Summary
Här beskriver vi en metod för bakteriellt samuttryck av differentiellt taggade proteiner med hjälp av en uppsättning kompatibla vektorer, följt av konventionella pulldown-tekniker för att studera proteinkomplex som inte kan monteras in vitro.
Abstract
Pulldown är en enkel och allmänt använd protein-proteininteraktionsanalys. Det har dock begränsningar när det gäller att studera proteinkomplex som inte monteras effektivt in vitro. Sådana komplex kan kräva samtranslationell montering och närvaron av molekylära chaperoner; Antingen bildar de stabila oligomerer som inte kan dissociera och återassociera in vitro eller är instabila utan en bindande partner. För att övervinna dessa problem är det möjligt att använda en metod baserad på bakteriellt samuttryck av differentiellt märkta proteiner med hjälp av en uppsättning kompatibla vektorer följt av de konventionella pulldown-teknikerna. Arbetsflödet är mer tidseffektivt jämfört med traditionell pulldown eftersom det saknar de tidskrävande stegen för separat rening av interagerande proteiner och deras efterföljande inkubation. En annan fördel är en högre reproducerbarhet på grund av ett betydligt mindre antal steg och en kortare tidsperiod där proteiner som finns i in vitro-miljön utsätts för proteolys och oxidation. Metoden användes framgångsrikt för att studera ett antal protein-proteininteraktioner när andra in vitro-tekniker visade sig vara olämpliga. Metoden kan användas för batchtestning av protein-proteininteraktioner. Representativa resultat visas för studier av interaktioner mellan BTB-domän och inneboende oordnade proteiner, och av heterodimerer av zinkfingerassocierade domäner.
Introduction
Konventionell neddragning används ofta för att studera protein-proteininteraktioner1. Renade proteiner interagerar emellertid ofta inte effektivt in vitro2,3, och vissa av dem är olösliga utan sin bindningspartner 4,5. Sådana proteiner kan kräva samtranslationell sammansättning eller närvaron av molekylära chaperoner 5,6,7,8,9. En annan begränsning av konventionell pulldown är testningen av möjlig heteromultimeriseringsaktivitet mellan domäner som kan existera som stabila homooligomerer monterade tillsammans 8,10, eftersom många av dem inte kan dissociera och återassociera in vitro under inkubationstiden. Samuttryck visade sig vara användbart för att övervinna sådana problem 3,11. Samuttryck med kompatibla vektorer i bakterier användes framgångsrikt för att rena stora makromolekylära komplex med flera subenheter, inklusive polykamrepressivt komplex PRC212, RNA-polymeras II mediatorhuvudmodul 13, bakteriofag T4-basplatta14, SAGA-komplex deubiquitinylasmodul 15,16 och ferritin 17. Replikeringsursprung som vanligtvis används för samuttryck är ColE1, p15A18, CloDF1319 och RSF20. I det kommersiellt tillgängliga Duet-uttryckssystemet kombineras dessa ursprung med olika antibiotikaresistensgener och lämpliga multipla kloningsställen för att producera polycistroniska vektorer, vilket möjliggör uttryck av upp till åtta proteiner. Dessa ursprung har olika kopienummer och kan användas i olika kombinationer för att uppnå balanserade uttrycksnivåer av målproteiner21. För att testa protein-proteininteraktioner används olika affinitetstaggar; de vanligaste är 6xHistidin, glutation-S-transferas (GST) och maltosbindande protein (MBP), som var och en har en specifik affinitet till motsvarande harts. GST och MBP förbättrar också lösligheten och stabiliteten hos märkta proteiner22.
Ett antal metoder som involverar proteinuttryck i eukaryota celler har också utvecklats, varav den mest framträdande är jäst tvåhybridanalys (Y2H)23. Y2H-analys är billig, enkel och möjliggör testning av flera interaktioner; Arbetsflödet tar dock mer än 1 vecka att slutföra. Det finns också några mindre frekventa däggdjurscellbaserade analyser, till exempel fluorescerande tvåhybridanalys (F2H)24 och cellmatrisprotein-proteininteraktionsanalys (CAPPIA)25. F2H-analys är relativt snabb, vilket gör det möjligt att observera proteininteraktioner i sin ursprungliga cellulära miljö, men innebär att man använder dyr bildutrustning. Alla dessa metoder har en fördel jämfört med prokaryot uttryck som ger den ursprungliga eukaryota översättnings- och vikningsmiljön; De detekterar emellertid interaktion indirekt, antingen genom transkriptionell aktivering eller genom fluorescerande energiöverföring, som ofta producerar artefakter. Eukaryota celler kan också innehålla andra interaktionspartners av proteiner av intresse, vilket kan störa testningen av binära interaktioner mellan proteiner av högre eukaryoter.
