Summary
Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi ile agara bazlı, bakteriyel makrokolonilerin analizi için yeni bir numune hazırlama yöntemi gösterilmiştir.
Abstract
Enfeksiyon sırasında ortaya çıkan mikrobiyal etkileşimlerin metabolik sonuçlarını anlamak, biyomedikal görüntüleme alanına benzersiz bir meydan okuma sunmaktadır. Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) görüntüleme kütle spektrometrisi, çok çeşitli metabolitler için uzamsal haritalar üretebilen, etiketsiz, yerinde bir görüntüleme yöntemini temsil eder. İnce kesitli doku örnekleri artık bu teknoloji ile rutin olarak analiz edilirken, mikrobiyoloji araştırmalarında yaygın olarak agar üzerinde yetiştirilen bakteri kolonileri gibi geleneksel olmayan substratların görüntüleme kütle spektrometresi analizleri, bu örneklerin yüksek su içeriği ve düzensiz topografyası nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu yazıda, bu numune türlerinin kütle spektrometrisi analizlerinin görüntülenmesine olanak tanıyan bir numune hazırlama iş akışı gösterilmektedir. Bu süreç, iki gastrointestinal patojenin bakteriyel ko-kültür makrokolonileri kullanılarak örneklendirilmiştir: Clostridioides difficile ve Enterococcus faecalis. Bu iyi tanımlanmış agar ortamında mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesinin, fare enfeksiyon modellerinde bu iki patojenik organizma arasındaki mikrobiyal metabolik işbirliğini anlamayı amaçlayan doku çalışmalarını tamamladığı da gösterilmiştir. Arjinin ve ornitin amino asit metabolitlerinin görüntüleme kütle spektrometrisi analizleri temsili veri olarak sunulmuştur. Bu yöntem, diğer analitlere, mikrobiyal patojenlere veya hastalıklara ve hücresel veya doku biyokimyasının mekansal bir ölçüsünün istendiği doku tiplerine geniş ölçüde uygulanabilir.
Introduction
İnsan mikrobiyomu, bakterilerin, virüslerin, arkelerin ve diğer mikrobiyal ökaryotların moleküler etkileşimlerini içeren oldukça dinamik bir ekosistemdir. Mikrobiyal ilişkiler son yıllarda yoğun bir şekilde incelenmiş olsa da, kimyasal düzeyde 1,2 mikrobiyal süreçler hakkında anlaşılması gereken çok şey vardır. Bu kısmen, karmaşık mikrobiyal ortamları doğru bir şekilde ölçebilen araçların bulunamamasından kaynaklanmaktadır. Son on yılda görüntüleme kütle spektrometresi (IMS) alanındaki ilerlemeler, biyolojik substratlardaki birçok metabolitin, lipitin ve proteinin in situ ve etiketsiz uzamsal haritalanmasını sağlamıştır 3,4. Matris yardımlı lazer desorpsiyonu / iyonizasyonu (MALDI), kütle spektrometrisi ile ölçüm için ince bir doku kesitinin yüzeyinden malzemeyi ablate etmek için bir UV lazerinin kullanılmasını içeren, kütle spektrometrisinin görüntülenmesinde kullanılan en yaygın iyonizasyon tekniği olarak ortaya çıkmıştır4. Bu işlem, numunenin yüzeyine homojen olarak uygulanan kimyasal bir matrisin uygulanmasıyla kolaylaştırılır ve numune yüzeyi boyunca sıralı ölçümlerin raster deseninde yapılmasına izin verir. Analit iyon yoğunluklarının ısı haritaları daha sonra veri toplamayı takiben oluşturulur. İyonizasyon kaynakları ve örnekleme tekniklerindeki son gelişmeler, besin agar üzerinde yetiştirilen bakteriyel5 ve memeli 6,7,8 hücresel örnekleri gibi geleneksel olmayan substratların analizini sağlamıştır. IMS tarafından sağlanan moleküler mekansal bilgi, enfeksiyon 9,10,11,12,13,14 sırasında mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerinin biyokimyasal iletişimi hakkında benzersiz bir fikir verebilir.
Clostridioides difficile enfeksiyonu (CDI) üzerine, C. difficile gastrointestinal sistemde hızla değişen bir mikrobiyal ortama maruz kalır ve polimikrobiyal etkileşimlerin enfeksiyon sonuçlarını etkilemesi muhtemeldir15,16. Şaşırtıcı bir şekilde, enfeksiyon sırasında C. difficile ve yerleşik mikrobiyota arasındaki etkileşimlerin moleküler mekanizmaları hakkında çok az şey bilinmektedir. Örneğin, enterokoklar, bağırsak-mikrobiyomdaki fırsatçı kommensal patojenlerin bir sınıfıdır ve CDI17,18,19,20'ye duyarlılığının ve şiddetinin artmasıyla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, bu patojenler arasındaki etkileşimlerin moleküler mekanizmaları hakkında çok az şey bilinmektedir. Bağırsak mikrobiyomunun bu üyeleri arasındaki küçük moleküllü iletişimi görselleştirmek için, kontrollü bir ortamda mikrop-mikrop etkileşimlerini ve bakteriyel biyofilm oluşumunu simüle etmek için burada agar üzerinde bakteriyel makrokoloniler yetiştirildi. Bununla birlikte, bakteri kültürü örneklerinin MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi analizi üzerine temsili metabolik dağılımların elde edilmesi, bu örneklerin yüksek su içeriği ve düzensiz yüzey topografyası nedeniyle zordur. Bu, büyük ölçüde agarın yüksek hidrofilik doğasından ve nem giderme sırasında düzgün olmayan agar yüzey tepkisinden kaynaklanır.
