Summary
Romlig avstand er en nøkkelparameter for å vurdere hypoksi / reoksygeneringsskade i en samkulturmodell av separate endotel- og kardiomyocyttcellelag, noe som for første gang antyder at optimalisering av samkulturens romlige miljø er nødvendig for å gi en gunstig in vitro-modell for å teste rollen som endotelceller i kardiomyocyttbeskyttelse.
Abstract
Iskemisk hjertesykdom er den ledende årsaken til død og funksjonshemming over hele verden. Reperfusjon forårsaker ytterligere skade utover iskemi. Endotelceller (ECer) kan beskytte kardiomyocytter (CMs) mot reperfusjonsskade gjennom cellecelleinteraksjoner. Samkulturer kan bidra til å undersøke rollen som cellecelleinteraksjoner. En blandet samkultur er den enkleste tilnærmingen, men er begrenset ettersom isolerte behandlinger og nedstrømsanalyser av enkeltcelletyper ikke er gjennomførbare. For å undersøke om ECer kan doseavhengig dempe CM-celleskade og om denne beskyttelsen kan optimaliseres ytterligere ved å variere kontaktavstanden mellom de to cellelinjene, brukte vi Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells og Adult Mouse Cardiomyocytes for å teste tre typer cellekulturinnlegg som varierte i deres intercellede lagavstand ved 0,5, henholdsvis 1,0 og 2,0 mm. Kun ved CMs økte cellulær skade som vurdert ved laktat dehydrogenase (LDH) frigjøring betydelig under hypoksi og videre ved reoksygenering når avstanden var 2,0 mm sammenlignet med 0,5 og 1,0 mm. Når ECs og CMs var i nesten direkte kontakt (0,5 mm), var det bare en mild demping av reoksygeneringsskaden til CMs etter hypoksi. Denne dempingen ble betydelig økt når den romlige avstanden var 1,0 mm. Med 2,0 mm avstand svekket ECs CM-skade under både hypoksi og hypoksi/reoksygenering, noe som indikerer at tilstrekkelig kulturavstand er nødvendig for at ECs skal krysstale med CMs, slik at utskilte signalmolekyler kan sirkulere og fullt stimulere beskyttende veier. Våre funn tyder for første gang på at optimalisering av det romlige miljøet i EC/CM-kokulturen er nødvendig for å gi en gunstig in vitro-modell for å teste ECs rolle i CM-beskyttelse mot simulert iskemi/reperfusjonsskade. Målet med denne rapporten er å gi en trinnvis tilnærming for etterforskere å bruke denne viktige modellen til sin fordel.
Introduction
Iskemisk hjertesykdom er den ledende dødsårsaken og funksjonshemmingen over hele verden 1,2. Imidlertid kan behandlingsprosessen for reperfusjon selv forårsake kardiomyocyttdød, kjent som myokardisk iskemi / reperfusjonsskade (IR), som det fortsatt ikke er noe effektivt middel3 for. Endotelceller (ECs) har blitt foreslått å beskytte kardiomyocytter (CMs) gjennom sekresjon av parakrine signaler, samt celle-til-celle interaksjoner4.
Cellekokulturmodeller har blitt brukt mye for å undersøke rollen som autocrine og / eller parakrine cellecelleinteraksjoner på cellefunksjon og differensiering. Blant samkulturmodeller er blandet samkultur den enkleste, der to forskjellige typer celler er i direkte kontakt i et enkelt kulturrom med ønsket celleforhold5. Separate behandlinger mellom celletyper og nedstrømsanalyse av en enkelt celletype er imidlertid ikke lett mulig gitt den blandede populasjonen.
Tidligere studier indikerte at hypoksiske og iskemiske fornærmelser forårsaker betydelig skade på integriteten til cellemembranen målt ved frigjøring av laktatdehydrogenase (LDH). Denne skaden forverres ved reoksygenering, og etterligner reperfusjonsskade 6,7,8. Målet med den nåværende protokollen var å teste hypotesene om at tilstedeværelsen av ECs kan doseavhengig dempe cellemembranlekkasje av CMs forårsaket av hypoksi og reoksygenering (HR) og at den beskyttende effekten av ECs kan optimaliseres ved å variere kontaktavstanden mellom de to cellelinjene. Dermed brukte vi tre typer cellekulturinnlegg og Mus Primær Koronar Arterie Endotelceller og Voksen Mus Kardiomyocytter. Innsatsene, merket av Corning, Merck Millipore og Greiner Bio-One tillot oss å lage tre forskjellige cellekultur-krysstaleforhold med intercellede linjeavstander på henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm. 100 000 ECer ble belagt per innsats i hvert tilfelle.
