Summary
Bu protokol, hava püskürtme nozulunun boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, numune akış basıncını, voltajı, kazancı ve tetikleyici eşik parametrelerini optimize ederek küçük hücre dışı veziküller için hızlı ve boyuta özgü bir izolasyon yöntemi sağlar.
Abstract
Küçük hücre dışı veziküller (sEV) tüm hücre tiplerinden salınabilir ve protein, DNA ve RNA taşıyabilir. Sinyal molekülleri, bir hücrenin fizyolojik ve patolojik durumunun göstergeleri olarak hizmet eder. Bununla birlikte, aşağı akış biyobelirteci tanımlamasını ve ilaç müdahale çalışmalarını önleyen sEV izolasyonu için standart bir yöntem yoktur. Bu yazıda, bir akış hücresi sıralayıcısı ile 50-200 nm sEV'nin izolasyonu ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bunun için, iyi bir sıralama hızı ve kararlı bir yan akış elde etmek için 50 μm'lik bir nozul ve 80 psi kılıf sıvı basıncı seçildi. Standart boyutlu polistiren mikrosferler, 100, 200 ve 300 nm parçacıkların popülasyonlarını bulmak için kullanıldı. Voltaj, kazanç ve ileri saçılma (FSC) tetikleme eşiğinin ek optimizasyonu ile sEV sinyali arka plan gürültüsünden ayrılabilir. Bu optimizasyonlar, yalnızca FSC ve yan saçılma (SSC) kullanarak temsili bir sEV popülasyonu elde edilmesini sağlayan kritik sıralama ayarlarından oluşan bir panel sağlar. Akış sitometrisi tabanlı izolasyon yöntemi sadece yüksek verimli analize izin vermekle kalmaz, aynı zamanda biyobelirteç ekspresyonuna dayalı sEV'nin senkron sınıflandırmasına veya proteom analizine izin vererek çok sayıda aşağı akış araştırma uygulaması açar.
Introduction
Bir hücre, hücreler arası iletişim için önemli olan sinyal molekülleri ve membran kapanımları ile sonuçlanan çeşitli boyutlarda hücre dışı vezikülleri (EV'ler) serbest bırakır1. Farklı boyutlardaki EV'ler de farklı biyolojik roller oynar, 50-200 nm sEV, RNA, DNA ve proteinleri doğru hücre dışı konuma hassas bir şekilde dağıtabilir. sEV ayrıca, sadece immün sürveyans, kök hücre bakımı, kan pıhtılaşması ve doku onarımı gibi normal fizyolojik süreçlerin düzenlenmesini değil, aynı zamanda tümör ilerlemesi ve metastaz 2,3 gibi çeşitli hastalıkların altında yatan patolojiyi de içeren salgı mekanizmalarını belirlemeye yardımcı olur. sEV'nin etkili izolasyonu ve analizi, biyobelirteçlerin tanımlanması ve gelecekteki ilaç müdahalelerinin tasarlanması için kritik öneme sahiptir.
sEV'nin klinik uygulaması üzerine yapılan sürekli araştırmalarla, sEV'nin izolasyon yöntemleri daha yüksek gereksinimler ortaya koymuştur. sEV'nin boyut, kaynak ve içerik bakımından heterojenliğinin yanı sıra fizikokimyasal ve biyokimyasal özelliklerde diğer EV'lerle benzerliği nedeniyle, sEV izolasyonu 4,5 için standart bir yöntem yoktur. Şu anda, ultrasantrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi (SEC), polimer çökeltme ve immünoaffinite yakalama en yaygın sEV izolasyon yöntemleridir6. Ultra santrifüjleme, zaman alıcı olmasına rağmen, araştırmada sEV izolasyonu için hala altın standarttır, bu da 40-500 nm'lik geniş bir boyut dağılımı ile düşük saflığa ve uzun süreli santrifüjlemeden sonra sEV'ye önemli mekanik hasara neden olur 7,8,9. Genellikle polietilen glikol (PEG) kullanan polimer çökeltmesi, hücre dışı protein agregalarının eşzamanlı çökelmesi ve polimer kontaminasyonu10,11 ile sonraki fonksiyonel analizler için kabul edilemez saflıktan muzdariptir. İmmünoaffinite yakalama tabanlı yöntemler, farklı özgüllüklere sahip yüksek maliyetli antikorlar gerektirir, ayrıca düşük işlem hacmi ve verim12,13,14 ile ilgili problemleri vardır. Partikül boyutu, izole edilmiş sEV'nin saflığını değerlendirmek için ana göstergelerden biridir. Her ne kadar sEV saflığı ulaşılamaz bir hedef olmaya devam etse de, SEC önemli miktarda orta bileşeni ortadan kaldırır ve SEC yöntemiyle ekstrakte edilen sEV parçacıkları esas olarak 50-200 nm15 aralığındadır. Mevcut tekniklerin zaman alıcı, düşük saflık, düşük verim, zayıf tekrarlanabilirlik, düşük numune verimi ve sEV'nin potansiyel hasarı dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birkaç dezavantajı vardır, bu da onu klinik kullanımla uyumsuz hale getirir16. Bu nedenle, çeşitli biyosıvılara uygulanabilir hızlı, ucuz ve boyut olarak belirlenmiş bir sEV izolasyon yöntemi, çeşitli araştırma ve klinik durumlarda önemli bir ihtiyaçtır.