Den aktuella studien beskriver en metod för bakteriellt samuttryck av differentiellt taggade proteiner följt av konventionella pulldown-tekniker. Metoden gör det möjligt att studera interaktioner mellan målproteiner som kräver samuttryck. Det är mer tidseffektivt jämfört med traditionell pulldown, vilket möjliggör batchtestning av flera mål, vilket gör det fördelaktigt i de flesta fall. Samuttryck med kompatibla vektorer är bekvämare än polycistroniskt samuttryck eftersom det inte kräver ett mödosamt kloningssteg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den schematiska representationen av metodarbetsflödet visas i bild 1.
1. Samomvandling av E. coli
- Förbered uttrycksvektorer för målproteiner med hjälp av standardkloningsmetoder.
OBS: Vanligtvis är en bra utgångspunkt att använda konventionella pGEX / pMAL-vektorer som bär en ampicillinresistensgen och ColE1-ursprung för uttryck av GST / MBP-märkta proteiner och en kompatibel vektor med p15A- eller RSF-ursprung och kanamycinresistens för att uttrycka 6xHis-märkta proteiner, i vissa fall kombinerat med antingen Thioredoxin eller SUMO-tag för att öka lösligheten. Vanligtvis måste flera kombinationer av taggar testas före experimentet. Den beskrivna metoden i sig är lämplig för batchtestning av uttrycksförhållandena för målproteiner. Det är viktigt att notera att de flesta Rosetta-stammar redan innehåller plasmiden med p15A-ursprung för att uttrycka tRNA för sällsynt kodon;, så om användning av sådana stammar är ett möjligt alternativ, bör p15A-plasmiderna undvikas. Se materialtabellen för mer information.- Odla bakterier av lämplig stam i Luria-Bertani (LB) media vid 37 °C till en optisk densitet (OD) på 0,1-0,2. BL21(DE3)-stammen användes som exempel i denna studie.
OBS: Det rekommenderas att använda nyberedda kompetenta celler för att uppnå effektiv samtransformation med två vektorer. Om mer än två vektorer behöver samtransformeras är det bättre att transformera dem sekventiellt för att uppnå god transformationseffektivitet. Elektroporering är ett bra alternativ. - Centrifugera 1,0 ml av bakteriesuspensionen i 1 minut vid 9 000 x g vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Tillsätt 0,5 ml iskall bufferttransformationsbuffert (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 och 15 mM CaCl2) och inkubera i 10 minuter på is.
- Centrifugera i 30 s vid 8 000 x g vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Tillsätt 100 μL TB-buffert, tillsätt 100 ng av varje vektor och inkubera i 30 minuter på is. Transformera enskilda vektorer separat för att studera proteinbeteende utan samuttryck. Samforma dessutom uttrycksvektorer parvis med tomma samuttrycksvektorer för icke-specifika bindningskontroller.
OBS: I exemplen i denna studie användes pGEX / pMAL-vektorer med motsvarande cDNA smält till GST / MBP cDNA i kombination med kompatibla pACYC-härledda vektorer som bär cDNA-kodande partnerproteindomäner smält till Thioredoxin cDNA. - Värm vid 42 °C i 150 sekunder och kyl sedan i 1 min på is.
- Tillsätt 1 ml flytande LB-medium utan antibiotika och inkubera vid 37 °C i 90 minuter. Platta på LB-agarplattor innehållande 0,5% glukos och motsvarande antibiotika (vanliga koncentrationer är: 50 mg / L ampicillin; 20 mg / L kanamycin; 50 mg / L streptomycin; 35 mg / L kloramfenikol). Inkubera plattorna vid 37 °C över natten.
- Odla bakterier av lämplig stam i Luria-Bertani (LB) media vid 37 °C till en optisk densitet (OD) på 0,1-0,2. BL21(DE3)-stammen användes som exempel i denna studie.