Agarın yüksek su içeriği ayrıca homojen MALDI matris kaplaması elde etmeyi zorlaştırabilir ve vakum21'de gerçekleştirilen sonraki MALDI analizine müdahale edebilir. Örneğin, birçok MALDI kaynağı, agardaki nemi gidermek için yeterli bir vakum olan ve numunenin deformasyonuna neden olabilen 0.1-10 Torr basınçlarında çalışır. Vakum ortamının neden olduğu agardaki bu morfolojik değişiklikler, kurutulmuş agar materyalinde köpürme ve çatlamaya neden olur. Bu artefaktlar, agarın slayta yapışmasını azaltır ve numunenin alet vakum sistemine sökülmesine veya dökülmesine neden olabilir. Agar numunelerinin kalınlığı kızaktan 5 mm'ye kadar çıkabilir, bu da cihazın içindeki iyon optiklerinden yetersiz boşluk oluşturarak kontaminasyona ve/veya cihaz iyon optiklerinde hasara neden olabilir. Bu kümülatif etkiler, altta yatan mikrobiyal biyokimyasal etkileşimlerden ziyade, yüzey topografyasını yansıtan iyon sinyalinin azalmasına neden olabilir. Agar numuneleri homojen olarak kurutulmalı ve vakumda analizden önce mikroskop kaydırağına kuvvetlice yapıştırılmalıdır.
Bu yazıda, agar ortamında yetiştirilen bakteri kültürü makrokolonilerinin kontrollü kurutulması için bir numune hazırlama iş akışı gösterilmektedir. Bu çok adımlı, daha yavaş kurutma işlemi (daha önce bildirilenlere göre), mikroskop slaytlarına monte edilmiş agar numunelerinin köpürmesi veya çatlaması etkilerini en aza indirirken, agarın eşit şekilde dehidrate olmasını sağlar. Bu kademeli kurutma yöntemi kullanılarak, numuneler mikroskop sürgüsüne kuvvetlice yapıştırılır ve sonraki matris uygulaması ve MALDI analizi için uygun hale getirilir. Bu, kommensal ve fırsatçı patojen Enterococcus faecalis'in varlığı olan ve olmayan CDI'yi barındıran agar ve murin doku modellerinde yetiştirilen C. difficile modeli bakteri kolonileri kullanılarak örneklendirilmiştir. Hem bakteri hem de doku modellerinin MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi analizleri, amino asit metabolit profillerinin mekansal haritalandırılmasına izin vererek, biyoenerjetik mikrobiyal metabolizma ve iletişim hakkında yeni bilgiler sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Hayvan deneyleri, Philadelphia Çocuk Hastanesi ve Pennsylvania Üniversitesi Perelman Tıp Fakültesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmıştır (protokoller IAC 18-001316 ve 806279).
DİKKAT: Clostridium difficile (C. difficile) ve Enterococcus faecalis (E. faecalis) BSLII patojenleridir ve çok dikkatli kullanılmalıdır. Gerektiğinde uygun dekontaminasyon protokollerini kullanın.
1. Bakteri kültürü makrokolonilerinin büyümesi ve gece sevkiyatına hazırlık
- C. difficile ve E. faecalis gece kültürlerini hazırlayın ve bunları 37 ° C'de anaerobik bir odada (% 85 azot,% 10 hidrojen,% 5 karbondioksit) beyin-kalp-infüzyon suyunda% 0.5 maya ekstresi ve% 0.1 l-sistein (BHIS) ile desteklenmiş ayrı ayrı büyütün. Tüm kaplanmış numuneler için% 1,5 agar kullanın.
- Bakteri kültürü ortamını 600 nm'de (OD600) optik yoğunluğa normalleştirin. Her makrokoloninin 5 μL'sini BHIS + l-sistein agar plakalarına yerleştirin ve 37 ° C'de 7 gün boyunca anaerobik olarak büyür. Karışık tür makrokolonileri için, kaplamadan önce bakteri kültürü ortamını 1: 1 oranında karıştırın.
- İndiyum kalay oksit (ITO) kaplı mikroskop slaytlarını, slaytın kenarını iletken kaplama ile tanımlamak için bir ohmmetre kullanarak hazırlayın. Mikroskop slaytının İTO kaplı tarafını kazımak ve etiketlemek için elmas uçlu bir kağıt kullanın.
- Tüm kültürü agar büyüme plakasından çıkarın ve daha sonra hava kabarcıklarının agar ve slayt arasında sıkışmamasını sağlarken İTO kaplı bir mikroskop sürgüsüne monte edin.
NOT: Agar ortamındaki su içeriği, kültürün mikroskop slayt yüzeyine doğal olarak yapışmasına izin vermelidir. Bu süreci örnekleyen bir video, Yang ve ark.22'nin ek belgelerinde verilmiştir. - Kolonileri korumak için mikroskop slayt kutularına yerleştirin. Sürgü kutularını 8 inç x 8 boyutlarında, biyolojik tehlike numunesi taşıma torbalarında bir avuç kurutucu pelet ile saklayın ve daha fazla işleme ve analiz için gece boyunca nakliye için mühürleyin.
NOT: Bakteriyel büyüme ve metabolizmayı yavaşlatmak ve analize kadar bakteri örneklerinin sabitlenmesini sağlamak için ortam koşulları altında sevk edildiğinde bakteri kültürleri için kuru bir ortam sağlamak önemlidir. Bu nakliye yöntemi kapsamlı deneylerle optimize edilmiştir ve kuru buzda dondurulmuş kolonilerin nakliyesine göre tercih edilmektedir. Kurumadan önceki büyük sıcaklık değişimleri, monte edilmiş agar numunesinin altında sökülmeye ve köpürmeye neden olma eğilimindedir.
2. C. difficile + E. faecalis bakteriyel makrokolonilerinin ortam kurutulması
- İTO kaplı mikroskop kızaklarına monte edilen agaroz bakteri kolonilerini ambalaj malzemesinden çıkarın. Numuneleri oda sıcaklığında 48-72 saat kurutuculu kuru bir kutuya koyun.
NOT: Bu, agar ortamının mikroskop slayt yüzeyinden köpürmesini, çatlamasını veya ayrılmasını en aza indiren hafif ve yavaş kuruyan bir işlemdir. - Kirlenmiş tüm ambalaj malzemelerini uygun şekilde atın ve çalışma alanını uygun bir bakteri öldürücü/sporisidal dezenfektan ile dekontamine edin.
- Kolonileri agar yüzeyindeki deformasyonlar açısından görsel olarak inceleyin (örneğin, köpürme, çatlama, sökme).
NOT: Agaroz yüzeyinin yüksekliği gözle görülür şekilde azalmalı ve slayt boyunca düz durmalıdır.
