Método de PCR de gotas digitales para la cuantificación de la eficiencia de la transducción AAV en la retina murina

Iskalen Cansu Topcu Okan; Mehri Ahmadian; Yesim Tutuncu; Halit Yusuf Altay; Cavit Agca

doi:10.3791/63038

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Artículo de método

Método de PCR de gotas digitales para la cuantificación de la eficiencia de la transducción AAV en la retina murina

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DOI:

10.3791/63038

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25 de diciembre de 2021

Iskalen Cansu Topcu Okan¹^,² , Mehri Ahmadian¹^,² , Yesim Tutuncu¹^,² , Halit Yusuf Altay¹^,² , Cavit Agca¹^,²

¹Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, ²Nanotechnology Research and Application Center (SUNUM), Sabanci University

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta cómo cuantificar la eficiencia de la transducción de AAV en la retina del ratón mediante PCR digital por gotas (dd-PCR) junto con la producción de AAV a pequeña escala, la inyección intravítrea, las imágenes de la retina y el aislamiento del ADN genómico de la retina.

Resumen

Muchos laboratorios de biología celular de la retina ahora usan rutinariamente virus adenoasociados (AAV) para la edición de genes y aplicaciones regulatorias. La eficiencia de la transducción AAV suele ser crítica, lo que afecta los resultados experimentales generales. Uno de los principales determinantes para la eficiencia de transducción es el serotipo o variante del vector AAV. Actualmente, varios serotipos y variantes artificiales de AAV están disponibles con diferentes afinidades con los receptores de la superficie de la célula huésped. Para la terapia génica retiniana, esto resulta en diversos grados de eficiencia de transducción para diferentes tipos de células retinianas. Además, la ruta de inyección y la calidad de la producción de AAV también pueden afectar la eficiencia de la transducción de AAV retiniana. Por lo tanto, es esencial comparar la eficiencia de diferentes variantes, lotes y metodologías. El método de PCR digital de gotas (dd-PCR) cuantifica los ácidos nucleicos con alta precisión y permite realizar la cuantificación absoluta de un objetivo determinado sin ningún estándar o referencia. Utilizando dd-PCR, también es factible evaluar las eficiencias de transducción de los AV mediante la cuantificación absoluta de los números de copias del genoma AAV dentro de una retina inyectada. Aquí, proporcionamos un método sencillo para cuantificar la tasa de transducción de AAV en células de la retina utilizando dd-PCR. Con modificaciones menores, esta metodología también puede ser la base para la cuantificación del número de copias del ADN mitocondrial, así como para evaluar la eficiencia de la edición de bases, crítica para varias enfermedades de la retina y aplicaciones de terapia génica.

Introducción

Los virus adeno asociados (AVA) ahora se usan comúnmente para una variedad de estudios de terapia génica retiniana. Los AAV proporcionan una forma segura y eficiente de administración de genes con menos inmunogenicidad y menos integraciones del genoma. La entrada de AAV en la célula diana se produce a través de la endocitosis, que requiere la unión de receptores y co-receptores en la superficie celular¹^,². Por lo tanto, la eficiencia de transducción de los AV para diferentes tipos de células depende principalmente de la cápside y sus interacciones con los receptores de la célula huésped. Los AAV tienen serotip....