2. Uttryck
- Spola cellerna från plattan med 2 ml flytande LB-media till 50 ml LB-media med motsvarande antibiotika (vanliga koncentrationer är: 50 mg / L ampicillin; 20 mg / L kanamycin; 50 mg / L streptomycin; 35 mg / L kloramfenikol). Lägg till metalljoner eller andra kända kofaktorer (i exemplen i denna studie tillsattes 0,2 mMZnCl2 till mediet). Förvara en alikvot med 20 % glycerol vid -70 °C för en senare upprepning av experimentet.
OBS: Det rekommenderas att spola flera kolonier direkt från plattan för att utesluta risken för dåligt uttryck i en enda isolerad klon på grund av tillfälliga rekombinationshändelser mellan två plasmider. - Odla cellerna med en konstant rotation på 220 rpm vid 37 °C till en OD på 0,5-0,7, kyl till rumstemperatur (RT) och tillsätt isopropyl β-D-1-tiogalaktospyranosid (IPTG) till 1 mM. Förvara en alikvot på 20 μl cellsuspension som kontroll av det oinducerade provet.
- Inkubera cellerna med en konstant rotation på 220 rpm vid 18 °C över natten.
OBS: Den optimala tiden och temperaturen för inkubation kan variera; 18 °C över natten fungerar bäst för de flesta proteiner och rekommenderas att provas som standard. Minska inkubationstiden till 2-3 h om en stark icke-specifik bindning observeras. - Dela bakteriesuspensionen i två delar (eller fler om mer än två olika taggar användes) och förvara en alikvot på 20 μl av cellsuspensionen för att bekräfta proteinuttrycket. Centrifugera vid 4 000 x g i 15 minuter.
OBS: Pauspunkt: bakteriepellets kan förvaras vid -70 °C i minst 6 månader.
3. Pulldown-analys
OBS: De detaljerade procedurerna beskrivs för proteiner märkta med antingen 6xHis eller MBP / GST. Alla procedurer utförs vid 4 ° C.
- Resuspendera bakteriepellets i 1 ml iskall lysbuffert med proteashämmare och reduktionsmedel (se nedan) tillsatta omedelbart före experimentet. Undvik ditiotreitol (DTT) när du använder metallkelaterande hartser eftersom det tar bort metalljoner. Justera buffertkompositionen för de testade proteinerna. De vanliga recepten av lysbuffertar som är lämpliga för de flesta proteiner är:
- 6xHis-pulldown: Blanda 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol, 5 mM beta-merkaptoetanol, 1 mM fenylmetylsfulfonylfluorid (PMSF) och en 1:1,000 utspädning av proteashämmarecocktailen (se Materialtabell).
- GST- eller MBP-neddragning: Blanda 20 mM Tris (pH 7,5 vid 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF och en 1:1 000 utspädning av proteasinhibitorcocktailen (se Materialtabell).
- Stör cellerna genom ultraljudsbehandling på is. Förvara en alikvot på 20 μl för elektrofores.
OBS: Vanligtvis krävs 20-25 pulser på 5 s med 15 s intervall med 20 W uteffekt per prov. Lämplig ultraljudsbehandling effekt bör justeras för varje instrument för att undvika överhettning och säkerställa total cell störningar. För att uppnå bättre prestanda, Det rekommenderas starkt att använda high-throughput multi-tip sonicator sonder. - Centrifugera vid 20 000 x g i 30 minuter. Samla upp 20 μL av det klarade lysatet för efterföljande SDS-PAGE-analys.
- Balansera hartset (50 μl för varje prov) med 1 ml iskall lysbuffert i 10 minuter, centrifugera vid 2 000 x g i 30 sekunder och kassera supernatanten.
- Tillsätt celllysat (total proteinkoncentration: 20-50 mg/ml) till hartset, inkubera i 10 minuter vid en konstant rotation av 15 varv per minut, centrifugera vid 2 000 x g i 30 sekunder och kassera supernatanten. Samla upp 20 μl av den obundna fraktionen för efterföljande SDS-PAGE-analys.
- Tillsätt 1 ml iskall tvättbuffert och inkubera i 1 min. Centrifugera vid 2 000 x g i 30 sekunder och kassera supernatanten. De vanliga recepten för tvättbuffertar är:
- 6xHis-pulldown: Blanda 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [w / w] glycerol och 5 mM beta-merkaptoetanol.