3. C. difficile + E. faecalis bakteriyel makrokolonilerinin vakumlu ve ısı aracılı kurutulması
NOT: Agar numunelerinden fazla nemin uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için özel yapım bir vakumlu kurutma aparatı (Şekil 1) üretilmiştir. Bu aparat, bir HEPA biyofiltresine paralel olarak bağlanmış bir döner kanatlı vakum pompası, bir soğuk tuzak ve bakteri numunelerinin yerleştirildiği paslanmaz çelik bir oda kullanır. Değişken voltajlı bir transformatör, kullanıcının kurutma işlemini hızlandırmak için odayı ısıtmasını sağlayan yalıtımlı bir tel filamentine bağlanır.
- Vakum hattını numune odasına kapatın ve vakum pompasının ısınmasına ve uygun vakum basıncına ulaşmasına izin vermek için güç anahtarını döner kanatlı pompaya açın.
- Odanın etrafına sarılmış tel filamentini ısıtmak için değişken voltajlı transformatörü açın. Vakum odasının iç sıcaklığı ~ 50 ° C'ye ulaşana kadar değişken güç kaynağını ayarlayın. Pompa ısınırken, soğuk tuzağın kondenserine bir bulamaç kuru buz ve% 100 etanol yerleştirin.
NOT: Soğuk tuzak, numunedeki buharları veya sporları yoğunlaştırır ve döner kanatlı pompa sisteminin ve vakum pompası yağının kirlenmesini önler. - 16 mm çift pençeli flanş kelepçelerini gevşetmek için bir anahtar kullanarak vakum odasını açın. Agaroz numunelerini hazneye yerleştirin ve odacığı 16 mm çift pençeli flanş kelepçeleriyle sıkıca kapatın.
- Odayı boşaltmak için pompa valfini açın. Numunelerin 60-120 dakika kurumasını bekleyin (örneğin, ~ 150 mTorr'da).
NOT: Bu kuruma süresi, küçük agar kesitlerindeki nemin çoğunu gidermek için yeterlidir. Nem giderimi için optimum kuruma süresinin ampirik olarak belirlenmesi ve agar yüksekliğinin azaltılması, bireysel kuruluma ve numunelere bağlı olarak gerekli olabilir. Önemli ölçüde daha uzun kuruma süreleri, kurutulmuş agarın kırılgan hale gelmesine ve çatlamaya eğilimli olmasına neden olabilir. - Tamamlandığında, döner kanatlı pompadaki valfi kapatarak ve harici vanayı ortam havasına açarak vakum odasını yavaşça ortam basıncına boşaltın. Daha önce bahsedilen protokolü kullanarak odayı açın ve kurutulmuş agaroz örneğini odadan çıkarın.
- Numuneyi matris uygulamasına kadar kurutuculu kuru bir kutuda saklayın.
NOT: Şekil 2 , agar yüzeyinin kurumadan önceki ve sonraki görüntülerini göstermektedir.
4. Robotik püskürtme ile MALDI matris uygulaması
NOT: Agaroz numuneleri iyice kurutulduktan ve kültür kesitlerinin yüksekliği gözle görülür şekilde azaldıktan sonra, kimyasal bir MALDI matris bileşiğinin ince bir kaplamasını homojen bir şekilde uygulamak için robotik bir matris püskürtücü kullanın. Bu prosedür kimyasal bir duman başlığında ve eldivenler, laboratuvar gözlükleri ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla yapılmalıdır.
- Uygun MALDI matrisini seçin. Bu protokolü takip etmek için, negatif iyon modunda amino asitlerin olumlu desorpsiyonu ve iyonizasyonu için 1,5-diaminonaftalin (DAN) MALDI matrisini kullanın.
- 90/10 (v/v) asetonitril/su içinde 10 mL/mL DAN MALDI matris çözeltisinin 10 mL'sini hazırlayın. HPLC sınıfı çözücüler kullanın, 30 dakika boyunca sonikat yapın ve robotik püskürtücü şırınga pompasına girmeden önce çözeltiyi 0,2 μm naylon şırınga filtrelerinden filtreleyin. Ek olarak, püskürtücü hattının her kullanım arasında temiz olmasını sağlamak için yıkama çözeltileri hazırlayın.
NOT: Yıkama çözeltileri, matrisin ve diğer kirleticilerin püskürtücü hattındaki çözünürlüğünü arttırmak ve sistemden uzaklaştırılmalarını kolaylaştırmak için seçilir. Burada kullanılan yıkama çözeltileri 90/10 (v/v) asetonitril/su, 50/50 (v/v) su/metanol, 99/1 (v/v) asetonitril/asetik asit ve 95/5 (v/v) su/amonyum hidroksittir. - Numuneyi püskürtücü tepsisine takın ve hazırlanan çözeltileri püskürtücü hattına yükleyin (Şekil 3). Bilgisayar yazılımını kullanarak, matris bileşiğinin düzgün bir şekilde kaplanmasına izin vermek için gerekli parametreleri belirtin: 30 °C nozul sıcaklığı, sekiz geçiş, 0,1 mL / dak akış hızı, CC deseni, 0 s kuruma süresi, 10 psi.
NOT: Genel olarak, çoğu patojenin, tipik olarak küçük bir organik asit veya baz olan MALDI matrisinin uygulanmasıyla inaktive edileceği kabul edilmektedir. - Püskürtme sırası bittikten sonra, numuneyi püskürtücü tepsisinden çıkarın ve analize kadar bir kurutma kabininde saklayın.
5. MALDI görüntüleme kütle spektrometresi veri toplama için bakteriyel makrokolonilerin hazırlanması
NOT: Tüm görüntüleme kütle spektrometrisi analizleri bir Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans (FTICR) kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu cihaz bir Nd: YAG MALDI lazer sistemi (2 kHz, 355 nm) ile donatılmıştır.
- Matris kaplı numuneyi MALDI hedef plakası mikroskop slayt adaptörüne yerleştirin ve kalıcı belirteçler kullanarak numune alanını kapsayan en az üç referans işaretleyici yazın (Şekil 4). Referans işaretleyicileri de dahil olmak üzere mikroskop slaytının optik görüntüsünü elde etmek için düz yataklı bir tarayıcı kullanın.
