Summary
In dit protocol werd nieuwe varkensaderbypass-enting uitgevoerd via een kleine incisie in de linkerborstwand zonder cardiopulmonale bypass. Er werd een postoperatief pathologisch onderzoek gedaan, dat intimale verdikking aantoonde.
Abstract
Veneuze transplantaatziekte (VGD) is de belangrijkste oorzaak van coronaire bypass-transplantaat (CABG) -falen. Grote diermodellen van CABG-VGD zijn nodig voor het onderzoek naar ziektemechanismen en de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
Om de operatie uit te voeren, gaan we de hartkamer binnen via de derde intercostale ruimte en ontleden we zorgvuldig de interne borstader en dompelen deze onder in een normale zoutoplossing. De rechter hoofdkransslagader wordt dan behandeld voor ischemie. Het doelvat wordt ingesneden, een shuntplug wordt geplaatst en het distale uiteinde van de transplantaatader wordt geanastomoseerd. De opgaande aorta is gedeeltelijk geblokkeerd en het proximale uiteinde van de transplantaatader wordt na perforatie geanastomoseerd. De transplantaatader wordt gecontroleerd op doorgankelijkheid en de proximale rechter kransslagader wordt geligeerd.
CABG-chirurgie wordt uitgevoerd in minivarkens om de linker interne borstader te oogsten voor gebruik als vasculaire transplantaat. Serum biochemische tests worden gebruikt om de fysiologische status van de dieren na de operatie te evalueren. Echografisch onderzoek toont aan dat het proximale, middelste en distale uiteinde van het transplantaatvat onbelemmerd zijn. In het chirurgische model wordt turbulente bloedstroom in het transplantaat waargenomen bij histologisch onderzoek na de CABG-operatie en wordt veneuze transplantaatstenose geassocieerd met intimale hyperplasie waargenomen in het transplantaat. De studie hier biedt gedetailleerde chirurgische procedures voor het opzetten van een herhaalbaar CABG-geïnduceerd VGD-model.
Introduction
Hoewel de sterfte aan coronaire hartziekten de afgelopen jaren aanzienlijk is afgenomen, ontwikkelt de helft van de volwassenen van middelbare leeftijd in de Verenigde Staten elk jaar ischemische hartgerelateerde symptomen en sterft een derde van de oudere volwassenen aan coronaire hartziekten1. Coronaire bypass-transplantatie (CABG) is een effectieve chirurgische modaliteit om myocardiale ischemie te verbeteren, en wat nog belangrijker is, het is een onvervangbare chirurgische modaliteit voor de behandeling van multivessel coronaire hartziekte2. Na verloop van tijd ontwikkelen vasculaire grafts echter ontsteking, intimale hyperplasie en progressieve atherosclerose, waarvan bekend is dat het leidt tot adertransplantaatfalen of adertransplantaatziekte (VGD)3. Bij patiënten na CABG, als restenose optreedt, kan in sommige gevallen alleen het zieke bloedvat worden vervangen2. Oudere patiënten en toegevoegde comorbiditeiten maken het opnieuw uitvoeren van coronaire bypass-transplantatie behoorlijk uitdagend. Het uitstellen of beheersen van de pathologische problemen in verband met getransplanteerde bloedvaten is een dringend probleem dat moet worden opgelost. Grote diermodellen van CABG-VGD zijn nodig voor het onderzoek naar ziektemechanismen en de ontwikkeling van therapeutische strategieën. Onderzoekers hebben met succes VGD-modellen voor dieren vastgesteld bij kleine en grote dieren zoals muizen4, ratten5, konijnen6 en varkens7. In vergelijking met kleine dieren hebben grote dieren zoals varkens anatomische structuren en fysiologische kenmerken die vergelijkbaar zijn met die van mensen en een langere levensduurhebben 8,9. Grote dieren zijn dus meer geschikt voor het onderzoeken van pathologische veranderingen op lange termijn bij veneuze transplantaatziekte en voor preklinisch testen van geneesmiddelen of apparaten. Wij en ons samenwerkende team hebben met succes chirurgische technieken toegepast om een varkenshartfalenmodel op te stellen en de cardiale pathologische veranderingen in dit model10 beschreven.
CABG-chirurgie is gestandaardiseerd in de klinische praktijk, maar wanneer het wordt toegepast op de oprichting van VGD-diermodellen, zijn de verschillen tussen soorten, de verwerving van dierapparatuur en -faciliteiten, dierchirurgische operaties en diervoeding en -verpleging enorme uitdagingen voor onderzoekers. Net als in de klinische praktijk omvatten de benaderingen voor CABG-chirurgie die worden gebruikt om VGD-diermodellen vast te stellen middellijnsternotomie11 en linker laterale thoracotomie12. Midline sternotomie wordt vaker gebruikt13,14. Deze aanpak heeft echter hoge risico's voor zowel mens als dier. In de studie gerapporteerd door Thankam et al., stierven twee van de zes varkens die werden gebruikt voor modellering tijdens operatie15. Hoge modelsterfte verhoogt de studiekosten en beïnvloedt de nauwkeurigheid van de resultaten. Een studie toonde eerder aan dat een incisie van de linkerborstwand haalbaar was om CABG-geïnduceerde VGD bij varkens vast te stellen11. Hier wil deze studie een stapsgewijs protocol beschrijven om een reproduceerbare operatie voor een CABG-geïnduceerd VGD-model in minivarkens vast te stellen en het fenotype van dit model te evalueren. Het experimentele protocol is gezamenlijk ontworpen door de hartchirurgie- en anesthesieteams. De chirurgische benadering voor de linker derde intercostale ruimte werd bepaald volgens de kadavers van andere minivarkens in het laboratorium vóór de operatie, en de anesthesiemethode werd uitgevoerd volgens de methode die werd gebruikt in het centrum16. Bloedbiochemische tests, ultrasoon onderzoek en histologisch onderzoek werden uitgevoerd om diermodellen te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedures voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Ed., 2011, National Research Council, USA). De chirurgische ingreep is weergegeven in figuur 1.