For å finne ut om tettheten av ECs i samkultur bidrar til HR-skadedemping i denne modellen, studerte vi doseresponsforholdet mellom EC-konsentrasjon og LDH-frigjøring av CMs. ECs ble belagt med henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 per innsats.
Denne rapporten gir en trinnvis tilnærming for etterforskere til å bruke denne viktige modellen til sin fordel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Eksperimentell forberedelse/plating
- Vedlikehold CMer og ECer i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tine begge cellelinjene når de kommer fra leverandører. Plate i T25 kolber etter å ha blitt vasket med friske medier. Det anbefales å kjøpe hvert cellekulturmedie fra de samme leverandørene som cellene ble kjøpt fra. Neste dag oppdaterer du cellene med medier og bruker dem sammen.
- Vedlikehold cellekulturinkubatoren ved 37 °C med 21 % O2, 5 % CO2, 74 % N2 og hold den fuktet.
MERK: Musens primære koronararterie endotelceller som brukes i denne protokollen er isolert fra koronararterier av C57BL/6 mus, og voksenmus kardiomyocytter er isolert fra voksne C57BL/6J musehjerter og kommersielt oppnådd (se Materialtabell).
- Plate CMs under sterile forhold på bunnen av 24-brønns plater (dårligere lag). 24 timer senere, plate ECs inn i innsatsen (eller overlegen del) av co-kultur godt. 24 timer etter EC-plating, plasser EC-innsatser på CM-platebaser, og start kokulturperioden. La cellene samkultur i minst 12-24 timer før bruk. Disse trinnene er beskrevet i detalj nedenfor.
- Beregn CM-cellelinjesamtid under et lysmikroskop. Når celler ser ut til å være 90% -100% sammenfallende i kulturflasker, fortsett med eksperimentell plating.
- Fjern mediet fra kolber som inneholder konfluentecellekulturer og prøv med 3-5 ml Trypsin / Etylenediaminetetraacetic acid (EDTA) for T25 kolber. Rør kolben forsiktig, inkuber ved 37 °C i 2-5 min, og vurder deretter den enzymatiske fremgangen under et lysmikroskop. Når cellene begynner å runde opp, bruker du en celleskraper til å løsne cellene fra overflaten.
- Etter løsrivelse, deaktiver trypsinløsningen ved å legge til trypsin / celleløsningen til et 50 ml rør som inneholder 10 ml medier for T25-kolber. Sentrifuger cellefjæringen ved 120 x g i 2 min for å få en myk cellepellet. Fjern supernatanten og resuspend pellet i 5 ml medier.
- For å utføre celletelling og bekrefte celle levedyktighet, bland en aliquot på 10 μL resuspended celler og 10 μL trypan blå fargestoff. Tell de levende cellene ved hjelp av en celleteller. Fortynn cellene med friske vanlige medier for å oppnå ønsket såing tettheter. Volumene beregnes avhengig av ønsket frøtetthet og cellekonsentrasjon av lagerløsninger. All plating skal utføres under sterile forhold.
- Plate CMs ved såddtetthet på 300.000 per brønn på bunnen av en 24-brønns plate forhåndsbelagt med ekstracellulær matrise. Vedlikehold cellene ved 37 °C med 21 % O2 og 5 % CO2 over natten.
- Etter 24 timer settes plate-EC-ene inn i innsatser med en optimal beleggtetthet på 100 000 per innsats (kulturområdet er 33,6 mm2) (figur 1). Etter 24 timers EC-plating plasserer du EC-innsatser inne i CM-brønnene, og starter medkultur. Tillat celler å samkulturere i 12-24 timer før du utfører forsøkene.
- Forsikre deg om at når eksperimenter utføres, har både CMer og ECer nådd 80% -90% samløp.