Akış sitometrisinde, tek parçacıklar yüksek verimli, multiparametrik bir şekilde analiz edilir ve alt kümeler17'ye ayrılır. EV'lerin heterojenliği nedeniyle, hücre analizi paradigmalarını takip eden EV'leri araştırmak için kullanılan tek parçacıklı bir akış sitometrik ölçümü ideal olacaktır, fizyoloji ile ilgili özellikleri ve protein bileşenlerini tanımlamak için ışık saçılımı ve floresan etiketleri kullanılmaktadır18,19,20. Bununla birlikte, geleneksel akış sitometrisi, küçük boyutlu sEV'ler ve düşük yüzey biyobelirteçleri bolluğu ile zorlanmaktadır. Akış sitometrisinin hassasiyeti, ileri saçılma (FSC), yan saçılma (SSC) veya floresan eşiği tetikleyici parametre19 kullanılmasına bakılmaksızın arka plan gürültüsünü ve sEV'yi ayırt etmek için algılama parametrelerini optimize ederek geliştirilebilir.
Mevcut protokolle, yüksek çözünürlüklü akış sitometrik sıralama ayarları, standart olarak floresan boncuklar kullanılarak optimize edildi. Uygun nozul boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, eşik tetikleme parametresini ve dağınık ışık yoğunluklarını kontrol eden voltajları seçerek, sEV'nin belirli bir alt kümesini karmaşık bir karışımdan izole edebildik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü
- %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) bir kültür ortamını hazırlayın. İnsan pankreas kanseri hücresi PANC-1'i, 1 x 106 hücre / mL yoğunluğunda 75cm2'lik bir kültür şişesinde kültürleyin. Kültürü 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin.
- Mikroskobik gözlem altında hücre yoğunluğu %75-%80'e ulaştığında hücreleri alt kültüre alır. Ortamı çıkarın ve 3-5 mL fosfat tampon salin (PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4) ile 2 kat durulayın.
- Çözeltiyi atın, 1-2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve hücrelerin mikroskop altındaki ortamda yuvarlanıp asılana kadar ayrılmasına izin verin. Taze ortam ekleyin, aspire edin ve 15 mL kültür ortamı ile 75cm2 kültür şişelerine dağıtın. 1:2 ila 1:4 arasında bir alt yetiştirme oranı kullanın (önerilir).
NOT: Tüm işlemler, hücre kontaminasyonunu önlemek için bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.
2. Kültür ortamı koleksiyonu
- Hücreleri %5 CO2 ile 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. İki adet 50 mL santrifüj tüpünde hücre süpernatantını (90 mL) toplayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı yeni steril tüplere aktarın ve 20 dakika boyunca 2.000 x g'de, 30 dakika boyunca 10.000 x g'de ve 4 ° C'de 70 dakika boyunca 12.000 x g'de art arda santrifüj yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve hafifçe pipetleyerek peleti 10 mL PBS ile durulayın. 12.000 x g'de 4 ° C'de 70 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın ve bir EV karışımı elde etmek için pelet 10 mL PBS tamponunda yeniden askıya alın.
- EV karışımını ölçmek ve boyutlandırmak için nanopartikül izleme analizi (NTA) gerçekleştirin. NTA analizini cihaz kullanım referans kılavuzuna vereferans 21'e göre gerçekleştirin.