1. Preoperatieve bereiding van dieren
- Verdeel willekeurig 10 mannelijke minivarkens van 3 maanden oud met een gewicht van 30-35 kg in de schijngroep (n = 5) en VGD-groep (n = 5).
- Evalueer de preoperatieve en postoperatieve gezondheidstoestand van de varkens met behulp van de body mass index (BMI). Bereken de BMI als volgt:
BMI = lichaamsgewicht (kg)/(lichaamslengte [cm] × lichaamslengte [cm])
OPMERKING: De lichaamslengte wordt gemeten vanaf de neus van het varken tot de basis van de staart. - Vast de dieren gedurende 12 uur voor de operatie om aspiratie na anesthesie te voorkomen. Bereid anesthesieapparatuur en chirurgische instrumenten voor, waaronder een anesthesieapparaat, gas, anesthetica, een anesthesiepijplijn, een speciale laryngoscoop en chirurgische instrumenten, een ribretainer, hechtingen, een schildklierretractor, chirurgische tang, enz. Steriliseer alle instrumenten die in de operatie moeten worden gebruikt.
2. De dieren voorbereiden op een operatie
- Weeg de dieren en bereken de verdovingsdosis. Dien intramusculair het verdovingsmengsel toe, bestaande uit 2 mg/kg 1:1 Tiletamine en Zolazepam, 0,2 mg/kg diazepam en 0,02 mg/kg atropine17. Gebruik fentanyl (50 mg/kg) voor intraoperatieve pijnverlichting30.
- Zorg ervoor dat een goed verdovingsvlak wordt bereikt en breng een inwonende veneuze katheter (20G) in de marginale oorader in om toegang tot het oor te krijgen. Breng het varken over op de operatietafel en plaats het in rugligging. Immobiliseer de ledematen met verbanden en til het hoofd op met een steriel gordijn.
OPMERKING: De toestand van anesthesie werd gecontroleerd door centrale fixatie van de oogbol, miose, verlies van pupilreflex en verlies van pijnreflex. De hartslag en bloeddruk werden op een lager niveau gehouden dan de uitgangswaarde. De chirurg moet HR, BP en andere parameters onder verlamming controleren en de anesthesiedosis verhogen als HR > 20% boven de uitgangswaarde toeneemt. - Stel de epiglottis en glottis bloot met behulp van een veterinaire laryngoscoop. Voer tracheale intubatie uit met een 7.0-7.5Fr-buis en sluit deze aan op het anesthesieademhalingscircuit.
OPMERKING: De ventilator wordt gebruikt voor continue positieve drukventilatie met getijdenvolume 280 ml, inspiratoire / expiratoire verhouding 1: 2, ademhalingsfrequentie 20 keer / min en positieve eind-expiratoire druk (5 cm H2O). - Injecteer vecuroniumbromide (0,1 mg/kg) intraveneus om de spieren te ontspannen tijdens de chirurgische ingrepen en gebruik 2% isofluraan om de anesthesie te handhaven met een ademhalingssnelheid van 16-20 bpm en een getijdenvolume van 10 ml/kg.
OPMERKING: Vecuronium wordt gegeven om te zorgen voor voldoende diepte van anesthesie bij verlamde dieren, vooral omdat de dosis inductiegeneesmiddel en isofluraan aan de onderkant van de aanbevolen waarde ligt. - Gebruik veterinaire zalf op de ogen van het varken om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent. Gebruik elektrische dekens om de lichaamstemperatuur van het varken op 38 °C ± 5 °C te houden.
- Gebruik een elektrocardiogram om de hartslag, het zuurstofgehalte in het bloed en de lichaamstemperatuur te controleren.
3. Chirurgische ingrepen
- Scheer de linkerborstwand en breng drie afwisselende rondes van 0,7% jodium en 75% alcohol aan om het operatiegebied aseptisch voor te bereiden tot aan de linker onderkaakhoek, tot aan de navelstreng, links tot de achterste oksellijn en rechts tot aan de okselvoorkant. Plaats een steriel chirurgisch gordijn rond het operatiegebied.
- Maak een transversale incisie van 7-10 cm met een elektrisch mes in de derde linker intercostale ruimte en scheid de onderhuidse weefsels laag voor laag (figuur 2A). Verwijder een segment van 5-6 cm van de derde rib met een botschaar en leg de interne borstader bloot door een retractor na het blootleggen van het derde rib-sternale gewricht (figuur 2B).
