Summary
Denne protokollen gir en rask og størrelsesspesifikk isolasjonsmetode for små ekstracellulære vesikler ved å optimalisere størrelsen på luftspraydysen, kappevæsketrykk, prøvestrømningstrykk, spenning, forsterkning og utløsende terskelparametere.
Abstract
Små ekstracellulære vesikler (sEV) kan frigjøres fra alle celletyper og bære protein, DNA og RNA. Signalmolekyler tjener som indikatorer på en celles fysiologiske og patologiske tilstand. Imidlertid er det ingen standardmetode for sEV-isolasjon, som forhindrer nedstrøms biomarkøridentifikasjon og legemiddelintervensjonsstudier. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for isolering og rensing av 50-200 nm sEV av en flytcellesorterer. For dette ble en 50 μm dyse og 80 psi hylstervæsketrykk valgt for å oppnå en god sorteringshastighet og stabil sidestrøm. Standard størrelse polystyren mikrosfærer ble brukt til å lokalisere populasjoner av 100, 200 og 300 nm partikler. Med ytterligere optimalisering av utløserterskelen for spenning, forsterkning og fremoverspredning (FSC), kan sEV-signalet skilles fra bakgrunnsstøyen. Disse optimaliseringene gir et panel med kritiske sorteringsinnstillinger som gjør det mulig å få en representativ populasjon av sEV bare ved hjelp av FSC vs. sidespredning (SSC). Den flowcytometribaserte isolasjonsmetoden tillater ikke bare analyse med høy gjennomstrømning, men tillater også synkron klassifisering eller proteomanalyse av sEV basert på biomarkøruttrykket, noe som åpner mange nedstrøms forskningsapplikasjoner.
Introduction
En celle frigjør ekstracellulære vesikler (EV) av varierende størrelser som resulterer i signalmolekyler og membraninneslutninger, som er viktige for intercellulær kommunikasjon1. Elbiler av forskjellige størrelser spiller også forskjellige biologiske roller, med 50-200 nm sEV som nøyaktig kan distribuere RNA, DNA og proteiner til riktig ekstracellulær plassering. sEV hjelper også med å bestemme sekresjonsmekanismene deres, og involverer ikke bare regulering av normale fysiologiske prosesser som immunovervåking, vedlikehold av stamceller, blodkoagulasjon og vevsreparasjon, men også patologien som ligger til grunn for flere sykdommer som tumorprogresjon og metastase 2,3. Effektiv isolering og analyse av sEV er avgjørende for å identifisere biomarkører og designe fremtidige legemiddelintervensjoner.
Med kontinuerlig forskning på den kliniske anvendelsen av sEV, har isolasjonsmetodene til sEV stilt høyere krav. På grunn av heterogeniteten til sEV i størrelse, kilde og innhold, samt deres likhet med andre elbiler i fysisk-kjemiske og biokjemiske egenskaper, er det ingen standardmetode for sEV-isolasjon 4,5. For tiden er ultrasentrifugering, størrelsesekskluderingskromatografi (SEC), polymerutfelling og immunaffinitetsfangst de vanligste sEV-isolasjonsmetodene6. Ultrasentrifugering er fortsatt gullstandarden for sEV-isolasjon i forskning, til tross for at det er tidkrevende, noe som resulterer i lav renhet med en bred størrelsesfordeling på 40-500 nm og betydelig mekanisk skade på sEV etter langvarig sentrifugering 7,8,9. Polymerutfelling, som vanligvis bruker polyetylenglykol (PEG), lider av uakseptabel renhet for etterfølgende funksjonell analyse med samtidig utfelling av ekstracellulære proteinaggregater og polymerforurensning10,11. Fangstbaserte metoder for immunaffinitet krever kostbare antistoffer med varierende spesifisitet, samt har problemer med lavt prosesseringsvolum og gir12,13,14. Partikkelstørrelse er en av hovedindikatorene for å evaluere renheten til isolert sEV. Selv om sEV-renhet fortsatt er et uoppnåelig mål, fjerner SEC en betydelig mengde mediumkomponenter, og sEV-partiklene ekstrahert ved SEC-metoden ligger hovedsakelig i området 50-200 nm15. De eksisterende teknikkene har noen ulemper, inkludert men ikke begrenset til å være tidkrevende, lav renhet, lavt utbytte, dårlig reproduserbarhet, lav gjennomstrømning av prøver og potensiell skade på sEV, noe som gjør den uforenlig med klinisk bruk16. Dermed er en rask, billig og størrelsesspesifisert sEV-isolasjonsmetode som gjelder for forskjellige biofluider et viktig behov i flere forsknings- og kliniske situasjoner.