- GST- eller MBP-neddragning: Blanda 20 mM Tris (pH 7,5 vid 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol och 5 mM DTT.
- Utför två långa tvättar: tillsätt 1 ml iskall tvättbuffert, inkubera i 10-30 minuter med en konstant rotation på 15 varv / min, centrifugera vid 2 000 x g i 30 sekunder och kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml iskall tvättbuffert, inkubera i 1 min, centrifugera vid 2 000 x g i 30 sekunder och kassera supernatanten.
- Eluera de bundna proteinerna med 50 μl av elueringsbufferten i en shaker vid 1 200 rpm i 10 minuter. De vanliga recepten för elueringsbuffertar är:
- 6xHis-pulldown: Blanda 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol och 5 mM beta-merkaptoetanol.
- GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 vid 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM glutation (justerat till pH 7,5 med grundläggande Tris) och 5 mM DTT.
- MBP-pulldown: Blanda 20 mM Tris (pH 7,5 vid 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltos och 5 mM DTT.
- Analysera de eluerade proteinerna med SDS-PAGE.
OBS: Den procentuella andelen akrylamid bör anpassas till proteinernas storlek. I exemplen i denna studie användes 12% akrylamidgeler, som kördes i tris-glycin-SDS-buffert (2 mM Tris, 250 mM glycin, 0,1% SDS) vid konstant spänning på 180 V. Geler färgades genom kokning i 0,2% Coomassieblå R250, 10% ättiksyra och 30% isopropanol och avfärgades genom kokning i 10% ättiksyra. Mängden laddat protein bör inte vara lika, eftersom olika mängder interagerande proteiner kan dras ner i olika experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna metoden användes rutinmässigt med många olika mål. Här presenteras några representativa resultat som sannolikt inte kan erhållas med konventionella pulldown-tekniker. Den första är studien av specifik ZAD (Zinc-finger-associated domain) dimerisering11. ZAD bildar stabila och specifika dimerer, med heterodimerer endast möjliga mellan närbesläktade domäner inom paraloga grupper. Dimererna som bildas av dessa domäner är stabila och dissocierar inte i minst några dagar; Blandning av renade ZAD ger således ingen detekterbar bindning. Samtidigt visar samuttrycket av MBP och Thioredoxin-6xHis-smälta ZAD god och reproducerbar homodimeriseringsaktivitet (figur 2A), som framträder som ett ytterligare band i SDS-PAGE-resultaten av MBP-pulldown-analysen. En liten del av heterodimererna kan ses med M1BP uttryckt tillsammans med en annan domän; denna interaktion bekräftades inte med Y2A och är sannolikt ett resultat av icke-specifik association på grund av hög proteinkoncentration, eftersom dessa domäner är cysteinrika och extremt aggregeringsbenägna. I det här fallet är 6xHis-pulldown olämpligt eftersom ZAD är metallkoordinerande domäner som icke-specifikt binder till metallkelaterande harts. Sådan aktivitet bör noggrant undersökas i ett parallellt experiment.
Ett annat exempel är konkurrensanalysen mellan ENY2-proteinet och dess bindningspartner Sgf11 (1-83aa) och zinkfingerdomänen (460-631 aa) av CTCF-proteinet26. När det uttrycks ensamt bildar ENY2-proteinet dimerer som hindrar det från att interagera med sina ursprungliga bindningspartners. Förmodligen binder både Sgf11- och CTCF-proteinerna till samma molekylära yta av ENY2, vilket gör deras interaktion ömsesidigt uteslutande. I samuttrycksanalysen interagerade 6xHis-taggade ENY2 både med GST-taggade Sgf11 och MBP-CTCF, men ingen GST-Sgf11 fanns i MBP-pulldowns och vice versa (figur 2B). Dessa resultat tyder på att inget trippelkomplex kan bildas, och interaktioner utesluter varandra. Dessa data bekräftades oberoende av varandra med andra analyser och stöder de olika funktionella rollerna för ENY2 i dessa komplex. Det bör uppmärksammas att stora affinitetstaggar kan införa steriska hinder i sig och förhindra komplex bildning. Därför bör slutsatsen inte baseras enbart på samuttrycksdata.
