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Biochemistry

उच्च-थ्रूपुट अलगाव और छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के शुद्धिकरण के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग मापदंडों का अनुकूलन

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64360
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 3, 3, 2
1Central Laboratory of Women’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 3Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल एयर स्प्रे नोजल, शीथ द्रव दबाव, नमूना प्रवाह दबाव, वोल्टेज, लाभ और ट्रिगरिंग थ्रेशोल्ड मापदंडों के आकार को अनुकूलित करके छोटे बाह्य पुटिकाओं के लिए एक तेजी से और आकार-विशिष्ट अलगाव विधि प्रदान करता है।

Abstract

छोटे बाह्य पुटिकाओं (एसईवी) को सभी सेल प्रकारों से जारी किया जा सकता है और प्रोटीन, डीएनए और आरएनए ले जाया जा सकता है। सिग्नलिंग अणु एक कोशिका की शारीरिक और रोग संबंधी स्थिति के संकेतक के रूप में काम करते हैं। हालांकि, एसईवी अलगाव के लिए कोई मानक विधि नहीं है, जो डाउनस्ट्रीम बायोमार्कर पहचान और दवा हस्तक्षेप अध्ययन को रोकती है। इस लेख में, हम एक प्रवाह सेल सॉर्टर द्वारा 50-200 एनएम एसईवी के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके लिए, एक अच्छी छंटाई दर और स्थिर साइड स्ट्रीम प्राप्त करने के लिए 50 μm नोजल और 80 psi शीथ द्रव दबाव का चयन किया गया था। मानक आकार के पॉलीस्टाइनिन माइक्रोसेफर्स का उपयोग 100, 200 और 300 एनएम कणों की आबादी का पता लगाने के लिए किया गया था। वोल्टेज, लाभ और फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) ट्रिगरिंग थ्रेसहोल्ड के अतिरिक्त अनुकूलन के साथ, एसईवी सिग्नल को पृष्ठभूमि शोर से अलग किया जा सकता है। ये ऑप्टिमाइज़ेशन महत्वपूर्ण प्रकार सेटिंग्स का एक पैनल प्रदान करते हैं जो केवल एफएससी बनाम साइड स्कैटर (एसएससी) का उपयोग करके एसईवी की प्रतिनिधि आबादी प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। फ्लो साइटोमेट्री-आधारित अलगाव विधि न केवल उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देती है, बल्कि बायोमार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर एसईवी के तुल्यकालिक वर्गीकरण या प्रोटिओम विश्लेषण की भी अनुमति देती है, जिससे कई डाउनस्ट्रीम अनुसंधान अनुप्रयोग खुलते हैं।

Introduction

एक कोशिका अलग-अलग आकार के बाह्य पुटिकाओं (ईवी) को जारी करती है जिसके परिणामस्वरूप सिग्नलिंग अणु और झिल्ली समावेशन होते हैं, जो अंतरकोशिकीयसंचार के लिए महत्वपूर्ण हैं। विभिन्न आकारों के ईवी भी अलग-अलग जैविक भूमिका निभाते हैं, जिसमें 50-200 एनएम एसईवी आरएनए, डीएनए और प्रोटीन को सही बाह्य स्थान पर सटीक रूप से वितरित करने में सक्षम है। एसईवी उनके स्राव तंत्र को निर्धारित करने में भी मदद करता है, जिसमें न केवल प्रतिरक्षा निगरानी, स्टेम सेल रखरखाव, रक्त जमावट और ऊतक की मरम्मत जैसी सामान्य शारीरिक प्रक्रियाओं का विनियमन शामिल है, बल्कि ट्यूमर की प्रगति और मेटास्टेसिस 2,3 जैसी कई बीमारियों को अंतर्निहित विकृति भी शामिल है। बायोमाकर्स की पहचान करने और भविष्य के दवा हस्तक्षेपों को डिजाइन करने के लिए एसईवी का प्रभावी अलगाव और विश्लेषण महत्वपूर्ण है।