I flowcytometri analyseres enkeltpartikler på en multiparametrisk måte med høy gjennomstrømning, og delmengder sorteres ut17. På grunn av heterogeniteten til elbiler, ville en cytometrisk måling av enkeltpartikkelstrøm være ideell, som har blitt brukt til å undersøke elbiler etter paradigmene for celleanalyse, med lysspredning og fluorescensetiketter som brukes til å identifisere fysiologiske egenskaper og proteinkomponenter18,19,20. Likevel utfordres konvensjonell flowcytometri av den lille størrelsen på sEV og lav overflod av overflatebiomarkører. Sensitiviteten til flowcytometri kan forbedres ved å optimalisere deteksjonsparametere for å skille bakgrunnsstøy og sEV uavhengig av bruk av fremoverspredning (FSC), sidespredning (SSC) eller fluorescensgrenseutløsende parameter19.
Med den nåværende protokollen ble høyoppløselige flowcytometriske sorteringsinnstillinger optimalisert ved bruk av fluorescerende perler som standard. Ved å velge riktig dysestørrelse, kappevæsketrykk, terskelutløsende parameter og spenninger som kontrollerer spredte lysintensiteter, var vi i stand til å isolere en spesifikk delmengde av sEV fra en kompleks blanding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Forbered et dyrkningsmedium av Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS). Dyrkning av humane kreftceller i bukspyttkjertelen, PANC-1, i en 75 cm2 kulturkolbe med en tetthet på 1 x 106 celler/ml. Inkuber kulturen ved 37 °C med 5 % CO2.
- Subkultur cellene når celletettheten når 75% -80% under mikroskopisk observasjon. Fjern mediet, og skyll 2x med 3-5 ml fosfatbuffer saltvann (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
- Kast løsningen, tilsett 1-2 ml trypsin-EDTA-løsning, og la cellene løsne til de blir avrundet og suspendert i mediet under mikroskopet. Tilsett friskt medium, aspirat og spred i 75 cm2 kulturflasker med 15 ml kulturmedium. Bruk et underdyrkingsforhold på 1:2 til 1:4 (anbefalt).
MERK: Alle operasjoner utføres i et biosikkerhetsskap for å unngå celleforurensning.
2. Kultur medium samling
- Inkuber cellene i 48 timer ved 37 °C med 5% CO2. Samle cellesupernatant (90 ml) i to 50 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til nye sterile rør og sentrifuge suksessivt ved 2000 x g i 20 minutter, 10 000 x g i 30 minutter og 12 000 x g i 70 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og skyll pelleten med 10 ml PBS ved å pipettere forsiktig. Sentrifuge ved 12 000 x g i 70 minutter ved 4 °C igjen og resuspendere pelleten i 10 ml PBS-buffer for å oppnå en blanding av elbiler.
- Utfør nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) for å kvantifisere og dimensjonere EV-blandingen. Utfør NTA-analysen i henhold til instrumentoperasjonsreferansehåndboken og referanse21.
3. Cell sortering
- Utfør standard oppstartsprosedyre for flytcellesorteringen. Slå PÅ maskinen ved å trykke på oppstartsknappen . Klikk på Laser Power-knappen på laserkontrollpanelet. Trykk på Endre tanker-knappen i den smarte sampler-undermenyen for å trykksette fluidikken.
NOTAT: Forsikre deg om at avfallstanken er tom, og at kappetanken er full før du starter opp. - Bruk en ultrasonisk rengjort 50 μm jet-i-luft-dyse og installer den på dyseenheten. Juster trykket til 80 psi for hylstervæske og 80,3 psi for prøvestrøm på trykkkonsollen.
- Trykk på Start Sheath Flow-knappen for å starte kappestrømmen som strømmer. Klikk på bobleknappen i undermenyen smart sampler for å deboble automatisk i 10 minutter og deretter slå den av.
MERK: For cellesortering krever forskjellige størrelser på luftspraydyser forskjellige kappevæsketrykk for å opprettholde væskestrømningsstabilitet. I denne metoden ble en dyse på 50 μm brukt, og bare et kappevæsketrykk større enn eller lik 80 psi kunne generere stabile sidestrømmer. Trykkforskjellen mellom prøvestrømmen og hylstervæsken bestemmer lastehastigheten for sorteringen. Under innstillingsbetingelsen for metoden (trykkforskjellen mellom prøvestrømmen og kappevæsken er 0,3-0,6 psi), var væskestrømmen relativt stabil, og lastehastigheten gjorde det mulig å sortere effektiviteten til 80% fra 50% for trykkforskjell mindre enn 0,3-0,6 psi. - Juster strømmen og bestem laserpunktet. Slå PÅ lyset i belysningskammeret for å se strømmen over knappenålshullene. Juster mikrometerne opp-og-ned, venstre og høyre og foran og bak for å sentrere strømmen på knappenålshullet og fokusere strømmen.