3. Hücre sıralama
- Akış hücresi sıralayıcısının standart başlatma yordamını gerçekleştirin. Başlangıç düğmesine basarak makineyi AÇIN. Lazer kontrol panelindeki Lazer Gücü düğmesine tıklayın. Akışkanları basınçlandırmak için akıllı numune alma cihazı alt menüsündeki Tankları Değiştir düğmesine basın.
NOT: Çalıştırmadan önce atık tankının boş olduğundan ve kılıf tankının dolu olduğundan emin olun. - Ultrasonik olarak temizlenmiş 50 μm jet-in-air nozulu kullanın ve nozul tertibatına takın. Basıncı, kılıf sıvısı için 80 psi'ye ve basınç konsolundaki numune akışı için 80,3 psi'ye ayarlayın.
- Kılıf akışı akışını başlatmak için Kılıf Akışını Başlat düğmesine basın. Akıllı örnekleyici alt menüsündeki Kabarcık Düğmesine tıklayarak 10 dakika boyunca otomatik olarak kabarcıktan arındırın ve ardından kapatın.
NOT: Hücre ayıklama için, farklı boyutlardaki hava püskürtme nozulları, sıvı akış stabilitesini korumak için farklı kılıf sıvısı basınçları gerektirir. Bu yöntemde, 50 μm'lik bir nozul kullanıldı ve yalnızca 80 psi'ye eşit veya daha büyük bir kılıf sıvısı basıncı kararlı yan akışlar üretebilir. Numune akışı ile kılıf sıvısı arasındaki basınç farkı, ayıklamanın yükleme hızını belirler. Yöntemin ayar koşulu altında (numune akışı ile kılıf sıvısı arasındaki basınç farkı 0,3-0,6 psi'dir), sıvı akışı nispeten kararlıydı ve yükleme hızı, ayıklama verimliliğinin 0,3-0,6 psi'den daha düşük basınç farkı için% 50'den% 80'e çıkmasını sağladı. - Akışı hizalayın ve lazer noktasını belirleyin. İğne deliklerinin üzerindeki akışı görüntülemek için aydınlatma odası ışığını AÇIN. Akışı iğne deliğinde ortalamak ve akışı odaklamak için yukarı ve aşağı, sola ve sağa ve ön ve arka mikrometreleri ayarlayın.
- Lazer ve Akış Durdurucu sekmesini seçin. Lazer durdurma ve nozul hizalama kalibrasyon işlemini tamamlamak için istendiğinde Yeşil Ok düğmesine sürekli basın.
- İnce lazer hizalama ekranına erişin. X ekseni parametresi olarak 640-722/44 (H) kanalını ve Y ekseni parametresi olarak 405-448/59 (H) kanalını seçin. Tetik Parametresi Seçici'ye basın ve 488 nm lazerin SSC Parametresini seçin. Tüm lazer deklanşörlerini açın.
NOT: Seçilen X ekseni ve Y ekseni parametreleri, sistemin lazer yapılandırmasına bağlıdır. Sistemde 640 nm veya 405 nm lazer yoksa diğer parametrelere izin verilir. En iyi sonuçlar için, iğne deliği şeridinde en büyük uzamsal ayrıma sahip lazerleri seçin (355 nm lazer hariç). - Gökkuşağı floresan parçacıklarını, mL başına 1 x 106 boncuk nihai konsantrasyonu için 1 mL çift damıtılmış suya bir damla ekleyerek seyreltin. Numune odasının kapısını açın ve hazırlanan gökkuşağı floresan parçacıklarının bir tüpünü yükleyin.
- Start Sample (Örneği Başlat) düğmesine basın. Floresan yoğunluğunu optimize etmek için yukarı ve aşağı mikrometreleri ayarlayın ve her sinyali mümkün olduğunca yoğun hale getirin. QC'yi otomatik olarak gerçekleştirmek için dokunmatik ekran kontrol panelindeki Kalite Kontrolü Başlat (QC) düğmesine basın.
- Bırakma gecikmesi gerçekleştirin. Sıralama ayarları ekranına erişin ve bırakma gecikmesi düğmesini seçin. IntelliSort Initialization düğmesine basın. Cihaz, 25 ± 5'lik düşme gecikmesini elde etmek ve damlanın kopma noktasını net bir şekilde görselleştirabilmek için damlacık salınımının frekansını ve genliğini otomatik olarak ayarlar. Maintenance ( Bakım ) düğmesine basın.
