Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att upprätta och utföra en repsåranalys på tvådimensionella (2D) monolager härledda från tredimensionella (3D) enteroider isolerade från icke-mänskliga primat ileum.
Abstract
In vitro repsåranalyser används ofta för att undersöka mekanismerna och egenskaperna hos epitelläkning i en mängd olika vävnadstyper. Här beskriver vi ett protokoll för att generera ett tvådimensionellt (2D) monolager från tredimensionella (3D) icke-mänskliga primatenteroider härledda från tarmkrypter i terminal ileum. Dessa enteroid-härledda monolager användes sedan i en in vitro-repsåranalys för att testa förmågan hos hyaluronan 35 kDa (HA35), en human mjölk HA-efterlikning, för att främja cellmigration och spridning längs epitelsårkanten. Efter att monolagren hade odlats till sammanflöde repades de manuellt och behandlades med HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) eller kontroll (PBS). Cellmigration och proliferation in i gapet avbildades med hjälp av ett överfört ljusmikroskop utrustat för levande cellavbildning. Sårförslutning kvantifierades som procent sårläkning med hjälp av Wound Healing Size Plugin i ImageJ. Repområdet och hastigheten för cellmigration och andelen sårförslutning mättes över 24 timmar. HA35 in vitro påskyndar sårläkning i små intestinala enteroidmonolager, sannolikt genom en kombination av cellproliferation vid sårkanten och migration till sårområdet. Dessa metoder kan potentiellt användas som en modell för att utforska tarmregenerering i den prematura mänskliga tunntarmen.
Introduction
Nekrotiserande enterokolit (NEC) är en av de vanligaste gastrointestinala nödsituationerna hos för tidigt födda barn1. Sjukdomen kännetecknas av svår tarminflammation som snabbt kan försämras till tarmnekros, sepsis och potentiellt död. Även om etiologin är oklar, tyder bevis på att NEC är multifaktoriell och resultatet av en komplex interaktion mellan utfodring, onormal bakteriekolonisering och ett omoget tarmepitel 2,3. För tidigt födda barn har ökad tarmpermeabilitet, onormal bakteriekolonisering och låg enterocytregenerativ kapacitet4,5, vilket ökar risken för tarmbarriärdysfunktion, bakteriell translokation och NEC-utveckling. Därför är det viktigt att identifiera strategier eller ingrepp för att påskynda tarmepitelmognad och främja regenerering eller läkning av tarmepitelet för att förhindra denna dödliga sjukdom.
Studier har visat att bröstmjölk (HM) är skyddande mot NEC hos för tidigt födda barn 6,7,8,9,10,11. Både studier på människor och djur har visat att bovin formel ökar tarmpermeabiliteten och är direkt giftig för tarmepitelceller 2,12. Även om det inte är helt klarlagt, tyder bevis på att de skyddande effekterna av HM förmedlas genom bioaktiva komponenter såsom laktoferrin, immunglobulin A (IgA) och HM-oligosackarider13. HM är också rik på hyaluronan (HA), en unikt icke-sulfaterad glykosaminoglykan med upprepande D-glukuronsyra och N-acetyl-D-glukosamindisackarider14,15. Viktigt är att vi har visat att oral 35 kDa HA (HA35), en HM HA-efterlikning, dämpar svårighetsgraden av tarmskada, förhindrar bakteriell translokation och minskar dödligheten i en murin NEC-liknande tarmskademodell16,17.
Här undersöks effekterna av HA35 på tarmläkning och regenerering in vitro ytterligare. För närvarande är den mest använda in vitro-analysen för tarmsårning och reparation en repsåranalys utförd i kolorektal cancer (CRC) cellmonolager. Den fysiologiska relevansen av en sådan modell för den prematura spädbarnstarmen är begränsad, eftersom sårreparation av CRC-celler är starkt beroende av cancercellernas mycket proliferativa natur snarare än stamcellsdrivna reparationsprocesser18. För att övervinna denna begränsning beskrivs här upprättandet av en 2D-enteroid repsårmodell, inklusive proceduren för att isolera och upprätthålla primära stamcellsderiverade tunntarmsenteroider från prematura icke-mänskliga primater (NHP). Med tanke på att prematur NEC oftast rapporteras i den distala tunntarmen, ger användningen av primära epitelcellorganoider i en modell av tarmskada och reparation en mer fysiologiskt översättbar in vitro-modell jämfört med befintliga modeller som använder traditionella kolorektalmonolager18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök i denna studie godkändes av University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Efter institutionellt godkännande erhölls fostertunntarmsprover från en prematur icke-mänsklig primat (NHP, 90% dräktighet, olivbabian, Papio anubis) efter eutanasi för en separat studie (protokoll #101523-16-039-I)20.