- Velg kategorien Laser and Stream Intercept . Trykk kontinuerlig på den grønne pilknappen når du blir bedt om å fullføre kalibreringsprosessen for laserskjæring og dysejustering.
- Få tilgang til den fine laserjusteringsskjermen. Velg kanalen 640-722/44 (H) som X-akseparameter og 405-448/59 (H)- kanal som parameter for Y-aksen. Trykk på utløserparametervelgeren og velg SSC-parameteren til laseren på 488 nm. Åpne alle laserskodder.
MERK: De valgte X-akse- og Y-akseparametrene avhenger av laserkonfigurasjonen til systemet. Andre parametere er tillatt hvis systemet ikke har en 640 nm eller 405 nm laser. For best resultat, velg lasere med størst romlig separasjon på pinhole stripe (ikke inkludert 355 nm laser). - Fortynn regnbuefluorescerende partikler ved å tilsette en dråpe i 1 ml dobbeltdestillert vann for en endelig konsentrasjon på 1 x 106 perler per ml. Åpne døren til prøvekammeret og legg et rør av de tilberedte regnbuefluorescerende partiklene.
- Trykk på Start prøve-knappen . Juster opp-og-ned mikrometer for å optimalisere fluorescensintensiteten, slik at hvert signal blir så intenst som mulig. Trykk på Start kvalitetskontroll (QC) på berøringsskjermens kontrollpanel for å utføre QC automatisk.
- Utfør slippforsinkelse. Gå til skjermbildet for sorteringsoppsett og velg slippforsinkelsesknappen. Trykk IntelliSort-initialiseringsknappen . Instrumentet justerer automatisk frekvensen og amplituden til dråpeoscillasjonen for å oppnå fallforsinkelsen på 25 ± 5 og være i stand til å visualisere avbruddspunktet til dråpen tydelig. Trykk på Vedlikehold-knappen .
- Velg rør som sorteringsutdatatype. Plasser en 15 ml rørholder i sorteringskammeret. Skru platespenningen PÅ og sett platespenningen til ca. 4000 V.
- Slå på testmønsteret ved å velge Strømoppsett-knappen . Juster glidebryteren for ladefase og avbøyning for å sikre at bildet av strømmen er på linje med oppsamlingsrøret. Velg hakeknappen .
- Logg på Summit-arbeidsstasjonen på datamaskinen. Opprett en ny protokoll fra Fil-hovedmenyen. Opprett et punktdiagram ved å velge histogramfanen i kontrollpanelet til Summit-programvaren.
- Høyreklikk aksene til det nye punktdiagrammet i arbeidsområdet, og velg FSC som X-akseparameter og SSC som parameter for Y-aksen. Presentere FSC og SSC i logaritmisk form.
- Velg kategorien Brukeranskaffelse , og finn panelet for anskaffelsesparametere. Aktiver alle signaler i undermenyen for å aktivere parametere. Velg FSC som utløserparameter og angi terskelen på 0,01. Juster spenningen og forsterkningen til FSC og SSC ved 250 og 0,6 for å sikre at hendelser innenfor FSC vs. SSC-plottet og populasjoner er atskilt.
MERK: Terskelinnstilling tilsvarer innstilling av partikkelstørrelsen som kan detekteres ved flowcytometri. Jo større terskelen er, desto større vil de oppdagede partiklene være, og de små partiklene vil bli avskåret av terskelen og kan ikke oppdages. I denne metoden er terskelen satt til 0, 01, slik at alle partikler større enn elektronisk støy kan detekteres.
4. Isolering av sEV
- Fortynn fluorescerende polystyrenmikrosfærer til suspensjoner på 100 nm, 200 nm og 300 nm. Tilsett 1 μL mikrosfærer til 1 ml dobbeltdestillert vann.
- Fyll mikrosfærefjæringen suksessivt. Velg Start under anskaffelsesmenyen i toppmøteprogramvaren og registrer 20 000 eventer.