NOT: Referans işaretleyicileri, optik görüntünün cihazda gözlemlenen MALDI kamera görünümüne kaydedilmesine izin verecektir. - Kütle kalibrasyonu, MALDI lazer ayarları, iyon optik parametreleri ve ICR hücre koşullarını içeren, istenen kütle aralığı, hassasiyet ve çözünürlük için optimize edilmiş bir MS cihaz yöntemi tanımlayın. Bu yöntem için, seçilen iyonların sürekli birikimi (CASI) yaklaşımını23 kullanarak negatif iyon modunda gaz fazı sinyal zenginleştirmesi için m/z 100 ila 200 arasında bir 100 Da kütle penceresi seçin, bu da ilgili metabolitlerin m/z değerlerini kapsar.
- Cihazın görüntü alma yazılımını açın ve dosya adını ve konumunu, MS alma yöntemini, örneklenecek ilgi alanlarını ve görüntünün uzamsal çözünürlüğünü tanımlamak için kurulum sihirbazını kullanın.
NOT: 100-300 μm'lik uzamsal çözünürlükler tipik olarak bakteriyel makrokoloni görüntülemesi için kullanılır. - Tüm parametreler tanımlandıktan sonra, tanımlanan ilgili bölge (ler) deki her pikselde seri olarak bir kütle spektrumu elde etmek için edinme dizisini başlatın.
NOT: Görüntü alma süresi cihaz ayarlarına bağlıdır, ancak genellikle 5.000-10.000 piksel içeren görüntüler için 2 ila 6 saat arasında değişir.
6. Görüntüleme kütle spektrometresi veri analizi ve bileşik tanımlama
- Görüntü alımını takiben, verileri kütle spektrometresi platformlarını görüntülemek için satıcıya özgü bir dosya biçimi olan ".mis" dosya uzantısıyla kaydedin. Veri dosyasını flexImaging veya SCiLS yazılım paketlerinde açın veya .mzml gibi tescilli olmayan bir veri biçimine dışa aktarın ve satıcıdan bağımsız yazılımı (örneğin, Cardinal24 veya MSIreader25,26) kullanarak görselleştirin.
NOT: FlexImaging'de görüntüleme verileri açıldığında ortalama bir kütle spektrumu görüntülenir ve bu da örneklenen bölgelerde tespit edilen tüm iyonların ortalama yoğunluklarını temsil eder. İlgilenilen zirveler, doğru kütle ölçümlerine dayanarak geçici olarak tanımlanabilir. Tipik olarak, milyonda 5 parçadan (ppm) daha iyi kütle doğrulukları, FTICR kütle spektrometrelerinde metabolit tanımlaması için yeterlidir. - Başvurulan yazılımı kullanarak, örneklenen bölgeler arasındaki iyon dağılımlarının yanlış renkli ısı haritalarını oluşturmak için ilgi çekici zirveler için kütle pencereleri tanımlayın.
- Ortalama kütle spektrumu ekranında, ilgi çekici zirveye yakınlaştırın ve tepe profilinin alanını kapsayan uygun bir kütle penceresi seçin.
- Vurgulanan kütle penceresine sağ tıklayın ve Kütle Filtresi Ekle'yi seçin. Seçilen m/z değerini, yüksek çözünürlüklü doğru kütle ölçümü ile belirlenen şüpheli metabolit için geçici tanımlamayı kullanarak etiketleyin.
- Yanlış renkli ısı haritası tarafından görüntülenen analit görüntüsünün dinamik aralığını ayarlamak için yoğunluk eşiğini seçin. Kütle filtreleme parametrelerini , kütle penceresi tepe profilinin alanını kapsayacak şekilde ayarlayın ve ardından kütle filtresini ekleyin.
NOT: Yoğunluk normalleştirmesi, ölçülen bölgeler arasında göreceli nicelemeyi iyileştirmek için uygun şekilde gerçekleştirilebilir. Buradaki deneylerde, toplam iyon sayımı (TIC) ve kök ortalama kare (RMS) normalleştirme yöntemlerini yanlış hale getirebilecek CASI veri toplama (vide infra) kullanılmıştır. Bu nedenle, burada gösterilen tüm iyon görüntüleri normalleştirme olmadan görüntülenir.
7. Enfekte olmayan kontrol ve C. difficile ile enfekte fare çekal dokularının hazırlanması ve gönderilmesi
- Antibiyotiklerle (0.5 mg / mL sefoperazon veya 0.5 mg / mL sefoperazon + 1 mg / mL vankomisin) 4-8 haftalık C57BL / 6 erkek fareleri 5 gün boyunca içme suyu ad libitumunda innoküle edin, ardından 2 günlük bir iyileşme süresi ve ardından enfeksiyon.
- CO2 asfiksasyonu ile hayvanları ötenazi yapın ve fare çekum organını hemen hasat edin. Damıtılmış suya %20'lik bir optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği karışımı yerleştirin.
- Numuneleri kuru buz üzerine yerleştirin ve ardından analiz için paketleyip gönderin; analize kadar -80 °C'de saklayın.
8. Enfekte olmayan kontrol verus C. difficile ile enfekte fare çekal dokularının kriyoseksiyonu
- Tüm kriyoseksiyon ekipmanlarını %100 etanol ile durulayarak temizleyin ve numuneleri kriyostat odasına yerleştirmeden önce kurumaya bırakın. İletken kaplama ile slaytın kenarını tanımlamak için bir ohmmetre kullanarak İTO kaplı mikroskop slaytları hazırlayın. Mikroskop slaytının İTO kaplı tarafını kazımak ve etiketlemek için elmas uçlu bir kağıt kullanın.
NOT: Eldivenler, laboratuvar gözlükleri, laboratuvar önlüğü ve kriyostat kılıflar dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir. - Bir araştırma kriyomikrotomunda kriyoseksiyon yapın. OCT'ye gömülü fare ceca dokularını -80 °C dondurucudan kuru buz üzerindeki kriyomikrotom odasına (30 °C oda sıcaklığı, -28 °C nesne sıcaklığı) aktarın. Her iki doku tipinin aynı numune hazırlanmasını sağlamak ve doğru metabolit karşılaştırmalarını sağlamak için görüntüleme kütle spektrometresi (örneğin, enfekte olmayan kontrol ve C. difficile ile enfekte edilmiş) kullanılarak karşılaştırılacak doku örneklerini aynı mikroskop slaytına monte edin.