- Lokaliseer de interne borstader samen met de linker interne borstslagader aan de linkerkant van het borstbeen. Voer een stompe dissectie van de interne borstader uit met een vasculaire tang.
- Voer hemostase uit door elektrocoagulatie van de takken van de linker interne borstader met een elektrisch mes. Als de hemostase onvolledig is, gebruik dan katoendraadligatie voor hemostase. Ligate en markeer de twee uiteinden van de ader terwijl deze wordt geoogst (figuur 2C).
- Bereid heparine normale zoutoplossing door 2 ml heparinenatriumoplossing en 98 ml normale zoutoplossing toe te voegen. Injecteer na het verwijderen van de ader heparine normale zoutoplossing in de ader voor voorbehandeling (figuur 2D). Plaats vervolgens de ader in een normale zoutoplossing en bewaar deze voor back-up.
- Maak een soortgelijke incisie als hierboven beschreven en verwijder de interne borstader in de schijngroep. Open het hartzakje en sluit vervolgens de borstwand in de schijngroep. Gebruik de interne borstader van de schijngroep voor pathologische controle zonder coronaire bypass-enting.
- Maak een incisie van ~ 7 cm met een elektrisch mes op het hartzakje om de rechter kransslagaderstam bloot te leggen. Suspending het hartzakje en naai op de huid aan de ipsilaterale zijde met de 1-0 chirurgische hechtingen (figuur 2E). Scheid de rechter kransslagaderstam van de omliggende weefsels (figuur 2E).
- Omzeil de blokkerende band onder het proximale uiteinde van de geïsoleerde rechter kransslagader nabij de aorta met een draadhaak en behandel het myocard met drie cycli van 2 min ischemie en 5 min reperfusie door de blokkerende band aan te spannen en te ontspannen (figuur 2F). Controleer de elektrische activiteit van het hart met de elektrocardiogrammonitor tijdens de ischemie/reperfusievoorconditionering (figuur 2G).
OPMERKING: Wanneer de rechter kransslagader is geblokkeerd, toont het elektrocardiogram een verhoogde hartslag en ST-segmentverhoging. - Span de band aan om de juiste coronaire bloedstroom te blokkeren. Snijd het epicardium dat de bloedvaten bedekt. Leg de kransslagaderwand bloot en snijd in de lengterichting met de punt van een chirurgisch mes tegen het midden van de voorste wand van de bloedvaten.
- Na het knippen van het lumen, vergroot u de incisie met een schaar en plaatst u een coronaire shunt. Breng het ene uiteinde van de shunt met een spoel in de distale kransslagader door de scheur. Shunt het bloed in de kransslagaders in de holle coronaire shunt om een duidelijk operatief veld te garanderen (figuur 2H).
- Voer een end-to-side continue hechting uit tussen de interne borstader en de rechter coronaire romp met de 7-0 polypropyleenhechting (figuur 2I). Sluit in het midden van de opgaande aorta de linker anterolaterale wand van de opgaande aorta af met een semi-occlusieklem.
- Gebruik een chirurgisch mes om een kleine incisie te maken in de aortawand waar de adventitia is gesneden, steek het hoofdeinde van de glijdende schacht aan het kopeinde van de pons door deze incisie in de aortaholte, trek de glijdende schacht naar buiten samen en het cirkelvormige mes erboven snijdt een stuk van de arteriële wand af. Het door de pons uitgesneden weefselblok heeft een diameter van ongeveer 3 mm (figuur 2J).
- Trek de shunt eruit. Voer een end-to-side continue hechting uit tussen de interne borstader en de aortawand met de 6-0 polypropyleenhechting (figuur 2K). Open de semi-occlusieklem.
- Registreer de bypassstroom van de rechter kransslagader trunk proximaal naar de anastomoseplaats met behulp van echografie. Controleer de elektrische activiteit van het hart met behulp van het elektrocardiogram (figuur 2L).
- Plaats een tijdelijke drainagebuis (Fr: 16) in de borstholte om het bloed en de vloeistoffen te laten wegvloeien. Naai de pericardiumincisie met een draad van 1-0 katoen en sluit de borstkas laag voor laag (van binnen naar buiten: Pleuralaag, spierlaag, onderhuidse weefsellaag, huidlaag) terwijl penicilline (ongeveer 0,5 g) poeder op elke laag wordt geplaatst. Verwijder de drainagebuis na het naaien van de huidincisie met een 1-0 katoenen draad.
4. Postoperatieve zorg
- Verwijder de endotracheale buis nadat de dieren weer spontaan hebben geademd. De anesthesist moet de vitale functies van het dier beoordelen (bijv. Ademhalingsfrequentie, hartslag, zuurstofverzadiging, enz.) en het ECG verwijderen nadat de dieren wakker worden en terugkeren naar spontane activiteit. Stuur de dieren terug naar de voederruimte en plaats de schijndieren in een ander hok in de fokruimte. Houd de dieren warm met een elektrische deken. Observeer de dieren elk uur na de operatie (minstens 4 keer).
- Voer het dier de dag na de operatie. Voeg aspirine (200 mg) 2x daags gedurende 7 dagen toe aan het diervoeder om postoperatieve trombose te voorkomen en wondpijn te verminderen.
OPMERKING: Vermijd het voeren van dieren op de dag van de operatie om aspiratie te voorkomen. - Dien het dier 1x daags gedurende 7 opeenvolgende dagen een intramusculaire injectie met penicilline toe om postoperatieve infectie (14.000 eenheden per kg) te voorkomen.