2. Hypoksi/reoksygenering for å simulere iskemi/reperfusjonsskade In Vitro
MERK: Følgende trinn må utføres som beskrevet, ikke pause i mellom.
- Forbered det hypoksiske mediet ved å helle ~ 25 ml medier i et 50 ml konisk rør. Lufttetning av toppen med en silikonmembran og bruk en sterilisert pipette til å slå et hull. Lag et nytt hull, denne gangen forlater pipetten nedsenket ca 2/3 inn i mediet.
- Skyll mediene med hypoksisk gass (0,0125 % O2, 5 % CO2, 94,99 % N2) i 5 minutter med en strømningshastighet på 30 L/min. Dette minimerer O2 oppløst i mediet når hypoksi starter (trinn 2.5).
- Kast mediet av de 24-brønns platene eller kulturinnleggene som inneholder vedlagte celler og vask med 100 μL / brønn på 10% fosfat bufret saltvann (PBS) veldig forsiktig. Deretter legger du til 500 μL av de nylagde hypoksiske mediene til hver brønn av platene eller innsatsene.
MERK: Hypoksi i media avbrytes så kort som mulig i løpet av dette trinnet før ekte hypoksi for celler og medier starter i trinn 2.5.- I den normoksiske kontrollgruppen erstatter du det opprinnelige mediet med friske normale medier som inneholder glukose og serum.
- Fukt hypoksikammeret ved å plassere en Petri-tallerken fylt med sterilt vann i kammeret. Deretter plasserer du platene som består av de hypoksiske gruppene i kammeret.
- Skyll hypoksikammeret med hypoksisk gass (0,0125 % O2, 5 % CO2, 94,99 % N2) i 5 minutter ved en strøm på 30 L/min. Plasser kammeret i inkubatoren på 37 °C i 24 timer.
- Etter hypoksi, dyrk CMs og ECs under normale forhold. For å gjøre dette, kast det gamle mediet på platene / innsatsene, erstatt det med normale medier (som inneholder glukose og serum; 500 μL av hver brønn / innsats) og lagre den i inkubatoren under normale kulturforhold (21% O2, 5% CO2, 74% N2, 37 °C) i 2 timer for å etterligne reperfusjon.
- Hvis du vil kontrollere for eventuelle effekter av medieerstatning, endrer du mediet av normoksiske celler samtidig som det hypoksiske mediet endres.
MERK: Figur 2 gir en skjematisk oversikt over denne protokollen.
3. Vurdering av endepunkt
- Overfør cellekulturmediene fra 24-brønnsplaten til en 96-brønnsplate. Bruk 200 μL medier fra hver brønn på 24-brønnsplaten og fordel den likt i fire brønner på 96-brønnsplaten, tilsvarende. Bruk en plate hver for normoksia versus hypoksi versus HR.
- Bestem graden av cellulær skade, for eksempel ved å måle absorbans for LDH ved hjelp av et cytotoksisitetsanalysesett i henhold til produsentens instruksjoner. Utfør analysen i en 96-brønnsplate som beskrevet i analyseprotokollen.
4. Statistikk
- Vis de parametriske dataene som gjennomsnitts-/standardavvik og ikke-parametriske data når bokstegninger med median/interkvartilt område. Tilstrekkelige parametriske versus ikke-parametriske multimetriske multisammenligningstester med akseptable post-hoc-tester for å redusere sjansen for en type-1-feil bør utføres. Gjeldende_multiplum angis vanligvis til en alfa på 0,05 (tosidig).
- For alle forsøkene som utføres i den nåværende studien, utfør minst tre brønnrepliske i ett eksperiment. Det var tre til seks repetisjoner av hvert eksperiment som ble brukt til statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle tre typer innsatser (A, B, C) som brukes i dette eksperimentet har samme porestørrelse på 0,4 μm. Den eneste forskjellen mellom dem er innsats-til-grunn-høyden, som gjør at avstandene mellom de to samkulturerte cellelagene er henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm (figur 3) og at de er fra forskjellige leverandører (for detaljer se Tabell over materialer).