- Kriyomikrotom odasının içine, OCT gömülü dokuyu ek OCT çözeltisi kullanarak bir numune mandren üzerine monte edin. OCT çözeltisi katılaştıktan sonra, aynayı numune kafasına sabitleyin. Organın istenen doku derinliğine / düzlemine ulaşmak için kriyoseksiyona 10-50 μm artışlarla başlayın.
- Dokunun optimal bir kesitine ulaşıldığında, 12 μm kalınlığında kesitler toplamaya başlayın. Sanatçı boya fırçalarını kullanarak dilimi nazikçe manipüle edin ve Teflon kaplı mikroskop slaydına yerleştirin.
- Teflon kaplı slayttan dokuyu almak için ICO kaplı mikroskop slaytını doku bölümünün üzerine yuvarlayın. Çöz, avuç içini ICO kaplı slaydın arkasına bastırarak doku bölümünü mikroskop slaytına monte edin. Doku kesiti yarı saydamdan opak/mat bir dokuya geçene kadar montajı eritmeye devam edin.
- Dokuya monte mikroskop slaytlarını kuru buz üzerinde aynı gün analiz için depolamak üzere kurutuculu kuru bir kutuya aktarın veya daha uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın.
9. Matriks uygulaması ve MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi için C. difficile ile enfekte fare çekal dokularına karşı enfekte olmayan kontrolün hazırlanması
- Adım 4'te açıklanan aynı protokolü kullanarak MALDI matris uygulamasını gerçekleştirin (30 ° C nozul sıcaklığı, sekiz geçiş, 0,1 mL / dak debi, CC modeli, 0 s kuruma süresi, 10 psi).
- Adım 5 ve 6'da açıklanan protokolleri kullanarak MALDI görüntüleme kütle spektrometresini gerçekleştirin.
- Birden fazla biyolojik replikasyondan iyon görüntülerini analiz edin ve yukarıda belirtilen SCiLS istatistiksel yazılımını kullanarak yoğunluk kutusu grafiği karşılaştırmaları yoluyla anlamlılık sonuçlarını karşılaştırın.
NOT: Uygun istatistiksel testler ve karşılaştırmalar uygulamaya bağlı olacaktır ve ayrımcı ve ilişkili spektral özelliklerin belirlenmesi için uzamsal segmentasyon, sınıflandırma modelleri ve karşılaştırmalı analiz içerebilir. Karşılaştırmalı analizler, önemli özelliklere p değerleri atamayı, doku karşılaştırmaları için ana bileşen analizleri oluşturmayı ve varyasyonları tanımlamak için kutu grafiklerini görselleştirmeyi içerebilir. Görüntüleme kütle spektrometrisini takiben hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyanan doku kesitinin parlak alan mikroskopisi kullanılarak dokunun görselleştirilmesi de yararlıdır. Bu, dokudaki morfolojik özelliklerin net bir şekilde tanımlanmasını sağlar ve eğitimli bir patologa danışılarak analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrop-mikrop etkileşimlerinde amino asitlerin rolünü incelemek için model bakteri kolonilerinin ve E. faecalis ve C. difficile ile birlikte kolonileştirilen farelerin metabolit MALDI görüntüleme kütle spektrometrisini gerçekleştirdik. Agar üzerinde yetiştirilen bakteriyel makrokoloniler, bakteriyel biyofilm oluşumundaki farklı biyokimyasal değişiklikleri analiz etmek için iyi tanımlanmış bir model olarak hizmet eder. Agar yüzeyinde deformasyonları ve çatlamaları en aza indirmek için agar ortamında yetiştirilen bakteri kültürü makrokolonileri için kontrollü bir kurutma prosesinin sağlanması önemlidir. Bu, ortam sıcaklığı ve basıncı altında kurutucu ile ön kurutmayı ve ardından yüksek bir sıcaklıkta gerçekleştirilen daha hızlı bir vakum yardımlı kurutma adımını içeren iki aşamalı bir prosesle elde edildi . Numunelerden herhangi bir bakteriyel kirletici maddenin veya sporun salınımını yakalarken agar dehidrasyonunu kolaylaştırmak için özel yapım bir kurutma aparatı kullanılmıştır (Şekil 1). Ek vakumlu kurutma adımı, numunelerin tamamen dehidrate olmasını ve MS vakumuna maruz kaldığında deformasyona uğramamasını sağlamak için gereklidir.
Agar kesitleri başlangıçta numune yüksekliğinde 2-4 mm idi (Şekil 2A) ve kurutma protokolünü takiben ~0.5 mm yüksekliğe düşürüldü (Şekil 2B). Bu numune hazırlama protokolü sırasında numune yüzeyi boyunca homojen kurutmanın sağlanması önemlidir. Numune yüksekliğindeki büyük değişiklikler, numune yüzeyinde bulanıklaştırılmış bir MALDI lazer ışınına neden olur, bu da iyonizasyon verimliliğini ve sonuçta ortaya çıkan analit iyon yoğunluğunu zararlı bir şekilde etkileyebilir. Başarısız bir kurutma prosesinin bir örneği, agar yüzeyinin kabarcıklandığı ve çatladığı ve numuneyi daha fazla analiz için kullanılamaz hale getirdiği Şekil 2D'de gösterilmiştir. Bakteri numunesi iyice kurutulduktan sonra, robotik bir püskürtücü kullanılarak bir DAN MALDI matris tabakası uygulanır (Şekil 3). Bu cihaz, püskürtme parametrelerinin hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlayarak homojen bir matris kaplamasının uygulanmasını sağlar (Şekil 2C).
Matris uygulamasını takiben, örnekleri içeren mikroskop slaytları, bir FTICR MS üzerinde analiz edilmek üzere bir slayt adaptörüne yerleştirilir (Şekil 4). Slayttaki koordinatlar, görüntüleme kütle spektrometresi edinme yazılımı ile cihaz kamerası arasında, önce ölçülecek bölgelerin etrafındaki slaytta referans işaretleri çizilerek kaydedilir (Şekil 4'te "+" sembolleriyle gösterilir). Slayt daha sonra optik bir görüntü kaydetmek için düz yataklı bir tarayıcı kullanılarak dijital olarak taranır ve daha sonra flexImaging yazılımında edinme sırasını tanımlamak için kullanılır. Metabolit anyonların iletimi ve tespiti için kütle spektrometresi cihaz ayarlarını optimize ettik. CASI gaz fazı iyon zenginleştirmesi kullanılarak, doku yüzeyinden gözlemlenen bir dizi bileşiği içeren m / z 150 ± 50 Da'da (Şekil 5A) iyonları seçici olarak biriktirmek için bir iyon izolasyon penceresi tanımlanmıştır. Özellikle burada C. difficile enfeksiyonu için, bakteriyel katabolizma sırasında ilginç ve değişen rolleri göstermek için amino asit yolları bulduk. Doğru kütle ölçümlerine dayanarak, iyon sinyalleri m/z 131.083 ve m/z 173.104'te ornitin olarak tanımlanmıştır (0.34 ppm kütle hatası; Şekil 5B) ve arginin (0.43 ppm kütle hatası; Şekil 5C), sırasıyla.