5. Ultrasoon onderzoek
- Gebruik na de CABG-operatie een steriele ultrasone sondehuls om de hoogfrequente lineaire array-sonde te wikkelen. Plaats de sonde op het oppervlak van het veneuze transplantaat.
- Geef de omtrek van het transplantaat weer in de tweedimensionale ultrasone modus en schakel vervolgens over naar de kleuren-Doppler-modus om de bloedstroom in het transplantaat te detecteren.
6. Verzameling van veneuze transplantaatweefsels
- Verzamel 10 ml bloedmonster uit het veneuze circuit van de oorader voor biochemisch onderzoek. (tabel 1). Centrifugeer het bloedmonster op 1.000 x g gedurende 5 minuten en voer biochemische tests uit met een automatische biochemische analysator.
- Verdoof het dier zoals eerder beschreven. Na bevestiging van de anesthesiediepte, injecteer 10% kaliumchloride 0,5 ml / kg lichaamsgewicht uit de marginale ader van het oor of de voorpootader. Maak vervolgens een mediane sternale incisie van 10 cm met een elektrisch mes om het adertransplantaat 30 dagen na de operatie te oogsten. Bevestig de lichaamspositie zoals in stap 2.2., en maak na sterilisatie en plaatsing van een gordijn een mediane borstbeenincisie om het borstbeen te splitsen. Vermijd tijdens de scheiding de belangrijkste bloedvaten en het hart en scheid de getransplanteerde bloedvaten laag voor laag.
- Snijd snel de grote bloedvaten af die verbinding maken met het hart, plaats het hart en de opstijgende aorta op ijssnippers en verwijder de vaatbrug van het transplantaat, de verbonden aorta en de rechter kransslagader. Spoel alle monsters af met een normale zoutoplossing bij 4 °C.
- Neem het hele transplantaatvat van ongeveer 3-4 cm groot, verdeel het in 4-5 gelijke delen en breng het over naar cryopreservatiebuizen. Plaats de buizen snel in vloeibare stikstof om te bevriezen en ga naar een -80 °C ultra-lage temperatuur vriezer voor opslag.
- Spoel voor analyse het transplantaat af met ijskoude 0,9% zoutoplossing en fixeer het in 4% paraformaldehyde-oplossing. Handhaaf een verhouding van weefselblokgrootte tot fixatieve oplossing van 1:10 en fixeer het weefsel gedurende meer dan 12 uur.
- Kleuring de secties in 50 ml waterige oplossing van hematoxyline gedurende 3 minuten. Scheid de secties door te wassen met 50 ml 0,5% zoutzuurethanol en 50 ml 0,2% ammoniakwater gedurende elk 10 s.
- Spoel af met stromend water gedurende 1 uur en reinig vervolgens in gedestilleerd water door 3 minuten te weken. Droog uit in 70% en 90% ethanol gedurende 10 minuten elk. Plaats in 50 ml 0,5% alcohol eosine kleuringsoplossing gedurende 2-3 minuten.
- Droog de gekleurde delen gedurende 10 minuten uit met pure ethanol en week vervolgens gedurende 10 minuten in zuiver xyleen om de monsters transparant te maken. Druppel de transparante delen met neutrale lijm en dek af met een dekslip. Observeer pathologische secties onder een lichtmicroscoop bij 40x vergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BMI en serum biochemische indices
De BMI tussen de sham- en VGD-groepen was niet significant verschillend (sham vs. VGD, 22,05 kg/cm 2 ± 0,46 kg/cm 2 vs. 21,14 kg/cm 2 ± 0,39 kg/cm 2, p = 0,46). De biochemische serumresultaten zijn vermeld in tabel 1. Statistisch significante veranderingen tussen de groepen werden gevonden in vier biochemische indexen, waaronder aspartaataminotransferase (ASAT, sham vs. VGD, 25,25 IE/L ± 1,88 IE/L vs. 31,5 IE/L ± 2,58 IE/L), serumbilirubine (sham vs. VGD, 2,5 μmol/L ± 0,47 μmol/L vs. 4,5 μmol/L ± 0,14 μmol/L), totaal bilirubine (sham vs. VGD, 0,025 μmol/L ± 0,14 μmol/L vs. 0,92 μmol/L ± 0,33 μmol/L), en creatinine (sham vs. VGD, 92,75 μmol/L ± 4,15 μmol/L vs. 141,75 μmol/L ± 12,65 μmol/L).
Ultrasoon onderzoek
Alle dieren in de sham (n = 5) en VGD-groepen (n = 5) overleefden. De chirurgische ingrepen van CABG zijn weergegeven in figuur 1. De gemiddelde operatietijd was 105 min ± 25 min (bereik: 90-160 min) en het gemiddelde intraoperatieve bloedingsvolume was 85 ml ± 35 ml (bereik: 50-200 ml). De invloed van de bedrijfstijd is voornamelijk de overgang van de vaardigheid van de operator van mens naar varken en heeft geen speciale betekenis. De gemiddelde duur van na incisie-anastomose tot tracheale extubatie was 17 min ± 5 min (bereik: 15-30 min). Echografisch onderzoek toonde aan dat de bloedtoevoer van het getransplanteerde vat gedeeltelijke regurgitatie had in vergelijking met de normale kransslagader en dat de algehele bloedstroomrichting over het algemeen normaal was (figuur 3). Pneumothorax, tamponade, infectie of andere ernstige complicaties werden postoperatief niet waargenomen. Er werd geen significant verschil in gewicht of BMI gevonden tussen de schijn- en VGD-groepen, 1 maand postoperatief.