1. Etablering av prematura icke-mänskliga primat 3D-intestinala enteroider
- Förberedelse av media
OBS: Media kan förberedas upp till 1 vecka före kryptisolering enligt standard aseptisk teknik. Penicillin/streptomycin (slutlig koncentration 1 %) kan användas i stället för bredspektrumantibiotika för primärceller om så önskas.- Förbered humant organoidtillväxtmedium + Y-27632 (HOGMY) genom att blanda 50 ml organoid tillväxtmedium humant basalmedium med 50 ml organoidtillskott (materialtabell). Tillsätt 200 μl av bredspektrumantibiotika (slutlig koncentration 100 μg/ml) (materialtabell) och Y-27632 (till en slutlig koncentration på 10 μM). Värm på bänkskivan till rumstemperatur.
- Förbered humant organoid tillväxtmedium (HOGM) genom att blanda 50 ml organoid tillväxtmedium humant basalmedium med 50 ml organoid tillägg. Tillsätt 200 μl av bredspektrumantibiotika (100 μg/ml). Värm på bänkskivan till rumstemperatur.
OBS: HOGM kommer att användas vid byte av media utöver de första 2-3 dagarna efter passagen. - Kyl 100 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium eller magnesium tills den är iskall halt.
- Förbered 50 ml tvättbuffert genom att kombinera 1x PBS utan kalcium eller magnesium med 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Kyl det tills det är iskallt.
- Förbered DMEM-F12 tvättbuffert genom att tillsätta 1 ml bredspektrum antibiotika (100 μg / ml) till 500 ml DMEM / F12 (Dulbeccos modifierade örnmedium / näringsskinka blandning F12 + 15 mM HEPES-buffert). Håll det iskallt.
- Kryptisolering och plätering
OBS: Extracellulär matris (ECM) -baserad hydrogel måste förbli på isen under hela proceduren. Denna procedur förutsätter tillräckligt med vävnad för att fylla sex ECM-baserade hydrogelkupoler. Om en annan densitet av krypter skördas bör kupolnumret ändras i enlighet därmed.- Tina 150 μL tillväxtfaktorreducerat (GFR) källarmembranextrakt (BME) (fenolrötfritt) över natten på isen vid 2–8 °C.
- Inkubera en 24-brunns, platt, vävnadsodlingsbehandlad polystyrenplatta i en inkubator vid 37 °C och 5%CO2 i minst 30 minuter före användning.
- Efter NHP-eutanasi och vävnadsinsamling, spola ileumsegmentet av skräp med en 1,000 μL pipettspets med iskall 1x PBS i en engångs petriskål.
OBS: Färsk vävnad måste skördas snabbt och hållas iskall för att skörda friska enteroider. - Skär ileum i längdriktningen längs hela tarmen och tvätta med iskall PBS 3x. Hacka vävnaden i små fragment (cirka 2 mm långa) med steril sax över ett 50 ml koniskt rör innehållande 15 ml iskall PBS, med början från den del av ilealsegmentet som ligger närmast röret.
- Använd en 10 ml serologisk pipett för att störa krypterna genom att pipettera upp och ner 5-10x. Låt vävnadssegmenten sätta sig i botten av röret, ta sedan bort supernatanten och ersätt den med färsk, iskall PBS. Upprepa denna process minst 7x-10x tills supernatanten är klar och fri från skräp.
- När du är klar, ta bort supernatanten och stäng av krypterna i 25 ml celldissociationsreagens. Placera röret på en gungplattform vid 20 rpm i 15 min vid rumstemperatur.
- Ta bort röret från vippan, låt cellerna sätta sig i cirka 30 s till 1 min och ta bort supernatanten. Tillsätt 10 ml iskall tvättbuffert. Pipettera upp och ner med en p1000-pipett för att ytterligare dissociera i enstaka krypter.