For å etablere en in vitro-samkulturmodell med separate lag med to cellelinjer som gjennomgår HR for å simulere IR-skade, undersøkte vi cellemembranintegriteten til CMs som var kokulturert med eller uten ECs. Ved å bruke en egen innsats for ECer som kan plasseres på varierte avstander over CM-laget, kunne vi også vurdere differensialeffektene av cellelagavstand på alvorlighetsgraden av membranskade i CMs. I et eget sett med eksperimenter varierte vi tettheten av ECs og dermed forholdet mellom ECs og CMs. I tillegg, for å skille simulert iskemi fra simulert IR-skade, ble eksperimenter utført under forhold med 1) normoksi, 2) hypoksi bare, og 3) HR. For denne modellen brukte vi 24 h hypoksi, etterfulgt av 2 h reoksygenering.
Variable avstander
0,5 mm avstand mellom cellelagene (sett inn A)
Når CMs ble dyrket alene, førte hypoksi til en betydelig økt LDH-utgivelse sammenlignet med normoksi, i samsvar med våre tidligere studier (figur 4A)6. Imidlertid ble LDH bare mildt ytterligere økt ved 2h reoksygenering sammenlignet med hypoksi-bare gruppen. Når ECs og CMs ble samkulturert sammen med en avstand på 0,5 mm, ble økningen i LDH-frigjøring av hypoksi bare ikke svekket, noe som indikerer at ECene ikke viste noen beskyttende effekt (sammenlignet med CMs alenegruppe under hypoksi-bare forhold). EC-er utøvde imidlertid en mild, men betydelig beskyttelse på CMs under HR.
1,0 mm avstand mellom cellelagene (sett inn B)
Det samme eksperimentet ble utført som ovenfor, bortsett fra at avstanden mellom de to cellelagene ble økt til 1,0 mm (figur 4B). Vi fant at LDH-utgivelsen også ble betydelig økt i CMs-only av hypoksi-only. Men i motsetning til i innsatsen på 0,5 mm ble LDH-økningen bare i CMs-only forsterket av HR over hypoksi. Videre ble denne potensieringen mer hemmet og nesten avskaffet av tilstedeværelsen av ECene under reoksygenering sammenlignet med CMs-only-gruppen.
2,0 mm avstand mellom cellelagene (sett inn C)
Når samkulturinnlegg som skaper en avstand på 2,0 mm mellom de to cellelinjene (figur 4C) ble brukt, fant vi også en betydelig økning av LDH-frigjøring kun av CMs-only under hypoksi, i samme grad som i 0,5 mm- og 1,0 mm-eksperimenter. Interessant nok var imidlertid den ekstra økningen i LDH-frigjøring ved reoksygenering enda mer uttalt enn i 1,0 mm-forsøkene. Begge disse økningene ble svekket, men ikke avskaffet, ved tilstedeværelse av ECs, noe som indikerer at forskjellig fra å bruke 0,5 eller 1,0 mm innsatser, beskyttet ECs betydelig CMs mot skade under både hypoksi- og HR-forhold.
Variable EC-intensiteter
I et annet sett med eksperimenter ble konsentrasjonen av ECs belagt i 2,0 mm innsatser titrert til henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 celler per innsats. LDH-frigjøring ble målt etter 24 h hypoksi etterfulgt av 2 timers reoksygenering. Våre resultater viste at økende EC-intensitet i samkulturen førte til en doseavhengig demping av LDH-frigjøring forårsaket av HR (figur 5); ingen slik effekt ble sett under normoksiske forhold.