Bakteriyel makrokolonilerin görüntüleme kütle spektrometrisi C. difficile monokültürleri ve C. difficile + E. faecalis ko-kültür kolonileri üzerinde gerçekleştirildi (Şekil 6). MALDI matris uygulamasını takiben örneklerin optik görüntüsü, koloni biyofilmlerinin dış alanlarına uzanan ilgi çekici edinme bölgelerini vurgulamaktadır (Şekil 6A, C). Bu örneklerin görüntüleme kütle spektrometrisi, E. faecalis varlığında değişmiş ve diferansiyel olarak lokalize edilmiş bulunan hem ornitin hem de arginin amino asit metabolitlerinin mekansal haritalandırılmasına izin verir (Şekil 6B, D). Örneğin, arginin, C. difficile monokültüründe, C. difficile + E. faecalis ko-kültürüne kıyasla önemli ölçüde daha fazladır (Şekil 6D). Ayrıca, görüntüleme kütle spektrometresi analizlerini, C. difficile sporları, hem C. difficile sporları + E. faecalis hücreleri (wt) (5 × 10 8/mL) veya her iki C. difficile sporu + E. faecalis (ArcD mutant) hücresi (5 × 10 8/mL) içeren bir transpozon mutantı ile enfekte olmuş8 haftalık mikropsuz C57BL/6 dişi fareleri kullanarak fare enfeksiyon modellerine genişlettik (Şekil 7)27 . Fare çekumu, organ şeklini ve sadakatini korumak için% 25 OCT bileşiğinde toplandı ve donduruldu. OCT bileşiği ayrıca kriyoseksiyon sırasında ince doku bölümlerini desteklemeye yardımcı oldu. Yukarıda belirtilen protokole benzer şekilde, doku kesitleri bir DAN MALDI matris tabakası ile kaplanır, düz yataklı bir optik tarayıcı kullanılarak taranır (Şekil 7B) ve MALDI görüntüleme kütle spektrometresi ile analiz edilir (Şekil 7C). Görüntüleme kütle spektrometrisi analizini takiben doku kesitlerinde histolojik boyama yapıldı ve doku morfolojisini değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü parlak alan optik taraması kullanıldı (Şekil 7A). Epitel hücre tabakası, kontrol dokusuna kıyasla enfeksiyon sırasında açıkça iltihaplanır.
Resim 1: Ev yapımı vakumlu kurutma aparatı. Agar numunelerinden nem giderimini hızlandırmak için özel yapım bir vakumlu kurutma aparatı kullanılır. Numuneler, döner kanatlı bir pompa kullanılarak kapatılan ve tahliye edilen vakum odasına yerleştirilir ve daha sonra değişken voltajlı bir transformatör kullanılarak ısıtılır. Numuneden gelen kirletici buharlar/sporlar soğuk tuzakta ve HEPA sıralı filtrelerde hapsedilir. Tipik olarak 100-150 mTorr basınçları kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bakteriyel makrokolonilerin kurutulması ve hazırlanması. Agar numunelerinin (A) kurutma, vakum ve vakum yardımlı kurutma kullanılarak nem gideriminden önce ve (B) sonra optik görüntüleri. (C) Bir 1,5-diaminonaftalin MALDI matrisi, robotik bir püskürtücü kullanılarak kurutulduktan sonra bakteriyel ko-kültüre uygulanır. (D) Başarısız kurutma tipik olarak agar içinde çatlama ve köpürmeye neden olur ve bu da onu daha fazla analiz için kullanılamaz hale getirir. Kısaltmalar: DAN = 1,5-diaminonaftalin; MALDI = matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: MALDI matrisinin agaroz numuneleri üzerine robotik püskürtülmesi. (A) bir HTX M5 TM püskürtücünün ve (B) MALDI matris uygulaması için robotik matris püskürtücüye yüklenen agaroz numunelerinin görüntüleri. Kısaltma: MALDI = matris destekli lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Analiz için yüklü numunelere sahip kütle spektrometresi adaptörü. Matris kaplı agaroz numuneleri, MALDI analizi için bir MTP slayt adaptörüne yüklenir. Referans belirteçleri siyah artı işaretleri ("+") olarak görünür. Kısaltma: MALDI = matris destekli lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tanımlanan metabolit iyon zirvelerinin temsili kütle spektrumları. (A) Bakteriyel kültür örneklerinin negatif iyon modu MALDI analizi, düzinelerce metabolitin tespit edilmesini sağlar. Yüksek çözünürlüklü doğru kütle ölçümleri, m/z 131.083'te (B) ornitinin (0,34 ppm kütle hatası) ve (C) m/z 173,104'te (0,43 ppm kütle hatası) arjininin geçici olarak tanımlanmasına olanak tanır. Kütle spektrumları, m / z 150'de 75.000'lik bir kütle çözme gücü (FWHM) kullanılarak elde edilir. Kısaltmalar: MALDI = matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu; FWHM = maksimum yarıda tam genişlik. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bakteriyel makrokolonilerin görüntüleme kütle spektrometrisi analizi. (A,C) Agaroz örneklerinin optik görüntüleri, beyaz kesikli çizgilerle vurgulanan kütle spektrometrisi analizini görüntülemek için ölçüm bölgelerini gösterir. (B,D) Ornitin (m / z 131.083, 0.038 ppm) ve arginin (m / z 173.104, 0.60 ppm) için MALDI iyon görüntüleri, bakteri kültürleri arasında benzersiz uzamsal dağılımlar göstermektedir. Mutlak yoğunluk ölçeklerinin, B ve D panellerinde gösterilen ko-kültür iyon görüntüleri için farklı olduğunu unutmayın. Örneğin, arginin, C ve D panellerindeki ko-kültüre göre C. difficile monokültüründe önemli ölçüde daha bol miktarda bulunur, yani bu yoğunluk ölçeği arginin bolluğuna göredir monokültürde arginin bulunmadığı görülmektedir ve bu ortak kültürde arginin bulunmadığı görülmektedir. Tersine, A ve B'deki ko-kültür, arginin yoğunluğunu daha düşük bir mutlak yoğunluk ölçeğine yansıtır, çünkü bu görüntüdeki tek örnektir. Kısaltmalar: MALDI = matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu; CASI = seçilen iyonların sürekli birikmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Enfekte