- Filtrera vävnaden genom en 70 μm cellsil till ett nytt 50 ml koniskt rör. Skölj det ursprungliga 50 ml koniska röret med 10 ml iskall tvättbuffert och filtrera genom 70 μm silen för att säkerställa att alla krypter har tagits bort från originalröret. Upprepa denna tvättning av vävnad för totalt 4x sköljningar.
- Centrifugera filtratet vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C och avlägsna supernatanten. Tillsätt 600 μl HOGMY och stör pelleten genom att pipettera upp och ner med en pipett på 200 μl. Placera röret på is tills lösningen blir iskall.
OBS: Om lösningen inte är iskall kommer kupolen inte att bibehålla rätt struktur när den är pläterad. Undvik att införa bubblor vid pipettering av ECM-baserade hydrogelkupoler, eftersom bubblor förhindrar korrekt fastsättning på plattans botten. - Tillsätt 600 μl iskall ECM-baserad hydrogel för att suspendera cellpelleten och blanda väl med en pipett på 200 μl.
- Ta bort 24-brunnsplattan från inkubatorn och placera den på en 37 °C plattvärmare. Pipettera 50 μL iskall HOGMY/ECM-baserad hydrogelblandning i mitten av 24 brunnar i en odlingsplatta med 24 brunnar (50 μL per kupol).
- När de är pläterade, låt kupolerna sitta på en 37 ° C-platta varmare i 1 min för att möjliggöra vidhäftning till botten av plattan. Vänd försiktigt plattan, se till att ingen kondens har ackumulerats på botten av plattan och placera den inverterade plattan i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter 15 min, vrid plattan åt höger och pipettera 750 μL rumstemperatur HOGMY i varje brunn.
OBS: Pipettmedia långsamt på brunnarnas sidovägg, var försiktig så att du inte stör den nybildade 3D ECM-baserade hydrogelkupolen. - När alla brunnar har fyllts med media, placera plattan i inkubatorn och byt media var 3: e dag med 750 μL HOGM. Passage enteroids var 7-10 dagar.
- Intestinal enteroid passaging
OBS: Följande protokoll är för en 24-brunns odlingsplatta som innehåller NHP-enteroider med en delad hastighet av 1: 2.- Ta bort enteroidmediet från varje brunn, var försiktig så att du inte stör ECM-kupolen som innehåller enteroider, tillsätt 500 μL iskall celldissociationsreagens till varje brunn med en 1 000 μL pipett och inkubera vid rumstemperatur i 1 min.
- Stör ECM manuellt genom att pipettera upp och ner 8-12x. Överför innehållet i 12 brunnar till ett 15 ml koniskt rör.
- När all lösning har samlats in från odlingsplattan med 24 brunnar, tillsätt 250 μL cellstörningsreagens till varje brunn för att säkerställa att alla NHP-enteroider har tagits bort från varje brunn och tillsätt denna sista sköljning till de befintliga 15 ml koniska rören.
- Placera på en gungplattform vid 40 rpm i 15 min vid rumstemperatur (20 °C). Alternativt kan du skaka rören manuellt i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Efter 15 minuter centrifugerar du vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten från 15 ml rören tills endast pelleten återstår.
- Tillsätt 8 ml iskall DMEM + bredspektrumantibiotika till ett 15 ml koniskt rör och se till att pelleten är tillräckligt störd. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Tillsätt 600 μL HOGMY och stör pelleten genom att pipettera upp och ner med en pipett på 1 000 μl. Placera röret på is tills lösningen blir iskall. När lösningen är iskall, tillsätt 600 μL iskall ECM för att suspendera cellpelleten och blanda väl med en pipett på 1 000 μl. Upprepa steg 1.3.2.-1.3.7. för de återstående 12 brunnarna.
- För de återstående stegen, se steg 1.2.11.-1.2.16.
2. Etablering av enteroid monolager och repsåranalys
- Förberedelse av media och behandling
- Kyl 5 ml PBS utan kalcium eller magnesium tills det är iskallt.
- Förbered DMEM-F12 tvättbuffert genom att tillsätta 1 ml bredspektrum antibiotika (100 μg / ml) till 500 ml DMEM / F12 (Dulbeccos modifierade örnmedium / näringsskinka blandning F12 + 15 mM HEPES-buffert). Håll iskallt.