Ultrasoon onderzoek werd uitgevoerd op het proximale uiteinde (figuur 3A, B), vaatholte (figuur 3C, D) en distale uiteinde (figuur 3E, F) van het transplantaatvat. De retrograde stroming werd waargenomen aan de proximale en distale uiteinden van het transplantaatvat; er werd echter geen bloedextravasatie waargenomen.
Pathologische veranderingen in de aderen
Elk veneus transplantaat werd gelijkmatig verdeeld in drie segmenten op lengte, en uit elk segment werd één sectie geselecteerd voor evaluatie en geclassificeerd volgens de gemodificeerde Proudilit-classificatie voor coronaire stenose18. Gemiddelde waarden uit de drie secties werden gebruikt als de resultaten voor de mate van occlusie. De specifieke indeling was als volgt: graad I = 0-punt, normaal zonder restenose; graad II = 1-punts, milde stenose <30%; graad III = 2-punten, stenose tussen 30% en 50%; graad IV = 3-punts, ernstige stenose tussen 50% en 90%; graad V = 4-punten, subtotaal occlusie >90%; en graad VI = 5-punten, totale occlusie, zonder bloedtoevoer naar het veneuze transplantaat. De aangepaste Proudilit-classificatie voor coronaire stenose werd aangenomen om de gekwantificeerde resultaten te beoordelen. Het resultaat voor de sham-groep was 0,00 ± 0,00, wat duidt op geen vasculaire occlusie, terwijl het resultaat voor de CABG-groep 3,12 ± 1,22 was. Daarom was het verschil significant tussen de twee groepen (p < 0,05, tabel 2).
Onder de microscoop, in de schijngroep, leken de tunica intima, tunica media en de veneuze wand van het veneuze transplantaat normaal. In de VGD-groep waren de tunica intima en tunica medium van de veneuze grafts 30 dagen na de CABG-operatie aanzienlijk verdikt. De tunica intima was dubbelzinnig afgebakend van de tunica media. De elastische laag van het tunicamedium verdween (figuur 4). Het lumen van het veneuze transplantaat was gevuld met hyperplastische weefsels (figuur 4). Er werd geen significante verandering in de diameter van het vat waargenomen.
Figuur 1: Overzicht van de procedure. (A-C) Vooroperatie: Weeg de minivarkens, controleer de prestaties van de defibrillator en ventilator en sluit de beademingsbuis aan. (D-F) Anesthesie: Dien een intramusculaire injectie van anesthesie toe aan de minivarkens, bevestig het minipig op de operatietafel, stel de luchtweg volledig bloot voor tracheale intubatie, sluit de ventilator aan en gebruik inhalatie-anesthesie om de anesthesie te behouden. (G-I) Tijdens de operatie: Voer een preoperatieve echografie uit van de hartfunctie in de minivarkens en volledige coronaire bypass-enting via een incisie van de linkerborstwand. (J-L) Na de operatie: Anastomose de wonden en besteed aandacht aan de postoperatieve verzorging en voeding van de minivarkens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De chirurgische ingreep. (A) Snijd de borstwand door, (B) isoleer de interne borstader, (C) verwijder de interne borstader, (D) voer heparineconditionering uit, (E) suspensie van het hartzakje, (F) voer myocardiale ischemiereperfusie uit, (G) controleer de ECG-veranderingen, (H) blokkeer de coronaire bloedstroom, (I) anastomose het proximale uiteinde van het transplantaatvat, (J ) distale coronaire anastomoseplaats, (K) anastomosen distale tot kransslagaders, (L) volledige coronaire bypass-enting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ultrasoon onderzoek. Na de voltooiing van coronaire bypass-transplantatie wordt de doorgankelijkheid van de bloedstroom van het getransplanteerde vat beoordeeld door middel van echografie. (A,C,E) Normale coronaire bloedstroombeelden. Continue bloedstroomsignalen worden gezien aan de (B) proximale, (D) middelste en (F) distale uiteinden van de getransplanteerde bloedvaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histologische analyse . (A) De normale inwendige pathologische sectie van de borstader toonde een duidelijke vasculaire hiërarchie en geen lumenstenose. (B,C) De pathologie van de interne borstader 30 dagen na coronaire transplantatie toonde aan dat de intima van het vat in verschillende mate verdikt was en het lumen duidelijk vernauwd was. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Indicatoren | Sham Groep (n=5) | Graft Groep (n=5) |
| ALT (IE/L) | 46 ±5.11 | 47.75±7.88 |
| AST (IE/L) | 25,25 ±1,88 | 31,5±2,58* |
| Totaal eiwit (IE/L) | 63,12 ±,138 | 60.17±1.91 |
| Albumine (IE/L) | 32,25 ±0,77 | 23.77±5.61 |
| Globuline (g/L) | 30,87 ±,136 | 36.4±6.03 |
| Serumbilirubine (μmol/L) | 2,5 ±0,47 | 4,5±0,14* |
| Totaal bilirubine (μmol/l) | 0,025 ±0,14 | 0,92±0,33* |
| Alkalische fosfatase (IE/L) | 103 ±19,3 | 104±16,04 |
| Glucosamine (mmol/L) | 4,44 ±0,36 | 5.96±0.42 |
| Ureumstikstof (mmol/L) | 2,46 ±0,17 | 2.89±0.65 |
| Serumcreatinine μmol/L | 92,75 ±4,15 | 141,75±12,65* |
| Totaal cholesterol (mmol/L) | 2,37 ±0,12 | 2,16±0,06 |
| Triglyceride (mmol/L) | 0,48 ±0,10 | 0,25±0,05 |
| Hoge dichtheid lipoproteïne mmol / L | 1,05 ±0,07 | 1.03±0.07 |
| Lipoproteïne met zeer lage dichtheid (mmol/L) | 1,43 ±0,06 | 1.29±0.04 |
| Lactaatdehydrogenase (mmol/L) | 384,75 ±26,8 | 478,25±49,58* |
Tabel 1. Serum biochemische indicatoren. Voor de analyse werd statistische analysesoftware gebruikt. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout (n = 5). Vergelijkingen van meetgegevens werden geanalyseerd door de Student t-test. Een p-waarde van minder dan 0,05 duidde op statistische significantie. *p < 0,05, CABG vs. sham.