MERK: Antall hendelser er valgfritt. Ikke mindre enn 5000 hendelser anbefales for å møte statistisk signifikans. - Høyreklikk på FSC vs. SSC-punktplottet for å lage rektangler og dra for å endre størrelse på og flytte regionene med elektronisk støy og 100 nm mikrosfærepopulasjon. Høyreklikk på regionene for å gi dem nytt navn til henholdsvis R7 og R4. Gjenta trinnene ovenfor for å ramme inn mikrosfærene på 200 nm og 300 nm med rektangler suksessivt og gi dem nytt navn til henholdsvis R5 og R6.
- Til slutt bestemmer du sorteringsområdet på 50-200 nm basert på den elektroniske støyen og posisjonen til 200 nm partikler definert som R8.
MERK: Den nedre deteksjonsgrensen på 50 nm er plassert like over den elektroniske støyen fra flytcellesortereren. Området mellom støyen og 200 nm mikrosfærepopulasjonen kan derfor defineres til å være mellom 50-200 nm. - Rediger sorteringsbeslutninger i panelet for sorteringslogikk og statistikk. Dobbeltklikk på det tomme feltet til den venstre (L1) strømmen. Velg området R8 for å opprette sorteringslogikken. Velg Abort-modus for renhet, og velg en dråpekonvolutt med 1 dråpe for L1-strømmen.
- Last inn 500 μL prøve av EV-blanding fra trinn 2.3. Trykk på Start-knappen under innsamlingsmenyen i Summit for å hente data, og trykk deretter på Start i sorteringsmenyen for å samle 50-200 nm sEV inn i et 15 ml sentrifugerør.
MERK: Et sterilt miljø er nødvendig for å minimere forurensning under enhver prosedyre. - Observer tilstedeværelsen av sEV ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og verifiser partikkelstørrelsen til sEV ved bruk av NTA. Utfør western blot-analyse (WB) for ytterligere å bekrefte uttrykket av CD9-, CD63- og CD81-markører18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flytskjemadiagrammet for den eksperimentelle protokollen er vist i figur 1. I denne metoden ble polystyrenmikrosfærer i standardstørrelse brukt som referansestandarder for partikkelstørrelsesfordeling. Under den spesifikke instrumentelle parameterbetingelsen kunne partikkelsignalet tydelig skilles fra bakgrunnsstøyen i FSC vs. SSC-plottet ved hjelp av den logaritmiske formen. Gating strategier er vist i figur 2. R4, R5 og R6 refererer til posisjonene til henholdsvis 100 nm, 200 nm og 300 nm mikrosfærer. R7 er deteksjonsgrensen for elektronisk støy under 50 nm, og R8 er posisjonsområdet på 50-200 nm partikler.
Partikkelstørrelsesfordelingen av EV-blandingen avledet fra PANC-1-celler var i det brede området 40-400 nm etter ultrasentrifugering (figur 3). For å isolere og rense 50-200 nm sEV ble flowcytometrisk sortering utført for å oppnå den spesifikke størrelsen sEV i henhold til plasseringen av standard mikrosfærer (figur 4). Kvaliteten på isolasjonen ble verifisert av NTA, og det ble funnet at partikkelstørrelsesområdet for sEV etter sortering var mellom 50-200 nm (som vist i figur 5). Tilstedeværelsen av sEV ble videre observert av TEM, indikert med røde piler i figur 6A, og de isolerte sEVene ble bekreftet å inneholde markører for CD9, CD63 og CD81 ved WB-analyse (figur 6B).