En stegvis jämförelse av arbetsflödena för konventionella och kopplade pulldown-kombinationer av samuttryck visas i figur 3A. Kopplad pulldown med samuttryck är minst två gånger mer tidseffektiv, även med ett litet antal exempel, och ger god skalbarhet. Resultaten av att använda båda teknikerna för att studera samma interaktion mellan BTB-domänen för CP190-proteinet (1-126aa) och den GST-märkta C-terminaldomänen (610-818aa) för Drosophila CTCF-protein (dCTCF) visas i figur 3B. Båda metoderna visar god effektivitet och reproducerbarhet (analyser utfördes i tre replikat); I det här fallet visade co-expression coupled pulldown lägre icke-specifik bindning, vilket kan ses i kontrollproverna med enbart GST-protein.
Figur 1: Den schematiska representationen av protokollet. Schemat visar metodarbetsflödet som användes i denna studie. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa resultat . (A) Studie av homodimerisering av zinkfingerassocierad domän (ZAD) i MBP- och 6xHis-pulldown-analyser. ZAD smält antingen med MBP (40 kDa) eller med 6xHis-Thioredoxin (20 kDa) uttrycktes samtidigt i bakterieceller och affinitet renades med amylosharts (binder MBP-märkta proteiner) eller med Ni-NTA-harts (binder 6xHis-märkta proteiner). Samrenade proteiner visualiserades med SDS-PAGE följt av Coomassie-färgning. MBP-pulldown-resultat visas i övre paneler, 6xHis-pulldown-resultat finns i nedre paneler (används endast som proteinuttryckskontroll eftersom många ZAD binder icke-specifikt till Ni-NTA). (B) Studie av ömsesidigt uteslutande interaktioner mellan ENY2- och Sgf11/CTCF-proteiner. GST-märkta Sgf11 (1-81aa), MBP-märkta CTCF-zinkfingerdomän (460-631aa) och 6xHis-märkta ENY2-proteiner samuttrycktes i olika kombinationer och affinitet renades med amylosharts, glutationharts (binder GST-märkta proteiner) eller med Ni-NTA-harts. Samrenade proteiner visualiserades med SDS-PAGE följt av Coomassie-färgning. Figuren i panelerna A och B har modifierats med tillstånd från Bonchuk et al.11 och Bonchuk et al.26. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Jämförelse av arbetsflöden för konventionella och kopplade pulldown-analyser med samuttryck. (A) Steg-för-steg-jämförelse av nödvändiga tidsintervall i arbetsflödet för den konventionella pulldown-analysen jämfört med pulldown kopplad till samuttryck. (B) Jämförelse av två olika pulldown-tekniker för att studera interaktionen mellan dCTCF C-terminaldomänen (610-818aa) och BTB-domänen för CP190-proteinet (1-126aa) i GST-pulldown-analyser. dCTCF (610-818aa) smält med GST (25kDa) eller GST ensam uttrycktes antingen i bakterieceller eller inkuberades in vitro med Thioredoxin-6xHis-märkt CP190 BTB och affinitet renad med glutationharts. Tre oberoende replikat av varje analys visas. Samrenade proteiner visualiserades med SDS-PAGE följt av Coomassie-färgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna metoden möjliggör testning av protein-proteininteraktioner som inte kan monteras effektivt in vitro och kräver samuttryck. Metoden är en av de få lämpliga metoderna för att studera heterodimeriserande proteiner, som också kan homodimeriseras eftersom sådana proteiner, när de renas separat, bildar stabila homodimerer som oftast inte kan dissociera och återassociera under experimentet 3,11.
Arbetsflödet för den beskrivna metoden är mer tidseffektivt jämfört med traditionell pulldown eftersom det saknar de tidskrävande stegen för separat rening av interagerande proteiner och deras efterföljande inkubation. En annan fördel är en högre reproducerbarhet, på grund av ett betydligt mindre antal steg och en kortare tidsperiod där proteiner existerar i en artificiell in vitro-miljö samtidigt som de utsätts för proteolys och oxidation. Metoden användes framgångsrikt för att studera flera protein-proteininteraktioner när andra in vitro-tekniker visade sig vara olämpliga 3,11,27. Parallell samfällning med olika affinitetstaggar ger kontroll av proteinuttrycksnivån. Eftersom metoden är enklare och snabbare än konventionell pulldown kan den användas istället för den, även om samuttryck inte är absolut nödvändigt. Hastigheten för cellstörning är en icke-uppenbar flaskhals som kan öka den totala tiden avsevärt och kan leda till en avvikelse i resultaten på grund av att den olika tiden mellan det första och sista provet utsätts för in vitro-förhållanden och proteolys. Således, med hjälp av high-throughput multi-tip sonicator sonder rekommenderas starkt; se materialförteckningen för exempel.