| Proudilit classificatie | ||||||
| S. Nr. van de steekproef | Score direct na CABG-operatie | Score 30 dagen na CABG-operatie | ||||
| 1 | 0, 0, 0 | 2, 2, 2 | ||||
| 2 | 0, 0, 0 | 1, 2, 2 | ||||
| 3 | 0, 0, 0 | 2, 3, 2 | ||||
| 4 | 0, 0, 0 | 3, 2, 2 | ||||
| 5 | 0, 0, 0 | 2, 1, 2 | ||||
Tabel 2. Statistische resultaten van de occlusie van het transplantaat graden onmiddellijk na de operatie en 30 dagen na de operatie. De aangepaste Proudilit-classificatieschaal werd gebruikt voor vasculaire occlusiegraad: graad I = 0-punt, normaal zonder restenose; graad II = 1-punts, milde stenose <30%; graad III = 2-punten, stenose tussen 30% en 50%; graad IV = 3-punts, ernstige stenose tussen 50% en 90%; graad V = 4-punten, subtotaal occlusie >90%; en graad VI = 5-punten, totale occlusie, zonder bloedtoevoer naar het veneuze transplantaat. De gegevens omvatten resultaten van vijf veneuze grafts gelijkmatig verdeeld in drie secties op lengte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie beschreven we in detail het protocol voor dierselectie, instrumentvoorbereiding, chirurgische procedures en postoperatieve evaluatie bij het ontwikkelen van een CABG-geïnduceerd VGD-model. We voerden ultrasoon onderzoek uit van het veneuze transplantaat voor en na CABG-chirurgie en histologisch onderzoek van het transplantaat 30 dagen na de operatie. De bloedstroom in de interne borstader was normaal vóór de CABG-operatie, terwijl retrograde stroming werd waargenomen in het transplantaat van de interne borstader. In vergelijking met de schijnoperatiegroep waren de lever- en nierfunctie van de dieren in de operatiegroep tot op zekere hoogte beschadigd. Gezien het optreden van coronaire transplantaatziekte, resulteerde de verzwakking van myocardiale contractiliteit in onvoldoende perfusie van perifere weefsels. Het veneuze transplantaat toonde 30 dagen na de CABG-operatie intimale hyperplasie en vasculaire remodellering (figuur 4). Fibrotische veranderingen rond de bloedvaten zijn geassocieerd met wondgenezing, fibroblastproliferatie treedt vroeg in wondgenezing op dag 1 tot dag 3 19, de productie van actief type I collageen en fibronectine vindt plaats op dag 4 tot dag 6, en cytoplasmatische α-SM actine fibril aggregatie vindt plaats op dag 7 tot dag14 19. Stressvezels impliceren de vorming van myofibroblasten, die samenvalt met wondcontractie20. Het is onduidelijk of perivasculaire fibrose de chirurgische uitkomsten beïnvloedt.
Hier hebben we minivarkens geselecteerd om het adertransplantatieziektemodel vast te stellen. Hoewel kleine dieren zoals ratten zijn gebruikt om de pathologische mechanismen van VGD21 te bestuderen, zijn varkens qua grootte, anatomie en fysiologie vergelijkbaar met mensen en zijn daarom meer geschikt voor het bestuderen van de pathogenese van menselijke hartaandoeningen of als een hulpmiddel voor de ontwikkeling van apparaten22. Inwendige borstaderen worden ook vaak klinisch geselecteerd als grafts. Klinische studies van twee onafhankelijke groepen vonden dat interne borstadertransplantaten het kenmerk hebben van een hoge incidentie van adertransplantaatlaesies, en dezelfde pathologische veranderingen werden waargenomen in onze studie (figuur 4) 23,24. Net als in de klinische praktijk is de selectie van een geschikte chirurgische aanpak bij dierchirurgie van cruciaal belang voor het succes van de operatie; hier verwezen we naar Hocum's linker thoracotomie11. We ontdekten dat de linker thoracotomie het operatieveld duidelijk kon blootleggen, de anatomie rond de incisie was gemakkelijk te identificeren en de hoeveelheid bloedingen was laag. Bovendien vereist de laterale thoracotomie in vergelijking met de mediane thoracotomie geen zagen van het borstbeen, zodat chirurgische stress kan worden verminderd.