- Förbered 100 ml HOGMY, enligt beskrivningen i steg 1.1.1, och värm den på bänkskivan till rumstemperatur.
- Varm 25 ml 0,25% Trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i ett 37 °C vattenbad.
- Bered 50 μg/ml, 100 μg/ml och 200 μg/ml koncentrationer av HA35 för cellbehandling med steril PBS utan kalcium eller magnesium som lösningsmedel. Den slutliga utspädningen av HA35 kommer att använda HOMGY som lösningsmedel.
ANMÄRKNING: HA35-preparat kan kräva flera utspädningar, eftersom HA35 ofta kommer ut ur lösningen i en koncentration större än 5 mg/ml.
- Enteroid monolayer bildning
OBS: Följande procedur ger volymer som är tillräckliga för generering av en 24-brunnsplatta av enteroidmonolager. Justera volymerna för önskat antal monolager.- Tina 96 μL ECM-baserad hydrogel BME (fenolrödfri) över natten på is vid 2-8 °C. Späd ECM-baserad hydrogel i iskall PBS utan kalcium eller magnesium i förhållandet 1:50. Täck varje brunn i en 24-brunns vävnadsodlingsplatta med 200 μL iskall utspädd ECM-baserad hydrogel.
- Inkubera den ECM-baserade hydrogelbelagda plattan i minst 1 timme vid 37 °C och 5 %CO2. Aspirera medier från odlingsplattan med 24 brunnar som innehåller de 3D-enteroider som är avsedda för monolager och ersätts med 500 μl celldissociationsreagens/brunn.
- Stör manuellt ECM-baserade hydrogelkupoler genom att pipettera upp och ner 8x-12x och överför innehållet i 12 brunnar till ett 15 ml koniskt rör.
- Tvätta de 12 tomma brunnarna med 250 μL celldissociationsreagens för att säkerställa att alla enteroider har tagits bort och överför innehållet till ett 15 ml koniskt rör. Upprepa steg 2.2.5. och steg 2.2.6. för de återstående 12 brunnarna med ett andra 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera de koniska rören vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten. Tillsätt 10 ml iskall DMEM-F12 tvättbuffert till 15 ml koniska rör och suspendera enteroidpelletsen genom att invertera rören. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelletsen i 12 ml 37 °C Trypsin-EDTA. Placera rören i ett 37 °C vattenbad i 10 minuter eller tills cellerna verkar lösliga. Tillsätt 3 ml DMEM-F12 tvättbuffert till varje rör för att späda ut Trypsin-EDTA, blanda genom att invertera rören och lägg på is.
- Filtrera de dissocierade enteroiderna genom en 37 μM nätcellsil och samla innehållet i rena 15 ml koniska rör. Centrifugera rören vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Medan cellerna pelleterar i centrifugen, ta bort den ECM-baserade hydrogelbelagda plattan från inkubatorn och aspirera eventuellt överskott av ECM-baserad hydrogellösning utan att repa den belagda ytan eller låta plattan torka helt.
- Ta bort supernatanten från de koniska rören och återsuspendera cellpelletsen med 6 ml HOMGY. Tillsätt 500 μl av den kombinerade 12 ml HOMGY-cellsuspensionen i varje brunn på 24-brunnsplattan belagd med ECM-baserad hydrogel med en sådddensitet på ungefär 3 x 105 celler/brunn. Virvla plattan med lock på för att säkerställa en jämn fördelning av celler i brunnarna.
- Inkubera plattan vid 37 °C och 5%CO2 och byt HOMGY-media var 2: e dag tills monolagren når > 90% sammanflöde.
- Monolagerbehandling och repsåranalys
- När monolagren når >90% sammanflöde, aspirera media för att ta bort eventuella celler som inte fäster. Behandla cellerna med 500 μl HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) eller PBS, upplöst i HOMGY, i 24 timmar.
- Efter 24 timmar, ta bort mediet, var försiktig så att du inte stör ytan på monolagret. Använd en pipettspets på 200 μL och gör en linjär repa över monoskiktets fulla ytdiameter i varje brunn, var försiktig så att du inte låter monolager torka.
- Tvätta de repade monolagren 1x med 500 μL 1x PBS. Tillsätt 500 μl HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) eller PBS upplöst i HOMGY och överför plattan till analysinstrumentet för levande celler (materialtabell) inom en 37 °C och 5 %CO2-inkubator .