एसईवी के नैदानिक अनुप्रयोग पर निरंतर शोध के साथ, एसईवी के अलगाव विधियों ने उच्च आवश्यकताओं को आगे बढ़ाया है। आकार, स्रोत और सामग्री में एसईवी की विविधता के साथ-साथ भौतिक रासायनिक और जैव रासायनिक गुणों में अन्य ईवी के साथ उनकी समानता के कारण, एसईवी अलगाव 4,5 के लिए कोई मानक विधि नहीं है। वर्तमान में, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), बहुलक वर्षा, और इम्यूनोफिनिटी कैप्चर सबसे आम एसईवीअलगाव विधियां हैं। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन अभी भी अनुसंधान में एसईवी अलगाव के लिए स्वर्ण मानक है, समय लेने वाला होने के बावजूद, जिसके परिणामस्वरूप 40-500 एनएम के व्यापक आकार के वितरण के साथ कम शुद्धता और दीर्घकालिक सेंट्रीफ्यूजेशन 7,8,9 के बाद एसईवी को महत्वपूर्ण यांत्रिक क्षति होती है। बहुलक वर्षा, जो आमतौर पर पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) का उपयोग करती है, बाह्य प्रोटीन समुच्चय और बहुलक संदूषण10,11 के सहवर्ती वर्षा के साथ बाद के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अस्वीकार्य शुद्धता से ग्रस्त है। इम्यूनोफिनिटी कैप्चर-आधारित विधियों को अलग-अलग विशिष्टता के साथ उच्च लागत वाले एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, साथ ही कम प्रसंस्करण मात्रा औरउपज 12,13,14 के साथ समस्याएं होती हैं। कण आकार पृथक एसईवी की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए मुख्य संकेतकों में से एक है। यद्यपि एसईवी शुद्धता एक अप्राप्य लक्ष्य बनी हुई है, एसईसी मध्यम घटकों की काफी मात्रा को हटा देता है, और एसईसी विधि द्वारा निकाले गए एसईवी कण मुख्य रूप से 50-200 एनएम15 की सीमा में होते हैं। मौजूदा तकनीकों के कुछ नुकसान हैं, जिनमें समय लेने वाली, कम शुद्धता, कम उपज, खराब प्रजनन क्षमता, नमूनों की कम थ्रूपुट और एसईवी की संभावित क्षति शामिल है, जो इसेनैदानिक उपयोग के साथ असंगत बनाती है। इस प्रकार, विभिन्न बायोफ्लुइड्स पर लागू एक तेजी से, सस्ती और आकार-निर्दिष्ट एसईवी अलगाव विधि कई शोध और नैदानिक स्थितियों में एक आवश्यक आवश्यकता है।

फ्लो साइटोमेट्री में, एकल कणों का विश्लेषण उच्च-थ्रूपुट, मल्टीपैरामीट्रिक तरीके से किया जाता है, और उपसमुच्चयको 17 में क्रमबद्ध किया जाता है। ईवी की विविधता के कारण, एक एकल-कण प्रवाह साइटोमेट्रिक माप आदर्श होगा, जिसका उपयोग सेल विश्लेषण के प्रतिमानों के बाद ईवी की जांच करने के लिए किया गया है, जिसमें शरीर विज्ञान से संबंधित विशेषताओं और प्रोटीन घटकों 18,19,20 की पहचान करने के लिए प्रकाश स्कैटर और फ्लोरेसेंस लेबल का उपयोग किया जा रहा है। फिर भी, पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री को एसईवी के छोटे आकार और सतह बायोमाकर्स की कम प्रचुरता से चुनौती दी जाती है। फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी), साइड स्कैटर (एसएससी), या फ्लोरेसेंस थ्रेशोल्ड ट्रिगरिंग पैरामीटर19 का उपयोग किए बिना पृष्ठभूमि शोर और एसईवी को अलग करने के लिए डिटेक्शन मापदंडों को अनुकूलित करके फ्लो साइटोमेट्री की संवेदनशीलता में सुधार किया जा सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्ट सेटिंग्स को मानक के रूप में फ्लोरोसेंट मोतियों का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था। उचित नोजल आकार, शीथ द्रव दबाव, थ्रेशोल्ड ट्रिगरिंग पैरामीटर और बिखरे हुए प्रकाश तीव्रता को नियंत्रित करने वाले वोल्टेज का चयन करके, हम एक जटिल मिश्रण से एसईवी के एक विशिष्ट उप-समूह को अलग करने में सक्षम थे।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) का एक संस्कृति माध्यम तैयार करें। मानव अग्नाशय के कैंसर सेल, पैनसी -1, को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर 75 सेमी2 कल्चर फ्लास्क में कल्चर करें। 5% CO2 के साथ 37 °C पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  2. सूक्ष्म अवलोकन के तहत कोशिका घनत्व 75% -80% तक पहुंचने पर कोशिकाओं की उपसंस्कृति। माध्यम को हटा दें, और 3-5 एमएल फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस; 0.01 एम, पीएच 7.2-7.4) के साथ 2x कुल्ला करें।
  3. समाधान को छोड़ दें, ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 1-2 एमएल जोड़ें, और कोशिकाओं को तब तक अलग होने दें जब तक कि वे माइक्रोस्कोप के नीचे माध्यम में गोल और निलंबित न हो जाएं। ताजा माध्यम जोड़ें, एस्पिरेट करें, और 15 एमएल संस्कृति माध्यम के साथ 75 सेमी2 कल्चर फ्लास्क में फैलाएं। 1: 2 से 1: 4 (अनुशंसित) के उप-खेती अनुपात का उपयोग करें।
    नोट: सेल संदूषण से बचने के लिए सभी ऑपरेशन एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में किए जाते हैं।

