺氧和/或HR的伤害。
这些方法在特定研究领域的重要性和潜在应用
我们的模型表明将小鼠冠状动脉EC与小鼠CM相结合以改善对HR损伤的保护措施的研究的重要性;改变共培养物的空间距离是更好地了解影响EC对HR引起的CM损伤的保护作用的空间条件的有效方法;并且EC的密度或EC-CM比值与HR损伤的保护程度呈正相关。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作部分得到了美国退伍军人事务部生物医学实验室研发服务(I01 BX003482)和M.L.R.机构资金的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
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