- Under ikonen Schema i programvaran för livecellanalys (Materialförteckning) klickar du på ikonen Starta lägg till nytt fartyg och ställer in skanningsfrekvensen för att skanna enligt ett schema. Skapa ett nytt Whole Well-fartyg under Scan Type, ange skanningsinställningarna (dvs. Fas för bildkanaler och 4x för mål) och klicka på Nästa.
- Välj skylttillverkare och katalognummer från den medföljande listan. Under ikonen Schema väljer du plussymbolen där plattan ska placeras i analysinstrumentet för levande celler. Välj önskat skanningsmönster och skapa sedan en plattkarta genom att välja "+" på sidan Plattlayout. Välj Skjut upp analys till senare och ange sedan genomsökningsschemat för var 4:e timme i 24 timmar och verifiera förvärvsinställningarna under sidan Sammanfattning av fartygsguiden. Välj slutligen Lägg till i schema.
- När 24-analysen är klar dubbelklickar du på Fartygsnamn under ikonen Visa och exporterar bilder och filmer. Välj brunnar och en serie bilder som ska visas och exporteras som JPEG. Analysera bilder för procent sårläkning med hjälp av plugin-programmet Wound Healing Size för ImageJ21, enligt steg 2.4. under.
- Analys av repsår
- Öppna ImageJ-programvaran. Ladda upp repsåranalysbilderna (. TIFF eller .JPG).
- Välj Bild > Skriv > 8-bitars för att ändra bilden från 24-bitars RGB till 8-bitars. Installera plugin-programmet Wound Healing Size genom att välja Plugins > Macros > Install > Wound Healing Size Plugin.
- Rotera bilden så att repan är vertikal och initiera plugin-programmet Wound Healing Size Tool.
- Välj plugin-parametrarna i dialogrutan för att bäst passa repsåret. Ange värdet för parametrarna för storleksalternativen för sårläkning enligt följande: Variansfönsterradie till 20, Tröskelvärde till 100 och Procentandel mättade pixlar till 0,001 och välj Ja för Ange skala globalt. Slutför valet genom att klicka på OK-knappen . Kontrollera om det valda området är sårområdet. Ovanstående parametrar kan kräva standardisering från labb till labb.
- Upprepa steg 2.4.2–2.4.4. för de återstående tidpunkterna för varje repa.
- Beräkna procentandelen sårläkning i repområdet för migrerande eller prolifererande celler över 24 timmar enligt följande:
% sårläkning =
där T 0 = % Area vid tiden 0 h och Tc = % Area vid 0 h, 4 h, 12 h eller 24 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekterna av HA på vävnadsreparation och sårläkning i olika vävnader och organ är väldokumenterade; De specifika effekterna av HA med en molekylvikt på 35 kDa på foster- eller neonatal tunntarmsläkning och regenerering är dock för närvarande okända. För att testa förmågan hos HA35 att främja sårläkning i en modell av fostrets eller neonatala tunntarmen genererade vi 3D-intestinala enteroider från NHP-ilealvävnad och dissocierade denna vävnad ytterligare i enskilda celler för att skapa 2D-enteroid-härledda monolager (Figur 1A, B). Monolagren odlades till sammanflöde och repades manuellt med en P200-pipettspets (figur 1B,C). Monolager behandlades sedan med HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) eller kontroll (PBS). Cellmigration och proliferation in i gapet avbildades var 4: e timme i totalt 24 timmar med hjälp av ett överfört ljusmikroskop utrustat för levande cellavbildning22. Hastigheten för sårförslutning, ett mått på hastigheten på cellmigration, kvantifierades med ImageJ som procent sårläkning med hjälp av Wound Healing Size Plugin21 (figur 2). Repområdet och hastigheten för cellmigration och procentandelen sårförslutning mättes över 24 timmar (steg 2.4.6.). Som visas i figur 3 resulterade exponering för HA35 i en dos- och tidsberoende stimulering av cellmigration/cellspridning, vilket ledde till snabbare sårförslutning. HA35 vid 100 μg/ml och 200 μg/ml ökade signifikant läkningen med ~1,5-2,5-faldigt i förhållande till kontroll vid både 4 h och 12 h (*p < 0,05).