- Sıralama çıktısı türü olarak tüpü seçin. Sıralama odasına 15 mL'lik bir tüp tutucu yerleştirin. Plaka voltajını AÇIK duruma getirin ve plaka voltajını yaklaşık 4000 V'a ayarlayın.
- Akış Kurulumu düğmesini seçerek test desenini açın. Akışın görüntüsünün toplama tüpüyle aynı hizada olduğundan emin olmak için şarj fazı kaydırıcısını ve sapma kaydırıcısını ayarlayın. Onay İşareti düğmesini seçin.
- Bilgisayardaki Summit iş istasyonunda oturum açın. Dosya ana menüsünden yeni bir protokol oluşturun. Summit yazılımı kontrol panelindeki Histogram sekmesini seçerek bir nokta grafiği oluşturun.
- Çalışma alanında yeni nokta grafiğin eksenlerine sağ tıklayın ve X ekseni parametresi olarak FSC'yi ve Y ekseni parametresi olarak SSC'yi seçin. FSC ve SSC'yi logaritmik biçimde sunun.
- Edinme sekmesini seçin ve alma parametreleri panelini bulun. Parametreleri etkinleştirme alt menüsündeki tüm sinyalleri etkinleştirin. Tetikleyici parametre olarak FSC'yi seçin ve eşiği 0,01 olarak ayarlayın. FSC ve SSC grafiğindeki olayların ve popülasyonların ayrıldığından emin olmak için FSC ve SSC'nin voltajını ve kazancını 250 ve 0,6'da ayarlayın.
NOT: Eşik ayarı, akış sitometrisi ile tespit edilebilen parçacık boyutunu ayarlamaya eşdeğerdir. Eşik ne kadar büyük olursa, tespit edilen parçacıklar o kadar büyük olur ve küçük parçacıklar eşik tarafından kesilir ve tespit edilemez. Bu yöntemde, eşik 0.01 olarak ayarlanır, böylece elektronik gürültüden daha büyük tüm parçacıklar tespit edilebilir.
4. sEV'nin izolasyonu
- Floresan polistiren mikrosferleri 100 nm, 200 nm ve 300 nm süspansiyonlara seyreltin. 1 mL çift damıtılmış suya 1 μL mikrosfer ekleyin.
- Mikrosfer süspansiyonunu art arda yükleyin. Zirve yazılımının satın alma menüsü altında Başlat'ı seçin ve 20.000 etkinlik kaydedin.
NOT: Olay sayısı isteğe bağlıdır. İstatistiksel anlamlılığı karşılamak için en az 5.000 etkinlik önerilir. - Dikdörtgenler oluşturmak için FSC ve SSC nokta grafiğine sağ tıklayın ve elektronik gürültü bölgelerini ve 100 nm mikrosfer popülasyonunu yeniden boyutlandırmak ve yeniden konumlandırmak için sürükleyin. Sırasıyla R7 ve R4 olarak yeniden adlandırmak için bölgelere sağ tıklayın. 200 nm ve 300 nm mikrosferleri dikdörtgenlerle art arda çerçevelemek için yukarıdaki adımları tekrarlayın ve bunları sırasıyla R5 ve R6 olarak yeniden adlandırın.
- Son olarak, elektronik gürültüye ve R8 olarak tanımlanan 200 nm parçacıkların konumuna göre 50-200 nm sıralama bölgesini belirleyin.
NOT: 50 nm'lik alt algılama sınırı, akış hücresi sıralayıcısının elektronik gürültüsünün hemen üzerine yerleştirilir. Bu nedenle gürültü ile 200 nm mikrosfer popülasyonu arasındaki bölge 50-200 nm arasında tanımlanabilir. - Sıralama kararlarını sıralama mantığı ve istatistikler panelinde düzenleyin. Soldaki (L1) akışın boş alanına çift tıklayın. Sıralama mantığını oluşturmak için R8 adlı bölgeyi seçin. Saflığın İptal modunu seçin ve L1 akışı için 1 damlalık bir damlacık zarfı seçin.
- Adım 2.3'ten itibaren 500 μL EVs karışımı örneği yükleyin. Veri almak için Summit'teki edinme menüsünün altındaki Başlat düğmesine basın ve ardından 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50-200 nm sEV toplamak için sıralama menüsünde Başlat'a basın.
