एंटरॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर का उपयोग करके अपरिपक्व छोटी आंतों की चोट और उपचार के इन विट्रो मॉडल पर हायलूरोनिक एसिड 35 केडीए का प्रभाव
Summary
यह प्रोटोकॉल गैर-मानव प्राइमेट इलियम से अलग तीन-आयामी (3 डी) एंटरोइड्स से प्राप्त दो-आयामी (2 डी) मोनोलेयर पर खरोंच घाव परख स्थापित करने और करने की एक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
इन विट्रो स्क्रैच घाव परख का उपयोग आमतौर पर विभिन्न प्रकार के ऊतक प्रकारों में उपकला उपचार के तंत्र और विशेषताओं की जांच के लिए किया जाता है। यहां, हम टर्मिनल इलियम के आंतों के क्रिप्ट से प्राप्त तीन-आयामी (3 डी) गैर-मानव प्राइमेट एंटरोइड्स से दो-आयामी (2 डी) मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इन एंटरॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर का उपयोग तब उपकला घाव किनारे के साथ सेल माइग्रेशन और प्रसार को बढ़ावा देने के लिए मानव दूध एचए मिमिक, हायलूरोनन 35 केडीए (एचए 35) की क्षमता का परीक्षण करने के लिए एक इन विट्रो स्क्रैच घाव परख में किया गया था। मोनोलेयर को कंफ्लुएंसी में विकसित करने के बाद, उन्हें मैन्युअल रूप से खरोंच दिया गया और एचए 35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) या नियंत्रण (PBS) के साथ इलाज किया गया। लाइव-सेल इमेजिंग के लिए सुसज्जित संचारित-प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अंतर में सेल माइग्रेशन और प्रसार को चित्रित किया गया था। इमेजजे में घाव भरने के आकार प्लगइन का उपयोग करके घाव बंद करने को प्रतिशत घाव भरने के रूप में निर्धारित किया गया था। खरोंच क्षेत्र और सेल माइग्रेशन की दर और घाव बंद होने का प्रतिशत 24 घंटे से अधिक मापा गया था। एचए 35 इन विट्रो छोटे आंतों के एंटरोइड मोनोलेयर में घाव भरने में तेजी लाता है, संभवतः घाव के किनारे पर सेल प्रसार और घाव क्षेत्र में प्रवास के संयोजन के माध्यम से। इन विधियों को संभावित रूप से अपरिपक्व मानव छोटी आंत में आंतों के पुनर्जनन का पता लगाने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) अपरिपक्व शिशुओं में सबसे आम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल आपात स्थितियोंमें से एक है। रोग को गंभीर आंतों की सूजन की विशेषता है जो आंतों के परिगलन, सेप्सिस और संभावित मृत्यु के लिए तेजी से बिगड़ सकती है। यद्यपि एटियलजि स्पष्ट नहीं है, सबूत बताते हैं कि एनईसी बहुक्रियाशील है और भोजन, असामान्य जीवाणु उपनिवेशीकरण और अपरिपक्व आंतों के उपकला 2,3 की जटिल बातचीत का परिणाम है। अपरिपक्व शिशुओं ने आंतों की पारगम्यता, असामान्य जीवाणु उपनिवेशीकरण, और कम एंटरोसाइट पुनर्योजी क्षमता 4,5 में वृद्धि की है, जिससे आंतों की बाधा शिथिलता, जीवाणु स्थानांतरण और एनईसी विकास के लिए उनका जोखिम बढ़ गया है। इसलिए, आंतों के उपकला परिपक्वता में तेजी लाने और आंतों के उपकला के उत्थान या उपचार को बढ़ावा देने के लिए रणनीतियों या हस्तक्षेपों की पहचान करना इस घातक बीमारी को रोकने में महत्वपूर्ण है।
अध्ययनों से पता चला है कि मानव दूध (एचएम) अपरिपक्व शिशुओं 6,7,8,9,10,11 में एनईसी के खिलाफ सुरक्षात्मक है। मानव और पशु दोनों अध्ययनों से पता चला है कि गोजातीय-आधारित सूत्र आंतों की पारगम्यता को बढ़ाता है और आंतों के उपकला कोशिकाओं 2,12 के लिए सीधे विषाक्त है। हालांकि पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है, सबूत बताते हैं कि एचएम के सुरक्षात्मक प्रभावों को बायोएक्टिव घटकों जैसे लैक्टोफेरिन, इम्युनोग्लोबुलिन ए (आईजीए), और एचएम ऑलिगोसैकराइड्स13 के माध्यम से मध्यस्थ किया जाता है। एचएम हायलूरोनन (एचए) में भी समृद्ध है, जो डी-ग्लूकोरोनिक एसिड और एन-एसिटाइल-डी-ग्लूकोसामाइन डिसैकराइड14,15 को दोहराने के साथ एक विशिष्ट गैर-सल्फेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन है। महत्वपूर्ण रूप से, हमने दिखाया है कि मौखिक 35 केडीए एचए (एचए 35), एक एचएम एचए मिमिक, आंतों की चोट की गंभीरता को कम करता है, जीवाणु स्थानांतरण को रोकता है, और मुराइन एनईसी जैसी आंतों की चोट मॉडल16,17 में मृत्यु दर को कम करता है।