2. संस्कृति माध्यम संग्रह

  1. कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37 °C पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। दो 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सेल सुपरनैटेंट (90 एमएल) इकट्ठा करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. सतह पर तैरने वाले को नई बाँझ ट्यूबों और सेंट्रीफ्यूज में क्रमिक रूप से 20 मिनट के लिए 2,000 x g , 30 मिनट के लिए 10 000 x g और 4 °C पर 70 मिनट के लिए 12,000 x g पर स्थानांतरित करें।
  3. सतह पर तैरने वाला निकालें और धीरे से पाइप करके 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ गोली को धो लें। सेंट्रीफ्यूज 12,000 x g पर 70 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से शुरू होता है और ईवी का मिश्रण प्राप्त करने के लिए पीबीएस बफर के 10 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करता है।
  4. ईवी मिश्रण को मापने और आकार देने के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) करें। इंस्ट्रूमेंट ऑपरेशन संदर्भ मैनुअल और संदर्भ21 के अनुसार एनटीए विश्लेषण करें।

3. सेल सॉर्टिंग

  1. प्रवाह कक्ष सॉर्टर की मानक स्टार्टअप प्रक्रिया निष्पादित करें। स्टार्टअप बटन दबाकर मशीन चालू करें । लेजर नियंत्रण कक्ष पर लेजर पावर बटन क्लिक करें। तरल पदार्थ पर दबाव डालने के लिए स्मार्ट सैंपलर सबमेनू में टैंक बदलें बटन दबाएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अपशिष्ट टैंक खाली है, और शुरू करने से पहले शीथ टैंक भरा हुआ है।
  2. अल्ट्रासोनिक रूप से साफ किए गए 50 μm जेट-इन-एयर नोजल का उपयोग करें और इसे नोजल असेंबली पर स्थापित करें। दबाव कंसोल पर शीथ द्रव के लिए 80 पीएसआई और नमूना प्रवाह के लिए 80.3 पीएसआई पर दबाव समायोजित करें।
  3. शीथ स्ट्रीम बहने शुरू करने के लिए स्टार्ट शीथ फ्लो बटन दबाएं। स्मार्ट सैंपलर सबमेनू में बबल बटन पर क्लिक करें ताकि 10 मिनट के लिए स्वचालित रूप से डिबबल हो सके और फिर इसे बंद कर दें।
    नोट: सेल सॉर्टिंग के लिए, एयर स्प्रे नोजल के विभिन्न आकारों को तरल प्रवाह स्थिरता बनाए रखने के लिए अलग-अलग शीथ द्रव दबाव की आवश्यकता होती है। इस विधि में, 50 μm के नोजल का उपयोग किया गया था, और केवल 80 psi से अधिक या उसके बराबर शीथ द्रव दबाव स्थिर साइड स्ट्रीम उत्पन्न कर सकता था। नमूना प्रवाह और शीथ द्रव के बीच दबाव अंतर छंटाई की लोडिंग गति निर्धारित करता है। विधि की सेटिंग स्थिति के तहत (नमूना प्रवाह और म्यान द्रव के बीच दबाव का अंतर 0.3-0.6 पीएसआई है), तरल प्रवाह अपेक्षाकृत स्थिर था, और लोडिंग गति ने छंटाई दक्षता को 0.3-0.6 पीएसआई से कम दबाव अंतर के लिए 50% से 80% तक बढ़ाने में सक्षम बनाया।
  4. धारा को संरेखित करें और लेजर स्पॉट निर्धारित करें। पिनहोल पर धारा को देखने के लिए रोशनी कक्ष प्रकाश चालू करें। पिनहोल पर धारा को केंद्र में रखने और स्ट्रीम पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ऊपर और नीचे, बाएं और दाएं, और फ्रंट-एंड-बैक माइक्रोमीटर समायोजित करें।
  5. लेजर और स्ट्रीम इंटरसेप्ट टैब का चयन करें। लेजर इंटरसेप्ट और नोजल संरेखण अंशांकन प्रक्रिया को पूरा करने के लिए संकेत के रूप में ग्रीन एरो बटन को लगातार दबाएं।