Figur 1: Skjematisk innsats inne i brønnen. Innsatsene med ECene (opptil 100 000 celler per innsats) overføres til 24-brønnsplatene med CMs (300.000 per brønn) på bunnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksperimentell design. Celler dyrkes under normale oksygenforhold (21% O2), og deles deretter inn i to grupper: En normoksisk kontrollgruppe vil fortsette å bli dyrket under normale forhold i ytterligere 24 timer, mens hypoksigruppen vil bli dyrket i et hypoksikammer i 24 timer med bare 0,01% O2 og ingen glukose. Etter disse 24 h intervensjonene oppdateres begge cellegruppene med medier og dyrkes kontinuerlig i et 21% O2-miljø i ytterligere 2 timer, reoksygeneringsfasen, før de til slutt gjennomfører endepunktanalysen(e), for eksempel LDH-analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bilder og skjemaer av de tre forskjellige innsatsene. Avstanden mellom endotelcellene i innsatsen og kardiomyocyttene nederst i brønnen kan varieres ved hjelp av forskjellige innsatser. Alle tre typer innsatser som brukes her har samme porestørrelse på 0,4 μm. Den eneste forskjellen mellom dem er innsats-til-grunn-høyden, som gjør at avstandene mellom de to samkulturerte cellelagene er henholdsvis 0,5 (A), 1,0 (B) og 2,0 mm (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av tre typer kulturinnlegg i vurderingen av frigjøring av laktatdehydrogenase (LDH; i absorbansenheter [au]) under normoksiske (venstre), hypoksi-only (midten) og hypoksi/reoksygeneringsforhold (høyre) for kardiomyocytter alene (CM; hvit), endotelceller alene (EC; svart) og samkulturer i CM med EC (sjekkmønster). (C) 2,0 mm avstand mellom de to forskjellige cellelagene. ECer ble belagt med en tetthet på 100 000 celler per innsats, CMer med en tetthet på 300 000 celler per brønn. Data er gjennomsnittlig ± standardavvik, n = 4 per gruppe. Statistikk: ANOVA etterfulgt av Student-Newman-Keuls post-hoc test. P < 0,05 (tosidet) indikert med horisontale streker mellom hvert sammenlignet par. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Konsentrasjon av samkulturerte endotelceller (EF; 25: 25 000 celler per innsats; 50: 50 000 celler per innsats; 100: 100 000 celler per innsats) doseavhengig påvirket beskyttelse av kardiomyocytter (CM) mot hypoksi/reoksygeneringsskade (høyre) sammenlignet med normoksiske tilstander (venstre) som det fremgår av frigjøring av laktatdehydrogenase (LDH; i absorbansenheter [au]). ECs hadde ingen effekt på LDH-utslipp under normoksiske forhold. Data er gjennomsnittlig ± standardavvik, n = 4 per gruppe. Statistikk: ANOVA etterfulgt av Student-Newman-Keuls post-hoc test. P < 0,05 (tosidet) indikert med horisontale streker mellom hvert sammenlignet par. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Cellekokulturmodeller har blitt brukt til å studere cellulære mekanismer for kardiobeskyttelse. Hvordan lage to separate lag med en meningsfull avstand mellom dem er derfor avgjørende for utviklingen av en passende samkulturmodell. En utfordring med å studere simulert IR, det vil si HR, skade er at ikke bare iskemi (hypoksi) selv, men også reperfusjon (reoksygenering) forverrer cellulær dysfunksjon. Derfor må en realistisk modell reflektere disse egenskapene ved for eksempel å demonstrere tilstrekkelig økt skade ved reoksygenering etter hypoksi i motsetning til hypoksi alene, men likevel tillate demping av skade med cellebeskyttende legemidler eller strategier som i vårt tilfelle tilstedeværelsen av ECs. Interessant nok ser avstanden mellom de to cellelagene ut til å spille en viktig rolle i å utvikle en passende samkulturmodell. Vi var i stand til å demonstrere at en 1,0 mm og en 2,0 mm avstand mellom ECs og CMs tillot forventet HR-skaderespons, men enda viktigere, at bare 2,0 mm ga et konsekvent gunstig resultat for cellulær skadebeskyttelse ved tilstedeværelse av ECs under både hypoksiske og HR-forhold.
Endringer og feilsøking av metoden
Cellecelleinteraksjoner i samkulturmodeller påvirkes av flere variabler som antall distinkte samkulturerte populasjoner, graden av likhet mellom celletypene, graden av fysisk separasjon mellom dem, forskjellen mellom befolkningens lokale miljøer, volumet av kulturer og timinghensynet til samkulturen 9,10,11,12 . Det er avveininger mellom disse faktorene. Disse interaksjonene påvirkes sterkt av miljøet, som igjen bestemmes av protokollen og oppsettet. Det er viktig å utvikle eksperimentelle modeller som er repliserbare, målbare og sammenlignbare. Vår tilnærming var å kontrollere og begrense antall variabler som kan forstyrre konsistensen av dataene som er oppnådd fra forskjellige eksperimenter utført på forskjellige tidspunkter gjennom å plating et nøyaktig antall celler, ved hjelp av samme forhold mellom to samkulturerte cellelinjer, de samme volumene av cellekulturmediene og analysereagenser, etc., med unntak av de tre forskjellige cellekulturinnleggene.