Anesthesie is cruciaal voor het succes van een chirurgisch model. In deze studie werd het protocol aangepast van Kotani et al., waarbij de combinatie van ketamine en diazepam werd gebruikt als anesthesie-inductie en isofluraaninhalatie als onderhoudsanesthesie25. Daarnaast toonde een onderzoeksgroep aan dat intraveneuze geneesmiddelen ook geschikt waren voor onderhoudsanesthesie26. Endotracheale intubatie bij varkens kan moeilijk zijn voor een dierchirurgisch team. In vergelijking met de menselijke luchtwegen maakt de tracheale anatomie van varkens blootstelling van de glottis moeilijk27. Hier, om de glottis beter bloot te leggen, drukten we de bovenkaak van het varken naar beneden om de glottis van het varken bloot te leggen (figuur 1D). Aan de andere kant zal het gebruik van een directe laryngoscopie of een glasvezelbronchoscopie helpen bij het visualiseren van de glottis bij endotracheale intubatie28.
De pathologische toestand van veneuze graftziekte is voornamelijk verdeeld in drie stadia: 1) acute fase (binnen 1 maand) trombose; 2) subacute fase (1-12 maanden) intimale hyperplasie; 3) late fase (meer dan 12 maanden) vorming van atherosclerose, wat een oorzaak is van transplantaatstenose en occlusie29. De meeste veranderingen in de acute fase van VGD zijn gerelateerd aan operationele factoren en de atherosclerose gevormd in het late stadium is onomkeerbaar. De studie van subacute endometriumverdikking is erg belangrijk voor de pathogenese, behandeling en preventie van VGD. Het is ook van cruciaal belang dat de gekozen entvaten verschillen van de verticale vaten van de grote vena saphena. De interne borstader draagt meestal minder hydrostatische druk en de pathologische veranderingen zijn sneller na transplantatie dan voor de grote vena saphena. In ons model werd typische intimale hyperplasie die het lumen van het getransplanteerde vat afsluit, gezien bij het histologisch onderzoek 30 dagen na de operatie, en dezelfde pathologische veranderingen zijn waargenomen in andere klinische studies23,24. De modelleringsresultaten van het selecteren van de interne borstader in minivarkens zijn stabiel in fenotype, de modelleringstijd is kort en de mate van vermindering van de pathologische veranderingen van VGD is hoog, wat bevorderlijk is voor de ontwikkeling van vervolgonderzoek.
Het model heeft ook enkele beperkingen. Sommige fijne operaties in het modelleringsproces van grote dieren, intraoperatieve monitoring van dierlijke vitale functies en postoperatieve reanimatie vereisen allemaal bepaalde praktische ervaring, waarvoor professionele chirurgen en anesthesiologen nodig zijn om de training te begeleiden en de accidentele sterfte van dieren aanzienlijk te verminderen. Grote dierchirurgie vereist specifieke experimentele locaties, professionele personeelsbezetting en voldoende financiële ondersteuning, wat een zwaardere last kan zijn voor kleinere instituten.
Kortom, onder begeleiding van professionals kunnen goed uitgeruste laboratoria de pathologische veranderingen van VGD verder bestuderen door dit minipig VGD-model vast te stellen, dat van groot belang is voor de behandeling van VGD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute voor technische ondersteuning, dierverzorging en monsterverzameling. Ze bedanken ook Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, voor technische ondersteuning bij het ultrasoon onderzoek. Dit werk werd ondersteund door Guangdong Science and Technology Program, China, en Jinan University Central Universities Basic Scientific Research Business Expenses Project (2017A020215076, 2008A08003 en 21621409).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aortic Punch | Medtronic Inc. , America | 3.0mm, 3.5mm, 4.0mm | Used for proximal coronary bridge anastomosis |
| Automatic biochemical analyzer | IDEXX Laboratories, Inc. America | Catalyst One | |
| Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit | LANDANGER, France | ||
| Cardiogram monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd | MEC-1000 | |
| Coronary Shunt | AXIUS | OF-1500, OF-2500, OF-3000 | The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis. The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis. |
| Defibrillator | MEDIANA | Mediana D500 | |
| Diazepam | Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China | H37023039 | Narcotic inducer |
| Disposable manual electric knife | Covidien, America | E2516H | |
| Electric negative pressure suction machine | Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd | YX932D | |
| Esmolol | Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD | H20055990 | Emergency drugs |
| Ice machine | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Lidocaine | Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD | H51021662 | Emergency drugs |
| Luxtec headlight system | Luxtec, America | AX-1375-BIF | Used for lighting fine parts during operation |
| Medical operation magnifier (glasses) | Germany Lista co, LTD | SuperVu Galilean 3.5× | Used for fine site operation during operation |
| Multi-function high-frequency electrotome | Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd | GD350-B | |
| Nitrogen canister | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture) | Johnson & Johnson, America | 6-0, 7-0 | Used to suture blood vessels. |
| Nonabsorbable suture (cotton thread) | Covidien, America | 1-0 | Used for skin and muscle tissue tugging |
| Open heart surgery instrument kit | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD | ||
| Propofol injection | Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD | H19990282 | Anesthetic sedative |
| Refrigerator | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Respiratory anesthesia machine for animal | Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China | R620-S1 | |
| Semi-occlusion clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZL1701RB | Temporarily cut off the aortic flow |
| vecuronium bromide | Richter, Hungary | JX20090127 | Muscle relaxant |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips, Netherlands | CX50 | |
| Zoletil | Virbac, France | Zoletil 50 | Animal narcotic |
References
- Lloyd-Jones, D., et al. Executive summary: Heart disease and stroke statistics--2010 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 121 (7), 948-954 (2010).