  6. ठीक लेजर संरेखण स्क्रीन तक पहुंचें। X-अक्ष पैरामीटर के रूप में 640-722/44 (H) चैनल और Y-अक्ष पैरामीटर के रूप में 405-448/59 (H) चैनल का चयन करें। ट्रिगर पैरामीटर चयनकर्ता दबाएं और 488 एनएम लेजर का एसएससी पैरामीटर चुनें। सभी लेजर शटर खोलें।
    नोट: चुने गए एक्स-अक्ष और वाई-अक्ष पैरामीटर सिस्टम के लेजर कॉन्फ़िगरेशन पर निर्भर करते हैं। अन्य मापदंडों की अनुमति है यदि सिस्टम में 640 एनएम या 405 एनएम लेजर नहीं है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, पिनहोल पट्टी पर सबसे बड़े स्थानिक पृथक्करण के साथ लेजर का चयन करें (355 एनएम लेजर सहित नहीं)।
  7. 1 x 106 मोती प्रति एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए डबल डिस्टिल्ड पानी के 1 एमएल में एक बूंद जोड़कर इंद्रधनुष फ्लोरोसेंट कणों को पतला करें। नमूना कक्ष का दरवाजा खोलें और तैयार इंद्रधनुष फ्लोरोसेंट कणों की एक ट्यूब लोड करें।
  8. नमूना प्रारंभ करें बटन दबाएँ। प्रतिदीप्ति तीव्रता को अनुकूलित करने के लिए अप-एंड-डाउन माइक्रोमीटर समायोजित करें, जिससे प्रत्येक संकेत यथासंभव तीव्र हो जाए। स्वचालित रूप से QC निष्पादित करने के लिए टचस्क्रीन नियंत्रण कक्ष पर गुणवत्ता नियंत्रण प्रारंभ करें (QC) बटन दबाएँ।
  9. ड्रॉप देरी करें। सॉर्ट सेटअप स्क्रीन तक पहुंचें और ड्रॉप देरी बटन का चयन करें। IntelliSort प्रारंभिककरण बटन दबाएँ । उपकरण स्वचालित रूप से बूंद दोलन की आवृत्ति और आयाम को समायोजित करता है ताकि 25 ± 5 की ड्रॉप देरी प्राप्त की जा सके और ड्रॉप के ब्रेक-ऑफ बिंदु को स्पष्ट रूप से कल्पना करने में सक्षम हो सके। बनाए रखें बटन दबाएँ ।
  10. आउटपुट प्रकार को सॉर्ट करने के रूप में ट्यूब का चयन करें। सॉर्ट कक्ष में एक 15 एमएल ट्यूब धारक रखें। प्लेट वोल्टेज चालू करें और प्लेट वोल्टेज को लगभग 4000 वी पर सेट करें।
  11. स्ट्रीम सेटअप बटन का चयन करके परीक्षण पैटर्न चालू करें। यह सुनिश्चित करने के लिए चार्ज चरण स्लाइडर और विक्षेपण स्लाइडर समायोजित करें कि स्ट्रीम की छवि संग्रह ट्यूब के साथ पंक्तिबद्ध है। चेक मार्क बटन का चयन करें।
  12. कंप्यूटर पर Summit वर्कस्टेशन में लॉग इन करें। फ़ाइल मुख्य मेनू से एक नया प्रोटोकॉल बनाएँ। शिखर सॉफ्टवेयर नियंत्रण कक्ष में हिस्टोग्राम टैब का चयन करके एक डॉट प्लॉट बनाएं।
  13. कार्यक्षेत्र में नए डॉट प्लॉट के अक्षों पर राइट-क्लिक करें और एक्स-एक्सिस पैरामीटर के रूप में एफएससी और वाई-एक्सिस पैरामीटर के रूप में एसएससी चुनें। लघुगणकीय रूप में एफएससी और एसएससी प्रस्तुत करें।
  14. अधिग्रहण टैब का चयन करें और अधिग्रहण पैरामीटर पैनल का पता लगाएं। सक्षम मापदंडों के उप-मेनू में सभी संकेतों को सक्षम करें। ट्रिगर पैरामीटर के रूप में FSC चुनें और 0.01 की सीमा सेट करें। एफएससी बनाम एसएससी प्लॉट और आबादी को अलग करने के लिए 250 और 0.6 पर एफएससी और एसएससी के वोल्टेज और लाभ को समायोजित करें।
    नोट: थ्रेशोल्ड सेटिंग कण आकार सेट करने के बराबर है जिसे प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया जा सकता है। दहलीज जितनी बड़ी होगी, पता लगाए गए कण उतने ही बड़े होंगे, और छोटे कणों को दहलीज से काट दिया जाएगा और उनका पता नहीं लगाया जा सकता है। इस विधि में, सीमा 0.01 पर सेट की जाती है, इसलिए इलेक्ट्रॉनिक शोर से बड़े सभी कणों का पता लगाया जा सकता है।