Figur 1. Flytskjema for den eksperimentelle protokollen. PANC-1 cellekulturmedium ble samlet inn og ultrasentrifugert for å oppnå EV-blandingen. Sorteringsparametrene ble optimalisert for isolering og rensing av 50-200 nm sEV som ble verifisert av NTA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Flowcytometrianalyse av polystyrenmikrosfærer i standardstørrelse for å lokalisere størrelsesområdet 50-200 nm i FSC vs. SSC-plottet. Fortynnede suspensjoner på 100 nm, 200 nm og 300 nm mikrosfærer ble lastet og analysert av et strømningscytometer som vist i FSC vs. SSC-punktplottet. R4, R5 og R6 refererer til posisjonene til henholdsvis 100 nm, 200 nm og 300 nm partikler. R7 er den elektroniske støyen som deteksjonsgrense for 50 nm partikler, og R8 representerer posisjonsområdet på 50-200 nm partikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. NTA-analyse av partikkelstørrelsesfordeling av EVer oppnådd ved ultrasentrifugering. Frekvensfordelingen av forskjellige partikkelstørrelser er representert ved dataene som partikkelprosent vs. størrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Flowcytometrianalyse av den innsamlede EV-prøven. FSC vs. SSC-punktplottet viser en prøve av den innsamlede EV-blandingen lastet og analysert av et strømningscytometer. SEV i størrelsesområdet 50-200 nm i R8-regionen ble sortert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Verifikasjon av partikkelstørrelsesfordeling av sEV etter sortering med NTA. Representativ partikkelprosent vs. størrelseshistogram viser størrelsesfordelingen til den sorterte sEV. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Karakterisering av sEV isolert ved sortering. (A) Et representativt TEM-bilde av sortert sEV (indikert med røde piler). Skala bar = 200 nm. (B) Western blot-analyse av CD9-, CD81- og CD63-markører i den sorterte sEV. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen skisserer en optimalisert metode for å isolere og rense sEV med den spesifiserte partikkelstørrelsen på 50-200 nm ved hjelp av en flytcellesorterer, som ble validert av NTA. Metoden løste flaskehalsproblemet med å oppnå sEV med jevn partikkelstørrelse og høy renhet, og unngikk interferens fra ikke-relaterte biologiske molekyler pakket inn i store elbiler22. Raske analyser med høy gjennomstrømning er mulig med flowcytometri, som kan fange 100 000 partikler per sekund og ta 70 000 sorteringsbeslutninger per sekund17, noe som reduserer tiden betydelig og reflekterer heterogeniteten til sEV-partikler. Videre kan denne flowcytometribaserte protokollen tilpasses basert på individuelle interesser i underpopulasjoner av elbiler av spesifikke størrelser. Alternative portområder kan brukes til å identifisere og isolere populasjonene av interesse med de samme instrumentparametrene som er angitt ovenfor, for eksempel luftsprøytedyse, kappevæsketrykk, prøvestrømningstrykk og utløserterskelparameter.
Den tekniske vanskeligheten med denne metoden ligger i separasjon av populasjoner med forskjellige størrelsesområder, spesielt skille fra bakgrunnsstøy. Vi identifiserte et panel med kritiske sorteringsinnstillinger. For det første påvirker dysens størrelse sorteringshastigheten. For å forbedre konsentrasjonen av sEV oppnådd ved sortering, brukes en 50 μm dyse i denne metoden, og 80 psi kappevæsketrykk er nødvendig for å stabilisere sidestrømmen. Med høyere hylstervæsketrykk øker fallfrekvensene, noe som resulterer i høyere hendelsesrater og kortere sorteringstid23. Imidlertid demper økende kappevæsketrykk følsomheten til FSC- og fluorescenssignaler på grunn av den reduserte tiden det tar å passere gjennom laseren og antall fotoner som når detektoren24. Spesielt er det vanskelig å opprettholde stabiliteten til sidestrømmen under dette trykket, noe som krever høy renhet av dysen og rørledningen. For det andre anbefales ultralydrengjøring av dysen og spyling av strømningscytometrirør sterkt for å øke sannsynligheten for eksperimentell suksess. Til slutt er spenning og forsterkning kritisk for populasjonsseparasjon, spesielt for partikler av liten størrelse. Her kan en spenning på 250 V og forsterkning på 0,6 effektivt skille sEV ved 50-200 nm med FSC-utløsning og plott i logaritmisk form.
En advarsel ved tilnærmingen er at i noen tilfeller er konsentrasjonen av sEV for høy, eller sEV-aggregatet, under sorteringsprosessen, noe som gjør det vanskelig å oppnå en enkeltpartikkelsuspensjon. Den aggregerte sEV vil bli forkastet på grunn av det overforsterkede signalet.
Samlet, med fordelene med høy gjennomstrømningsanalyse av flowcytometri, optimaliserte denne metoden dysestørrelse, kappevæsketrykk, prøvestrømningstrykk og utløserterskelparameter som førte til vellykket isolering av 50-200 nm sEV. Dessuten tillater ikke bare denne metoden separasjon av partikler av spesifikk størrelse, men den tillater også synkron klassifisering eller proteomanalyse av sEV basert på antigenuttrykk, noe som åpner for mange nedstrøms forskningsapplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det vitenskapelige forskningsfondet ved Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), det grunnleggende offentlige velferdsforskningsprosjektet i Zhejiang-provinsen (LGF19H150006, LTGY23B070001), prosjektet til Zhejiang Provincial Department of Education (Y202147028) og prosjektet for eksperimentell teknologi ved Zhejiang University Laboratory Department (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