Figur 1. Enteroid generation och enteroid-härledd monolayer sårläkningsanalysprocedur. (A) Odling av tredimensionella icke-mänskliga primatintestinala enteroider som används för att dissociera i (B) tvådimensionella monolager. (C) Monolager odlades till >90% sammanflöde i en 24-brunnsplatta och behandlades sedan med hyaluronsyra 35 kDa eller fosfatbuffrad saltlösning i 24 timmar. Monolayers repades sedan med en P200-pipettspets. Skalstreck = 800 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Sårläkningsanalysbilder och analys. Representativa bilder av hyaluronsyra 35 kDa (100 μg/ml, 200 μg/ml) och kontrollbehandlingar av icke-mänskliga primatenteroidmonolager. Bilder erhölls vid 0 h, 4 h, 12 h, 16 h och 24 h efter att ha utfört en repa med en P200-pipettspets. Bilderna togs med 4x förstoring med live-cellanalysinstrumentet och analyserades i ImageJ med hjälp av Wound Healing Size Plugin. Procent sårläkning beräknades från migrerande/prolifererande celler över 24 timmar. Skalstreck = 800 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Effekt av hyaluronsyra 35 kDa (HA35) på sårläkning i enteroidmonolager. Förändring i sårläkning över tid i enteroidmonolager, beroende på HA35-behandlingskoncentration. HA35 ökade signifikant sårläkning efter 4 h och 12 h vid 100 μg/ml och 200 μg/ml jämfört med kontroll, men läkningsgraden konvergerade mellan behandlingarna med 24 timmar. Signifikansen bedömdes med hjälp av Students t-test vid *p < 0,05, presenterat som medelvärde ± medelfel (SEM) (n = 6 brunnar per behandling). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mag-tarmkanalen hos ett för tidigt barn är under kontinuerligt regenerativt tryck från upprepade exponeringar för miljöförolämpningar i samband med dysbios, inflammatoriska bakteriemetaboliter och toxiner och intermittent hypoxi23,24. Tyvärr kan tarmepitelet hos det för tidigt födda barnet inte snabbt fastställa funktionell integritet23, vilket resulterar i barriärdysfunktion, ökad tarmpermeabilitet och i allvarliga fall skenande tarminflammation och NEC-utveckling.
Glykosaminoglykaner (GAG) är en klass av polysackarider som förekommer i bröstmjölk, vilka är potentiella bioaktiva faktorer som skyddar mot utveckling av NEC15,16. HA är en linjär polymer av upprepande disackarider av glukuronsyra och N-acetylglukosamin25,26 framställd av hyaluronansyntaser. HA kan ha antingen pro- eller antiinflammatoriska egenskaper beroende på storlek och vävnadsmiljö27,28. I tarmen och tjocktarmen finns endogen HA i det extracellulära utrymmet intill kryptepitelceller och driver epitelproliferation och normal tarmtillväxt 29,30,31. HA är också en naturlig komponent i HM och produceras vid de högsta koncentrationerna under de första veckorna av laktation30. I synnerhet skyddar HA renad från HM eller kommersiellt tillgänglig HA med molekylvikt ~ 35 kDa (HA 35) mot bakterieinducerad kolit genom att öka uttrycket av det antimikrobiella β-defensinet och TJ-proteinet ZO-1 i kolonepitelet in vivo och vitro25,27. Det är viktigt att notera att bland alla specifika HA (4,7 kDa, 16 kDa, 28 kDa, 74 kDa) är HA35 den mest potenta induceraren av TJ-proteiner och antimikrobiellt peptiduttryck i kolonepitelet in vitro. Dessutom utövar stor MW HA (~ 2,000 kDa) ingen effekt på TJ-proteinuttryck, vilket indikerar att dessa effekter är storleksspecifika32. Vi visade också att oral administrering av HA35 påskyndar mognad i tunntarmen, främjar epitelproliferation och differentiering och skyddar mot utvecklingen av NEC16. Här testas förmågan hos HA35 att främja sårläkning med hjälp av en in vitro repsårläkningsanalys. Med hjälp av de modeller som beskrivs ovan fann man att HA35 accelererar sårförslutning på ett koncentrationsberoende sätt vid 4 h och 12 h efter repor jämfört med kontroll, vilket klargör en kritisk kunskapslucka om effekterna av specifikt storlek HA på intestinal sårläkning och vävnadsreparation och därmed bekräftar en fördelaktig roll för HA35 vid neonatal intestinal sårläkning. Även om mekanismen genom vilken HA35 utövar denna effekt är okänd, visade författarnas tidigare data hos musungar att det mekanistiska målet för rapamycin (mTOR) komplex 1 (mTORC1) -vägen uppreglerades i ileala vävnader efter HA35-behandling16. Ytterligare studier behövs för att bestämma bidraget från denna väg till dessa observerade effekter.