4. एसईवी का अलगाव

  1. फ्लोरोसेंट पॉलीस्टाइनिन माइक्रोसेफर्स को 100 एनएम, 200 एनएम और 300 एनएम के निलंबन के लिए पतला करें। डबल डिस्टिल्ड पानी के 1 एमएल में 1 μL माइक्रोसेफर्स जोड़ें।
  2. माइक्रोसेफर्स निलंबन को क्रमिक रूप से लोड करें। शिखर सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण मेनू के तहत स्टार्ट का चयन करें और 20,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
    नोट: घटनाओं की संख्या वैकल्पिक है। सांख्यिकीय महत्व को पूरा करने के लिए कम से कम 5,000 घटनाओं की सिफारिश की जाती है।
  3. आयताकार बनाने के लिए एफएससी बनाम एसएससी डॉट प्लॉट पर राइट-क्लिक करें और इलेक्ट्रॉनिक शोर और 100 एनएम माइक्रोसेफर्स आबादी के क्षेत्रों को आकार और पुनर्स्थापित करने के लिए खींचें। क्षेत्रों को क्रमशः R7 और R4 के रूप में बदलने के लिए उन पर राइट-क्लिक करें। आयताकारों के साथ 200 एनएम और 300 एनएम माइक्रोसेफर्स को क्रमिक रूप से फ्रेम करने के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं और उन्हें क्रमशः आर 5 और आर 6 के रूप में नाम दें।
  4. अंत में, इलेक्ट्रॉनिक शोर के आधार पर 50-200 एनएम सॉर्टिंग क्षेत्र और आर 8 के रूप में परिभाषित 200 एनएम कणों की स्थिति निर्धारित करें।
    नोट: 50 एनएम की कम पहचान सीमा प्रवाह सेल सॉर्टर के इलेक्ट्रॉनिक शोर के ठीक ऊपर रखी गई है। शोर और 200 एनएम माइक्रोसेफर्स आबादी के बीच का क्षेत्र इसलिए 50-200 एनएम के बीच परिभाषित किया जा सकता है।
  5. सॉर्ट तर्क और सांख्यिकी पैनल में सॉर्ट निर्णय संपादित करें। बाएँ (L1) स्ट्रीम के रिक्त फ़ील्ड पर डबल-क्लिक करें. सॉर्ट लॉजिक बनाने के लिए R8 नाम के क्षेत्र का चयन करें। शुद्धता का गर्भपात मोड चुनें और एल 1 स्ट्रीम के लिए 1 बूंद का ड्रॉपलेट लिफाफा चुनें।
  6. चरण 2.3 से ईवी मिश्रण का 500 μL नमूना लोड करें। डेटा प्राप्त करने के लिए समिट में अधिग्रहण मेनू के तहत स्टार्ट बटन दबाएं, और फिर 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 50-200 एनएम एसईवी एकत्र करने के लिए सॉर्ट मेनू में स्टार्ट दबाएं ।
    नोट: किसी भी प्रक्रिया के दौरान संदूषण को कम करने के लिए एक बाँझ वातावरण आवश्यक है।
  7. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) द्वारा एसईवी की उपस्थिति का निरीक्षण करें और एनटीए का उपयोग करके एसईवी के कण आकार को सत्यापित करें। सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 मार्कर18 की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी धब्बा (डब्ल्यूबी) विश्लेषण करें।