यहां, इन विट्रो में आंतों के उपचार और पुनर्जनन पर एचए 35 के प्रभावों की आगे जांच की जाती है। वर्तमान में, आंतों के घाव और मरम्मत के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला इन विट्रो परख कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) सेल मोनोलेयर में किया गया एक खरोंच घाव परख है। प्रीटरम शिशु आंत के लिए इस तरह के मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता सीमित है, क्योंकि सीआरसी कोशिकाओं की घाव की मरम्मत स्टेम सेल-संचालित मरम्मत प्रक्रियाओं के बजाय कैंसर कोशिकाओं की अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव प्रकृति पर बहुत अधिक निर्भर करतीहै। इस सीमा को दूर करने के लिए, एक 2 डी एंटरॉइड स्क्रैच घाव मॉडल की स्थापना, जिसमें प्रीटरम गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी) से प्राथमिक स्टेम सेल-व्युत्पन्न छोटे आंतों के एंटरोइड्स को अलग करने और बनाए रखने की प्रक्रिया शामिल है, यहां वर्णित है। यह देखते हुए कि प्रीटरम एनईसी को अक्सर डिस्टल छोटी आंत में रिपोर्ट किया जाता है, आंतों की क्षति और मरम्मत के मॉडल में प्राथमिक उपकला कोशिका ऑर्गेनोइड्स का उपयोग पारंपरिक कोलोरेक्टल मोनोलेयर18,19 का उपयोग करने वाले मौजूदा मॉडल की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से ट्रांसलेटेबल इन विट्रो मॉडल प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक अपरिपक्व शिशु का जठरांत्र संबंधी मार्ग डिस्बिओसिस, भड़काऊ जीवाणु मेटाबोलाइट्स और विषाक्त पदार्थों और आंतरायिक हाइपोक्सिया23,24 से जुड़े पर्यावरणीय अपमान के बार-बार जोखिम से लगातार पु?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। उच्च न्यायालय को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से अनुदान पी 20 जीएम 134973 द्वारा समर्थित किया गया है। केबी को बच्चों के अस्पताल फाउंडेशन (सीएचएफ) और प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन (पीएचएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। कैंसर फंक्शनल जीनोमिक्स कोर द्वारा प्रदान की गई लाइव-सेल इमेजिंग सेवाओं को आंशिक रूप से नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज ग्रांट पी 20जीएम 103639 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट ग्रांट पी 30सीए 225520 द्वारा समर्थित किया गया था, जो ओक्लाहोमा स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र स्टीफेंसन कैंसर सेंटर विश्वविद्यालय को सम्मानित किया गया था।
Materials
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
- Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
- He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
- Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
- Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
- vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
- Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
- Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
- Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
- Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
- Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
- Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
- Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
- Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
- Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
- Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn’s disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
- Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
- de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
- Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
- Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
- Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
- Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
- Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
- Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
- Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
- Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
- Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
- Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).