Flera in vitro-modeller har använts för att undersöka interventioner som främjar tarmregenerering, läkning och reparation. Den mest använda in vitro-analysen för tarmsår och efterföljande reparation är repsåranalysen, som oftast utförs i kolorektal cancer (CRC) cellmonolager33,34. Den fysiologiska relevansen av en sådan modell för den prematura spädbarnstarmen är dock begränsad, eftersom sårreparation av CRC-celler förlitar sig så starkt på cancercellernas mycket proliferativa natur snarare än stamcellsdrivna reparationsprocesser18. Den senaste förmågan att isolera och upprätthålla enteroider härledda från krypter av tarmepitel ger möjlighet att utforska ett mer fysiologiskt relevant tarmsvar på en mängd immun- eller skadliga stimuli, liksom möjliga terapeutiska ingrepp35. Enteroider innehåller alla differentierade epitelcelltyper som finns i tarmsegmentet från vilket de härrör, vilket fungerar som en effektiv modell för att studera tarmbarriärskador och reparera36,37,38.
Här beskrivs upprättandet och underhållet av en in vitro-enteroidmodell av tarmepitelskada och reparation med ileum från prematur NHP. Denna modell möjliggör undersökning av mekanistiska vägar och terapeutiska ingrepp som är involverade i epitelläkning och regenerering. Ett kritiskt steg i detta protokoll är skapandet av ett väldefinierat gap med liknande bredd, vilket minimerar variationen från källa till brunn. Dessutom, när du repar monolagren, bör pipettspetsen upprätthålla konstant kontakt med botten av brunnen för att rent avlägsna cellskiktet. Överdriven tryck bör undvikas för att förhindra "lyft" av sårets kanter. På samma sätt bör PBS-tvättsteget efter sårning utföras försiktigt med hjälp av brunnens sidovägg för att undvika skador på det återstående monolagret eller ytterligare utvidgning av sårgapet. Slutligen måste man undvika att hålla plattan under 37 ° C under längre perioder för att säkerställa att ECM-beläggningen på plattan förblir gelliknande och monolagret inte störs på grund av ECM-viskositetsförändringar.
Även om denna modell har tydliga fördelar jämfört med traditionell cellodling, är den tekniskt mer krävande, dyr och tidskrävande jämfört med den traditionella sårläkningsanalysen i CRC-monolager. Dessutom är konsistens i de reagenser och medier som används avgörande för att säkerställa överlevnad och korrekt underhåll av dessa kulturer, liksom att hålla cellerna, reagenserna och ECM vid rätt temperaturer. Slutligen är primära tunntarmsmonolager notoriskt kortlivade, så såranalysen som beskrivs här bör utföras strax efter att monolagerkonfluens har uppnåtts.
Sammantaget tyder dessa resultat på att enteroidmonolager i tunntarmen kan användas som en ny modell för att undersöka intestinal epitelregenerering genom processerna för cellmigration och proliferation efter sår. Dessutom ger enteroider en mycket mer fysiologiskt översättbar vävnad för att studera effekter på differentierad tarmcellsviabilitet. Sådana modeller kan utgöra en plattform för att dissekera de mekanismer som reglerar epitelreparation och hjälpa till att identifiera nya terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja och inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. HC stöds av bidrag P20GM134973 från National Institutes of Health. KB stöds av ett bidrag från Children's Hospital Foundation (CHF) och Presbyterian Health Foundation (PHF). Live-cell imaging tjänster som tillhandahålls av Cancer Functional Genomics-kärnan stöddes delvis av National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 och National Cancer Institute Grant P30CA225520 från National Institutes of Health, tilldelad University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
- Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
- He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
- Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
- Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
- vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
- Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
- Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
- Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
- Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
- Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
- Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
- Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
- Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
- Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
- Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
- Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
- de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
- Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
- Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
- Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
- Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
- Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
- Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
- Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
- Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
- Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
- Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).