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Representative Results

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए प्रवाह चार्ट आरेख चित्रा 1 में दिखाया गया है। इस विधि में, कण आकार वितरण के लिए संदर्भ मानकों के रूप में मानक आकार पॉलीस्टाइनिन माइक्रोसेफर्स का उपयोग किया गया था। विशिष्ट वाद्य पैरामीटर स्थिति के तहत, कण संकेत को लघुगणकीय रूप का उपयोग करके एफएससी बनाम एसएससी प्लॉट में पृष्ठभूमि शोर से स्पष्ट रूप से अलग किया जा सकता है। गेटिंग रणनीतियों को चित्रा 2 में दिखाया गया है। आर 4, आर 5, और आर 6 क्रमशः 100 एनएम, 200 एनएम और 300 एनएम माइक्रोसेफर्स की स्थिति को संदर्भित करते हैं। आर 7 50 एनएम से नीचे इलेक्ट्रॉनिक शोर की पहचान सीमा है, और आर 8 50-200 एनएम कणों की स्थिति सीमा है।

पैनसी -1 कोशिकाओं से प्राप्त ईवी मिश्रण का कण आकार वितरण अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद 40-400 एनएम की विस्तृत श्रृंखला में था (चित्रा 3)। 50-200 एनएम एसईवी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए, मानक माइक्रोसेफर्स (चित्रा 4) के स्थान के अनुसार विशिष्ट आकार एसईवी प्राप्त करने के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग की गई थी। अलगाव की गुणवत्ता को एनटीए द्वारा सत्यापित किया गया था, और यह पाया गया कि छंटाई के बाद एसईवी की कण आकार सीमा 50-200 एनएम (जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है) के बीच थी। एसईवी की उपस्थिति को टीईएम द्वारा आगे देखा गया था, जो चित्रा 6 ए में लाल तीरों द्वारा इंगित किया गया था, और अलग किए गए एसईवी में डब्ल्यूबी विश्लेषण (चित्रा 6 बी) द्वारा सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 के मार्कर होने की पुष्टि की गई थी।