Användning av magnetiska pärlor kan minska den icke-specifika bindningen och ytterligare påskynda metoden, vilket minskar den tid som krävs för tvättsteg. Att använda vektorer med kompatibelt ursprung har en fördel jämfört med polycistroniskt uttryck eftersom de ger ett bekvämt kombinatoriskt tillvägagångssätt för att testa flera proteininteraktioner med samma mål och inte kräver att man producerar en ny vektor för varje kombination.
En nackdel med metoden är den relativt höga sannolikheten för falskt positiva resultat, eftersom proteiner samuttrycks i bakterier vid höga koncentrationer. Således bör oväntade interaktioner som upptäcks med denna metod behandlas med försiktighet och testas med en oberoende analys, såsom Y2A eller cellulära tekniker24, som också använder co-expression 3,11,28. Bioinformatiska metoder med hög kapacitet kan också användas för att analysera och validera komplexa protein-proteininteraktionsnätverk29. Ett annat märkligt hinder är att proteinkomplex kan ha helt olika biokemiska egenskaper jämfört med separata proteiner; Komplexet kan vara olösligt medan dess komponenter är närvarande i lösningen. Detta problem kan vanligtvis lösas genom att smälta proteinerna till lämplig löslighetstagg. MBP är det mest effektiva, medan NusA är ett annat bra allroundalternativ22. GST-taggen visade sig vara effektiv med många zinkkoordinerande domäner, men eftersom den är dimer bör den undvikas när man arbetar med oligomera domäner. Tvärtom fungerar små monomera domäner som thioredoxin och SUMO bra med multimera proteindomäner.
Kritiska steg i den beskrivna metoden är rätt tid för proteinuttryck (en kortare tid krävs om icke-specifik bindning observeras, medan längre inkubationstider kan krävas för att förbättra dåligt proteinuttryck), snabb cellstörning, korrekt val av buffertar och upprätthållande av konstant temperatur under protokollet. Alltför långa inkubationstider efter induktion kan resultera i proteinaggregering i bakterier, vilket leder till falskt positiva resultat. Å andra sidan kräver vissa proteiner mer tid för att uttryckas i tillräckliga mängder. Temperaturfluktuationer under ultraljudsbehandling och tvätta steg kan leda till förändringar i buffert pH och protein nederbörd. Felaktigt buffertval kan också resultera i icke-specifik proteinaggregering.
Vid dåligt proteinuttryck bör olika löslighetstaggar försökas, liksom en ökad inkubationstid efter induktion. Om ett starkt icke-specifikt samband observeras bör alla nödvändiga negativa kontroller utföras för att bestämma den möjliga icke-specifika associeringen av proteiner med harts eller affinitetsmärket. Om kontrollerna inte fungerar bör olika kombinationer av tillhörighetstaggar försökas och olika buffertar användas. Många proteiner tenderar att icke-specifikt binda till de metallkelaterande hartsliknande ZAD som nämns i denna artikel; I sådana fall skulle MBP/GST-pulldown i allmänhet vara tillräcklig utan ett ömsesidigt experiment som endast kan användas för kontroll av proteinuttryck. Om negativa kontroller fungerar bra bör proteinuttryckstiden minskas och buffertsystemet och reduktionsmedlet ändras eller reduktionsmedelskoncentrationen ökas, särskilt vid arbete med cysteinrika proteiner. Vid dålig reproducerbarhet av resultat bör man uppmärksamma cellstörningssteget, vilket bör utföras snabbt men utan överhettning. Temperaturen bör övervakas under hela experimentet.
Denna metod kan enkelt modifieras för att studera multiproteinkomplex eller ribonukleoproteiner. En annan möjlig tillämpning är batchtestning av proteinkomplexuttryck och reningsförhållanden för efterföljande studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Russian Science Foundation-projekten 19-74-30026 (metodutveckling och validering) och 19-74-10099 (protein-proteininteraktionsanalyser); och av Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning-bidrag 075-15-2019-1661 (analys av representativa protein-proteininteraktioner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S.
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G.
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al.
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