- Taggart, D. P. Contemporary coronary artery bypass grafting. Frontiers of Medicine. 8, 395-398 (2014).
- Wolny, R., Mintz, G. S., Pregowski, J., Witkowski, A. Mechanisms, prevention and treatment of saphenous vein graft disease. The American Journal of Cardiology. 154, 41-47 (2021).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 30 (3), 451-463 (2006).
- Suggs, W. D., et al. Antisense oligonucleotides to c-fos and c-jun inhibit intimal thickening in a rat vein graft model. Surgery. 126 (2), 443-449 (1999).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: Adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), H240-H245 (2004).
- O'Brien, J. E., et al. Early injury to the media after saphenous vein grafting. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (5), 1273-1278 (1998).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. The American Journal of Pathology. 153 (4), 1301-1310 (1998).
- Klyachkin, M. L., et al. Postoperative reduction of high serum cholesterol concentrations and experimental vein bypass grafts. Effect on the development of intimal hyperplasia and abnormal vasomotor function. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 108 (3), 556-566 (1994).
- Tan, W., et al. A porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727 (2021).
- Hocum Stone,, L, L., et al. Magnetic resonance imaging assessment of cardiac function in a swine model of hibernating myocardium 3 months following bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (3), 582-590 (2017).
- Gedik, N., et al. Proteomics/phosphoproteomics of left ventricular biopsies from patients with surgical coronary revascularization and pigs with coronary occlusion/reperfusion: Remote ischemic preconditioning. Scientific Reports. 7 (1), 7629 (2017).
- Tsirikos Karapanos,, N,, et al. The impact of competitive flow on distal coronary flow and on graft flow during coronary artery bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 12 (6), 993-997 (2011).
- Meng, X., et al. Competitive flow arising from varying degrees of coronary artery stenosis affects the blood flow and the production of nitric oxide and endothelin in the internal mammary artery graft. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the. 43 (5), 1022-1027 (2013).
- Thankam, F. G., et al. Association of hypoxia and mitochondrial damage associated molecular patterns in the pathogenesis of vein graft failure: A pilot study. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. , 38-52 (2021).
- Li, X., et al. A surgical model of heart failure with preserved ejection fraction in Tibetan minipigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 180 (180), 63526 (2022).
- Rueda, A. lcalá, I,, et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology: Official Journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies (EUFOS): Affiliated with the German Society for Oto-Rhino-Laryngology - Head and Neck Surgery. 278 (8), 3081-3090 (2021).
- Proudfit, W. L.
- Clark, R. A. Regulation of fibroplasia in cutaneous wound repair. TheAmerican Journal of the Medical Sciences. 306 (1), 42-48 (1993).
- Darby, I., Skalli, O., Gabbiani, G. Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing. Laboratory Investigation. 63 (1), 21-29 (1990).
- Sterpetti, A. V., et al. Formation of myointimal hyperplasia and cytokine production in experimental vein grafts. Surgery. 123 (4), 461-469 (1998).
- Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 153 (153), (2019).
- Langille, B. L., O'Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231 (4736), 405-407 (1986).
- Zwolak, R. M., Adams, M. C., Clowes, A. W. Kinetics of vein graft hyperplasia: Association with tangential stress. Journal of Vascular Surgery. 5 (1), 126-136 (1987).
- Kotani, K., et al. A subacute hypoxic model using a pig. Surgery Today. 35 (11), 951-954 (2005).
- Liu, D., et al. Comparison of ketamine-pentobarbital anesthesia and fentanyl-pentobarbital anesthesia for open-heart surgery in minipigs. Lab Animal. 38 (7), 234-240 (2009).
- Geovanini, G. R., Pinna, F. R., Prado, F. A., Tamaki, W. T., Marques, E. Standardization of anesthesia in swine for experimental cardiovascular surgeries. Revista Brasileira de Anestesiologia. 58 (4), 363-370 (2008).
- Alhomary, M., Ramadan, E., Curran, E., Walsh, S. R. Videolaryngoscopy vs. fibreoptic bronchoscopy for awake tracheal intubation: A systematic review and meta-analysis. Anaesthesia. 73 (9), 1151-1161 (2018).
- Parang, P., Arora, R. Coronary vein graft disease: Pathogenesis and prevention. Canadian Journal of Cardiology. 25 (2), e57-e62 (2009).
- Egan, T. D., et al. Fentanyl pharmacokinetics in hemorrhagic shock: a porcine model. Anesthesiology. 91 (1), 156-166 (1999).