Figure 1
चित्र 1. प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए प्रवाह चार्ट आरेख। ईवीएस मिश्रण प्राप्त करने के लिए पैनसी -1 सेल कल्चर माध्यम एकत्र और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज किया गया था। छंटाई मापदंडों को 50-200 एनएम एसईवी के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए अनुकूलित किया गया था जिसे एनटीए द्वारा सत्यापित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. एफएससी बनाम एसएससी प्लॉट में 50-200 एनएम आकार सीमा का पता लगाने के लिए मानक आकार के पॉलीस्टाइनिन माइक्रोसेफर्स का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। 100 एनएम, 200 एनएम और 300 एनएम माइक्रोसेफर्स के पतला निलंबन को एक प्रवाह साइटोमीटर द्वारा लोड और विश्लेषण किया गया था जैसा कि एफएससी बनाम एसएससी डॉट प्लॉट में दिखाया गया है। आर 4, आर 5, और आर 6 क्रमशः 100 एनएम, 200 एनएम और 300 एनएम कणों की स्थिति को संदर्भित करते हैं। आर 7 50 एनएम कणों के लिए पहचान सीमा के रूप में इलेक्ट्रॉनिक शोर है, और आर 8 50-200 एनएम कणों की स्थिति सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त ईवी के कण आकार वितरण का एनटीए विश्लेषण। विभिन्न कण आकारों के आवृत्ति वितरण को डेटा द्वारा कण प्रतिशत बनाम आकार के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. एकत्र किए गए ईवी नमूने का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। एफएससी बनाम एसएससी डॉट प्लॉट एक प्रवाह साइटोमीटर द्वारा लोड और विश्लेषण किए गए एकत्रित ईवी मिश्रण का एक नमूना दिखाता है। आर 8 क्षेत्र के भीतर 50-200 एनएम की आकार सीमा में एसईवी को क्रमबद्ध किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5. एनटीए का उपयोग करके छंटाई के बाद एसईवी के कण आकार वितरण का सत्यापन। प्रतिनिधि कण प्रतिशत बनाम आकार हिस्टोग्राम क्रमबद्ध एसईवी के आकार वितरण को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6. छंटाई द्वारा पृथक एसईवी का लक्षण वर्णन। (ए) क्रमबद्ध एसईवी की एक प्रतिनिधि टीईएम छवि (लाल तीर द्वारा इंगित)। स्केल बार = 200 एनएम। (बी) क्रमबद्ध एसईवी में सीडी 9, सीडी 81 और सीडी 63 मार्करों का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल फ्लो सेल सॉर्टर का उपयोग करके 50-200 एनएम के निर्दिष्ट कण आकार के साथ एसईवी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए एक अनुकूलित विधि की रूपरेखा तैयार करता है, जिसे एनटीए द्वारा मान्य किया गया था। विधि ने बड़े आकार के ईवी22 में लिपटे असंबंधित जैविक अणुओं से हस्तक्षेप से बचते हुए, समान कण आकार और उच्च शुद्धता के साथ एसईवी प्राप्त करने की अड़चन समस्या को हल किया। फ्लो साइटोमेट्री के साथ तेज, उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण संभव है, जो प्रति सेकंड 100,000 कणों को पकड़ सकता है और प्रति सेकंड 70,000 सॉर्टिंग निर्णयले सकता है, समय को बहुत कम कर सकता है और एसईवी कणों की विविधता को दर्शाता है। इसके अलावा, इस फ्लो साइटोमेट्री-आधारित प्रोटोकॉल को विशिष्ट आकार के ईवी की उप-आबादी में व्यक्तिगत हितों के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। वैकल्पिक गेट रेंज का उपयोग उपरोक्त के रूप में निर्धारित एक ही उपकरण मापदंडों के साथ रुचि की आबादी की पहचान करने और अलग करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एयर स्प्रे नोजल, शीथ द्रव दबाव, नमूना प्रवाह दबाव, और ट्रिगरिंग थ्रेशोल्ड पैरामीटर।