Begrensninger ved metoden
Vår modell fungerer bra med ECs og CMs, sannsynligvis skyldt til allestedsnærværende tilstedeværelse av ECs i kardiovaskulærsystemet. Hvor godt andre typer cellelinjer av potensiell interesse samhandler med CMs, nevroner eller andre celler av interesse som skal studeres in vitro , er ennå ikke evaluert, da forskjellige cellelinjer kan samhandle annerledes i samkulturmiljøet. En forskjell mellom de samkulturerte cellepopulasjonene kan være deres økologiske forhold, for eksempel hvis de er naturlige konkurrenter eller cooperatorer. Også, som i alle andre in vitro celle modeller, den genererte cellulære skaden i eksperimentet kan ikke representere den faktiske patofysiologiske tilstanden til skade in vivo. Videre erkjenner vi at de testede avstandene mellom ECs og CMs på 0,5, 1,0 og 2,0 mm ikke reproduserer avstanden in vivo; for den gitte in vitro-modellen ; Våre resultater beskriver imidlertid implikasjonene av optimal distansering mellom to cellelag som skal studeres av forskere som ønsker å dra nytte av denne teknikken.
Metodens betydning med hensyn til eksisterende/alternative metoder
De eksisterende/alternative samkulturmetodene inkluderer direkte blanding av cellelinjer eller oppretting av separert miljø med en grad av separasjon som bruk av transwellplater13, mikrofluidiske plattformer14 eller tredimensjonale stillaser15, blant annet transwellplater er de billigste og enkleste tilgjengelige. Til tross for naturlige begrensninger er samkulturer svært relevante for narkotikaforskning fordi de gir en mer representativ in vivo-lignende vevsmodell og tillater høygjennomstrømningstesting og grundig overvåking av narkotikaeffekter på cellecelleinteraksjoner16. Vår modell ble nøyaktig kalibrert ved hjelp av veldefinerte romlige avstander mellom ECs og CMs, i stedet for en komplett og ukontrollert blanding av to forskjellige typer celler. Videre tillater denne modellen separate behandlinger og analyserer individuelle typer celler, noe som er umulig å oppnå i en blandet samkultur, for ikke å nevne in vivo. Fordi IR-skade innebærer separate HR-prosesser, er denne modellen godt egnet til å studere de cellulære mekanismene til iskemi / hypoksi vs reperfusjon / reoksygeneringsskader separat. Dataene våre tyder på at det kan være en svært verdifull og effektiv cellekokulturmodell som skal brukes i simulerte IR-skadestudier. Våre observasjoner indikerer tydelig at en optimal romlig avstand, i vårt tilfelle 2,0 mm, er nødvendig for at ECs skal krysstale med CMs i denne spesifikke samkulturmodellen, slik at potensielt utskilte signalmolekyler av ECene kan sirkulere effektivt til ulovlig beskyttelse av CMs mot skade kun av hypoksi og / eller HR.
Viktigheten og potensielle anvendelser av metodene på spesifikke forskningsområder
Vår modell indikerer betydningen av å kombinere mus koronar arterie ECs med mus CMs for å forbedre undersøkelsen av beskyttende tiltak mot HR-skade; at varierende romlig avstand til samkulturer viser en effektiv måte å bedre forstå de romlige forholdene som påvirker ECs beskyttende virkning på CM-skade forårsaket av HR; og at tettheten av ECs eller EC-to-CM-forholdet er positivt korrelert med omfanget av beskyttelse mot HR-skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av us Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) og av institusjonelle midler til M.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
References
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).
- Gottlieb, R. A. Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).
- Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease. The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury. Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Martindale, J. J., Metzger, J. M. Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).
- vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device. Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).
- Bidarra, S. J., et al. Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells. Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PloS One. 6, 25661 (2011).
- Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures. PloS One. 7, 31711 (2012).
- Miki, Y., et al. The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6, 25661 (2011).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).