NOT: Herhangi bir prosedür sırasında kontaminasyonu en aza indirmek için steril bir ortam gereklidir. - İletim elektron mikroskobu (TEM) ile sEV'nin varlığını gözlemleyin ve NTA kullanarak sEV'nin parçacık boyutunu doğrulayın. CD9, CD63 ve CD81 belirteçleri18'in ifadesini daha fazla doğrulamak için batı lekesi (WB) analizi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel protokolün akış şeması diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu yöntemde, partikül boyutu dağılımı için referans standartlar olarak standart boyutlu polistiren mikrosferler kullanılmıştır. Belirli enstrümantal parametre koşulu altında, parçacık sinyali, logaritmik form kullanılarak FSC ve SSC grafiğindeki arka plan gürültüsünden açıkça ayırt edilebilir. Geçit stratejileri Şekil 2'de gösterilmiştir. R4, R5 ve R6, sırasıyla 100 nm, 200 nm ve 300 nm mikrosferlerin konumlarını ifade eder. R7, 50 nm'nin altındaki elektronik gürültünün algılama sınırıdır ve R8, 50-200 nm parçacıkların konum aralığıdır.
PANC-1 hücrelerinden elde edilen EVs karışımının partikül boyutu dağılımı, ultrasantrifüjlemeden sonra 40-400 nm gibi geniş bir aralıkta idi (Şekil 3). 50-200 nm sEV'yi izole etmek ve saflaştırmak için, standart mikrosferlerin konumuna göre spesifik boyut sEV'yi elde etmek için akış sitometrik sıralama yapıldı (Şekil 4). İzolasyon kalitesi NTA ile doğrulandı ve sıralamadan sonra sEV'nin partikül boyutu aralığının 50-200 nm arasında olduğu bulundu ( Şekil 5'te gösterildiği gibi). sEV'nin varlığı, Şekil 6A'daki kırmızı oklarla gösterilen TEM tarafından daha da gözlendi ve izole edilen sEV'lerin WB analizi ile CD9, CD63 ve CD81 belirteçleri içerdiği doğrulandı (Şekil 6B).
Şekil 1. Deneysel protokol için akış şeması diyagramı. PANC-1 hücre kültürü ortamı toplandı ve EVs karışımını elde etmek için ultrasantrifüj edildi. Sıralama parametreleri, NTA tarafından doğrulanan 50-200 nm sEV'nin izolasyonu ve saflaştırılması için optimize edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. FSC ve SSC grafiğinde 50-200 nm boyut aralığını bulmak için standart boyutlu polistiren mikrosferlerin akış sitometrisi analizi. 100 nm, 200 nm ve 300 nm mikrosferlerin seyreltilmiş süspansiyonları, FSC ve SSC nokta grafiğinde gösterildiği gibi bir akış sitometresi ile yüklendi ve analiz edildi. R4, R5 ve R6, sırasıyla 100 nm, 200 nm ve 300 nm parçacıkların konumlarını ifade eder. R7, 50 nm parçacıklar için algılama sınırı olarak elektronik gürültüdür ve R8, 50-200 nm parçacıkların konum aralığını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Ultrasantrifüjleme ile elde edilen EV'lerin partikül boyutu dağılımının NTA analizi. Farklı parçacık boyutlarının frekans dağılımı, verilerle parçacık yüzdesi ve boyutu olarak temsil edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Toplanan EV örneğinin akış sitometri analizi. FSC ve SSC nokta grafiği, bir akış sitometresi tarafından yüklenen ve analiz edilen toplanan EV karışımının bir örneğini gösterir. R8 bölgesi içinde 50-200 nm boyut aralığındaki sEV'ler sıralandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. NTA kullanılarak sıralamadan sonra sEV'nin partikül boyutu dağılımının doğrulanması. Temsili parçacık yüzdesi ve boyut histogramı, sıralanan sEV'nin boyut dağılımını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Sıralama ile izole edilen sEV'nin karakterizasyonu. (A) Sıralanmış sEV'nin temsili bir TEM görüntüsü (kırmızı oklarla gösterilir). Ölçek çubuğu = 200 nm. (B) Sıralanmış sEV'deki CD9, CD81 ve CD63 belirteçlerinin Batı leke analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, NTA tarafından doğrulanan bir akış hücresi sıralayıcısı kullanarak 50-200 nm'lik belirtilen parçacık boyutuyla sEV'yi izole etmek ve saflaştırmak için optimize edilmiş bir yöntemi özetlemektedir. Yöntem, düzgün parçacık boyutu ve yüksek saflıkta sEV elde etme darboğazı problemini çözdü ve büyük boyutlu EV'lere sarılmış ilgisiz biyolojik moleküllerin müdahalesini önledi22. Saniyede 100.000 parçacık yakalayabilen ve saniyede 70.000 sıralama kararı alabilen akış sitometrisi ile hızlı, yüksek verimli analizler mümkündür17, bu da zamanı büyük ölçüde azaltır ve sEV parçacıklarının heterojenliğini yansıtır. Dahası, bu akış sitometrisine dayalı protokol, belirli boyutlardaki EV'lerin alt popülasyonlarındaki bireysel çıkarlara göre özelleştirilebilir. Alternatif kapı aralıkları, hava püskürtme nozulu, kılıf sıvısı basıncı, numune akış basıncı ve tetikleme eşiği parametresi gibi yukarıdakilerle aynı cihaz parametreleriyle ilgili popülasyonları tanımlamak ve izole etmek için kullanılabilir.