इस पद्धति की तकनीकी कठिनाई विभिन्न आकार सीमाओं के साथ आबादी के पृथक्करण में निहित है, विशेष रूप से पृष्ठभूमि शोर से अलग है। हमने महत्वपूर्ण प्रकार सेटिंग्स के एक पैनल की पहचान की। सबसे पहले, नोजल का आकार सॉर्टिंग दर को प्रभावित करता है। छंटाई द्वारा प्राप्त एसईवी की एकाग्रता में सुधार करने के लिए, इस विधि में 50 μm नोजल का उपयोग किया जाता है, और साइड स्ट्रीम को स्थिर करने के लिए 80 psi म्यान द्रव दबाव की आवश्यकता होती है। उच्च शीथ द्रव दबाव के साथ, ड्रॉप आवृत्तियों में वृद्धि होती है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च घटना दर और कम छंटाई समय23 होता है। हालांकि, शीथ द्रव दबाव बढ़ने से एफएससी और फ्लोरेसेंस सिग्नल की संवेदनशीलता कम हो जाती है क्योंकि लेजर से गुजरने में कम समय लगता है और डिटेक्टर24 तक पहुंचने वाले फोटॉनों की संख्या होती है। विशेष रूप से, इस दबाव में साइड स्ट्रीम की स्थिरता को बनाए रखना मुश्किल है, जिसके लिए नोजल और पाइपलाइन की उच्च सफाई की आवश्यकता होती है। दूसरा, प्रयोगात्मक सफलता की संभावना को बढ़ाने के लिए नोजल की अल्ट्रासोनिक सफाई और फ्लो साइटोमेट्री पाइप की फ्लशिंग की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। अंत में, वोल्टेज और लाभ जनसंख्या पृथक्करण के लिए महत्वपूर्ण हैं, खासकर छोटे आकार के कणों के लिए। यहां, 250 वी का वोल्टेज और 0.6 का लाभ प्रभावी रूप से एफएससी ट्रिगरिंग के साथ 50-200 एनएम पर एसईवी को अलग कर सकता है और लघुगणकीय रूप में प्लॉट कर सकता है।

दृष्टिकोण की एक चेतावनी यह है कि कुछ मामलों में, सॉर्टिंग प्रक्रिया के दौरान एसईवी की एकाग्रता बहुत अधिक है, या एसईवी कुल है, जिससे एकल-कण निलंबन प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है। अति-प्रवर्धित संकेत के कारण समेकित एसईवी को छोड़ दिया जाएगा।

सामूहिक रूप से, फ्लो साइटोमेट्री के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के फायदों के साथ, इस विधि ने नोजल आकार, शीथ द्रव दबाव, नमूना प्रवाह दबाव और ट्रिगरिंग थ्रेशोल्ड पैरामीटर को अनुकूलित किया, जिससे 50-200 एनएम एसईवी का सफल अलगाव हुआ। इसके अलावा, न केवल यह विधि विशिष्ट आकार के कणों के पृथक्करण की अनुमति देती है, बल्कि यह एंटीजन अभिव्यक्ति के आधार पर एसईवी के तुल्यकालिक वर्गीकरण या प्रोटिओम विश्लेषण की भी अनुमति देती है, जिससे कई डाउनस्ट्रीम अनुसंधान अनुप्रयोग खुलते हैं।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को झेजियांग चीनी चिकित्सा विश्वविद्यालय (2020जेडजी 29) के वैज्ञानिक अनुसंधान कोष, झेजियांग प्रांत की बुनियादी सार्वजनिक कल्याण अनुसंधान परियोजना (एलजीएफ 19 एच 150006, एलटीजीवाई 23 बी 070001), झेजियांग प्रांतीय शिक्षा विभाग की परियोजना (वाई 202147028) और झेजियांग विश्वविद्यालय प्रयोगशाला विभाग (एसजेएस 201712, एसवाईबी 202020) की प्रायोगिक प्रौद्योगिकी की परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge tube Beckman Coulter 344058
Culture flasks Corning  430641
Dulbecco’s modified eagle medium Corning Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum SUER SUER050QY
Flow cell sorter Beckman Coulter Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1 NA NA PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer  Malvern Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline Gibco C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres Beckman Coulter 6602336
Transmission electron microscopy JEOL JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution Gibco 1713949
Ultra rainbow fluorescent particles Beckman Coulter B28479
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor Beckman Coulter SW32TI

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उच्च-थ्रूपुट अलगाव और छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के शुद्धिकरण के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग मापदंडों का अनुकूलन
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Song, X., Shen, H., Li, Y., Xing,… More

Song, X., Shen, H., Li, Y., Xing, Y., Wang, J., Guo, C., Huang, Y., Chen, J. Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (191), e64360, doi:10.3791/64360 (2023).

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