murin çekal dokularının görüntüleme kütle spektrometrisi analizi. (A) Enfekte fare çekasından hematoksilin ve eozin boyalı dokuların brightfield mikroskopi görüntüleri, doku morfolojisinin görselleştirilmesine izin verir. (B) Fare ceca dokularının optik görüntüleri, bir DAN MALDI matris katmanının uygulanmasını takip eden örnekleri gösterir. (C) Ornitin (m/z 131.083, 0.88 ppm) ve arginin (m/z 173.104, 0.15 ppm) için MALDI iyon görüntüleri, doku örnekleri boyunca benzersiz uzamsal dağılımlar gösterir. Kısaltmalar: MALDI = matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu; DAN = 1,5-diaminonaftalin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi sırasında, numune substratı üzerindeki olay MALDI lazerinin tutarlı bir odak çapını sağlamak için düz bir numune yüzeyine sahip olmak önemlidir. Numune yüksekliğindeki sapmalar, MALDI lazer ışınının odak dışına kaymasına neden olarak ışın çapı ve yoğunluğunda değişikliklere neden olabilir ve bu da MALDI iyonizasyon verimliliğini etkileyebilir. İyonizasyon verimliliğindeki bu değişiklikler, doku yüzeyi boyunca altta yatan doku biyokimyasını yansıtmayan, bunun yerine yüzey topografyasını yansıtan analit yoğunluğundaki farklılıklara neden olabilir. Ek olarak, çoğu MALDI iyonizasyon kaynağı atmosfer altı basınçlarda çalışır ve hidratlanmış agar numuneleri vakum koşullarına maruz kaldıklarında kırılgan numunelerdir. Bu kaynakların vakumu, agaroz numunelerinin dehidrasyonuna neden olabilir ve bu da kurutma sırasında numune yüzeyini değiştirebilir. Hava cepleri veya çok miktarda su içeren numuneler bu değişikliklere karşı oldukça hassastır. Bu sorun, agar üzerinde yetiştirilen bakteri örneklerinin MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi analizi sırasında yaygın olarak karşılaşılan bir sorundur. Besin agar, bakteriyel büyümeyi kolaylaştırmak için yüksek su içeriğine sahiptir; Bununla birlikte, bir MALDI matris kaplaması uygulamadan ve numuneyi kütle spektrometresinin vakumuna sokmadan önce mümkün olduğunca fazla nemin giderilmesi önemlidir.
Bu nedenle hidratlanmış agar numuneleri vakuo analizi için elverişli değildir. Vakuo koşullarının neden olduğu morfolojik değişikliklere ek olarak, mikroskop slağına monte edilmiş numuneyi tutmak ve MALDI lazer odak noktası için uygun konuma getirmek için kullanılan MALDI hedef plakası slayt adaptöründen çok uzağa çıkıntı yapan numune yükseklikleriyle ilgili potansiyel sorunlar da vardır. MALDI sahne mekanizması, sahnenin diğer mekanik bileşenleri ile sıkı bir şekilde çıkarsanmıştır ve konumdayken, numune hedef plakasının yüzeyi ile iyon kaynağı optiklerinin ön ucu arasında sadece birkaç milimetrelik bir boşluk vardır. Bu, numunenin kazınmasına neden olabilir, bu da analiz edilecek numuneyi hareket ettirebilir veya tamamen sökebilir. Dahası, hidratlanmış agar örnekleri doğal olarak mikroskop slayt yüzeyine yapışırken, bu tamamen kurutulmuş bir agar örneğinin yapışmasından çok daha zayıf olma eğilimindedir. Bu nedenle, hidratlanmış agar numuneleri, numune hedef plakasının yüzeyinden daha fazla çıkıntı yapar ve daha zayıf bir aderansa sahiptir, bu da numunenin sökülmesi ve aşağı akış cihazı iyon optiğine dökülme riskinin daha yüksek olmasına neden olur.
MALDI matrisinin kimliği ve uygulama yönteminin seçimi de bir görüntüleme kütle spektrometresi deneyinde dikkate alınması gereken önemli değişkenlerdir. Organik bir MALDI matrisinin seçimi büyük ölçüde numune substratına ve ilgilenilen hedef bileşiklere bağlıdır. Örneğin, birçok düşük moleküler ağırlıklı metabolit (MW < 300 Da), negatif polaritede daha kolay iyonize olan birçok organik asit, fosfat ve diğer moietilerden oluşur28. Negatif mod analizi için, temel matrisler tercih edilir, böylece kimyasal yapıları bir protonu (örneğin, 9-aminoakridin, 1,5-diaminonaftalen) kabul etmeye daha uygundur, bu nedenle ilgilenilen birçok küçük metabolit iyonu üzerinde negatif bir yük bırakır. İlgilenilen hedeflenen analitler için bir matris taraması yaptık ve 1,5-diaminonaftalen (DAN) matrisinin, kontrol dokusu örnekleri için ilgilenilen amino asit metabolitleri için en yüksek sinyali ürettiğini bulduk. MALDI matrisi uygulaması sırasında, ilgilenilen analitler numune substratından çıkarılır ve MALDI matrisi ile birlikte kristalleşir. Bazı durumlarda, "ıslak" matris uygulama koşulları, artan ekstraksiyon ve birlikte kristalizasyonu kolaylaştıracak ve MALDI analizi üzerine daha iyi analit tespiti ile sonuçlanacaktır. Bununla birlikte, matris uygulama işlemi çok fazla çözücü kullanıyorsa, analitler doku içinde delokalize olabilir. Matriks uygulama koşullarını seçerken etkili analit ekstraksiyonu ile dokudaki analitlerin mekansal doğruluğunu korumak arasında bir denge kurmak önemlidir. Örneğin, numune yüzeylerine homojen bir matris tabakası uygulamak için özel yapım bir süblimasyon aparatı kullanılabilir ve29,30 boyutlarında son derece küçük matris kristal boyutları üretir. Bununla birlikte, bu işlem oldukça kurudur ve analit ekstraksiyonu31 için en uygun olmayabilir. Burada kullanılan robotik püskürtücü, sprey basıncının, akış hızının, nozul sıcaklığının ve optimize edilmiş analit ekstraksiyonu ve matris ko-kristalizasyon yöntemlerine izin verebilecek diğer parametrelerin tekrarlanabilir ve hassas kontrolünü sağlar32.