Bu yöntemin teknik zorluğu, özellikle arka plan gürültüsünden ayırt edilen, farklı boyut aralıklarına sahip popülasyonların ayrılmasında yatmaktadır. Kritik sıralama ayarlarından oluşan bir panel belirledik. İlk olarak, nozulun boyutu sıralama hızını etkiler. Sıralama ile elde edilen sEV konsantrasyonunu iyileştirmek için, bu yöntemde 50 μm'lik bir nozul kullanılır ve yan akışı stabilize etmek için 80 psi kılıf sıvısı basıncı gerekir. Daha yüksek kılıf sıvısı basıncı ile düşme frekansları artar, bu da daha yüksek olay oranları ve daha kısa sıralama süresi ile sonuçlanır23. Bununla birlikte, kılıf sıvısı basıncının artması, lazerden geçmek için gereken sürenin azalması ve dedektöre ulaşan foton sayısının24 olması nedeniyle FSC ve floresan sinyallerinin hassasiyetini azaltır. Özellikle, nozul ve boru hattının yüksek temizliğini gerektiren bu basınç altında yan akışın stabilitesini korumak zordur. İkincisi, deneysel başarı olasılığını artırmak için nozulun ultrasonik olarak temizlenmesi ve akış sitometri borularının yıkanması şiddetle tavsiye edilir. Son olarak, voltaj ve kazanç, özellikle küçük boyutlu parçacıklar için popülasyon ayrımı için kritik öneme sahiptir. Burada, 250 V'luk bir voltaj ve 0.6'lık bir kazanç, FSC tetikleme ve logaritmik biçimde çizim ile sEV'yi 50-200 nm'de etkili bir şekilde ayırabilir.
Yaklaşımın bir uyarısı, bazı durumlarda, sıralama işlemi sırasında sEV'nin konsantrasyonunun veya sEV agregasının çok yüksek olması ve tek parçacıklı bir süspansiyonun elde edilmesini zorlaştırmasıdır. Toplanan sEV, aşırı yükseltilmiş sinyal nedeniyle atılacaktır.
Toplu olarak, akış sitometrisinin yüksek verimli analizinin avantajlarıyla, bu yöntem nozul boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, numune akış basıncını ve tetikleme eşiği parametresini optimize ederek 50-200 nm sEV'nin başarılı bir şekilde izole edilmesini sağlar. Ayrıca, bu yöntem sadece spesifik boyutlu parçacıkların ayrılmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda antijen ekspresyonuna dayalı sEV'nin senkron sınıflandırmasına veya proteom analizine izin verir ve çok sayıda aşağı akış araştırma uygulamasına yol açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Zhejiang Çin Tıbbı Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu (2020ZG29), Zhejiang Eyaleti Temel Kamu Refahı Araştırma Projesi (LGF19H150006, LTGY23B070001), Zhejiang İl Eğitim Bakanlığı Projesi (Y202147028) ve Zhejiang Üniversitesi Laboratuvar Bölümü Deneysel Teknoloji Projesi (SJS201712, SYB202130) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