Burada kullanılan FTICR MS üzerindeki enstrümantal parametreler, negatif iyon modunda metabolit iyonlarının iletimi ve tespiti için optimize edilmiştir. Bu, iyon transfer bölgesindeki RF ve DC elementlerinin, tercihen düşük moleküler ağırlıklı iyonları iletmek için ayarlanmasını içerir (<m / z 200). İyon iletimi üzerinde büyük etkisi olan parametreler arasında huni RF genliği (65 V), kuadrupol kütle filtresi iyon izolasyonu için Q1 kütle ayarı (m / z 150) ve hekzapol birikim hücresi ile ICR hücresi arasındaki uçuş süresi gecikmesi (0.400 ms) bulunur. Seçilen bu parametre değerleri, daha büyük m/z değerlerindeki iyonların iletim verimlilikleri pahasına düşük m/z değerlerindeki iyonları daha verimli bir şekilde iletir. Ayrıca, tanımlanmış bir kütle penceresinde iyonların seçici zenginleşmesine izin veren seçilmiş iyonların sürekli birikimi (CASI) yaklaşımını kullandık. Bu yaklaşımda, kuadrupol kütle filtresi, iyonizasyon kaynağından cihazdaki hekzapol birikim hücresine küçük bir m / z değer aralığını seçici olarak iletmek için kullanılırken, bu kütle penceresinin dışındaki m / z değerlerine sahip iyonlar kararsız iyon yörüngelerine sahiptir ve kuadrupol kütle filtresinden iletilmez. Bu, kimyasal gürültünün ortadan kaldırılması yoluyla algılama ve dinamik aralık sınırını üç büyüklük sırasına kadar iyileştirmek için düşük miktarda bol miktarda analitlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir. FTICR cihaz platformunun yüksek kütle çözme gücü ve kütle doğruluğu, izobarik (yani aynı nominal kütle) bileşiklerin kolayca ayrılmasını ve metabolitlerin geçici olarak tanımlanmasını sağlar.
Numune hazırlamanın dikkatli ve tekrarlanabilir kontrolü, MALDI matris uygulaması ve görüntüleme kütle spektrometrisi analizleri, kolonilerde ve doku örneklerinde bakteriyel biyokimyanın tekrarlanabilir görünümlerine izin verebilir. Bakteriyel makrokoloniler, mikrobiyal enfeksiyon sırasında patojenlerin metabolik çapraz iletişimini karakterize etmek için basitleştirilmiş modeller olarak hizmet eder ve bu da hayvan dokuları gibi daha karmaşık sistemlerle karşılaştırılabilir. Örneğin, arginin'in C. difficile + E. faecalis ko-kültür örneğinde, E. faecalis'in bir enerji kaynağı olarak arginin tüketme ve ArcD antiporter33 aracılığıyla hücreden ornitin ihraç etme kabiliyeti ile desteklenen, tek başına C. difficile kültürüne kıyasla düşük miktarda bulunduğu bulunmuştur (Şekil 6). Makrokoloni sonuçları, amino asitlerin bu düzenlemesinin bir hayvan modelinde araştırılmasına yol açmıştır. C. difficile + E. faecalis (wt) ile enfekte olmuş fareler, tek başına C. difficile ile enfekte olmuş farelere göre önemli ölçüde daha az arginin göstermiştir (Şekil 7C), koloni görüntü sonuçlarını özetlemektedir.
Arjinin metabolizması hipotezini ve ArcD antiporterinin katılımını test etmek için, E. faecalis'in ArcD antiporter'ı aracılığıyla metabolit taşınımını nakavt eden bir transpozon mutantı kullandık. C. difficile + E. faecalis (arcD::Tn) ile enfekte olmuş fareler, arginin tespitinde bir artış ve vahşi tip ko-enfeksiyon modeline göre ornitin tespitinde bir azalma gösterir (Şekil 7C) ve genellikle tek başına C. difficile enfeksiyonu modelinde gözlenen orijinal amino asit seviyelerini kurtarır (Şekil 7A). Metabolit regülasyonunun bu ters ilişkisi, E. faecalis'in C. difficile'den üretilen amino asit besinleri ile çapraz beslendiği bulgularını doğrulamaktadır. Ayrıca, histolojik analiz, hem C. difficile hem de E. faecalis ile enfekte olmuş farelerden geniş hücresel hasar gösterdi; bu, öncelikle ArcD transpozon mutantına karşı E. faecalis'in vahşi tip suşunda gözlendi. Bu sonuçlar, arginin ve ornitinin C. difficile virülans, davranış ve davranışın anahtarı olduğuna dair son bulgularımızı desteklemektedir.
fitness27. Genel olarak, bu iş akışı, MALDI görüntüleme kütle spektrometresi için agar bazlı bakteriyel makrokoloniler hazırlamak için etkili bir yöntem göstermektedir ve bu sistemlerin enfeksiyon sırasında mikrobiyal işbirliğini incelemek için yararlı modeller olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, GM138660 ödülü altında Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) tarafından desteklenmiştir. J.T.S., Florida Üniversitesi'nden Charles ve Monica Burkett Ailesi Yaz Bursu tarafından desteklendi. J.P.Z., NIH hibeleri K22AI7220 (NIAID) ve R35GM138369 (NIGMS) tarafından desteklenmiştir. A.B.S., Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Hücre ve Moleküler Biyoloji Eğitim Bursu (T32GM07229) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C.
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , Boston. (2014).
