Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína

Resumen

Aquí, describimos un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles, seguido de las técnicas convencionales de pulldown para estudiar complejos de proteínas que no pueden ensamblarse in vitro.

Resumen

Pulldown es un ensayo de interacción proteína-proteína fácil y ampliamente utilizado. Sin embargo, tiene limitaciones en el estudio de complejos de proteínas que no se ensamblan eficazmente in vitro. Tales complejos pueden requerir ensamblaje co-traduccional y la presencia de chaperonas moleculares; O bien forman oligómeros estables que no pueden disociarse y volver a asociarse in vitro o son inestables sin un compañero de unión. Para superar estos problemas, es posible utilizar un método basado en la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles seguidos por las técnicas convencionales de pulldown. El flujo de trabajo es más eficiente en el tiempo en comparación con el pulldown tradicional porque carece de los pasos que consumen mucho tiempo de purificación separada de proteínas que interactúan y su posterior incubación. Otra ventaja es una mayor reproducibilidad debido a un número significativamente menor de pasos y un período de tiempo más corto en el que las proteínas que existen dentro del ambiente in vitro están expuestas a proteólisis y oxidación. El método se aplicó con éxito para estudiar una serie de interacciones proteína-proteína cuando se descubrió que otras técnicas in vitro no eran adecuadas. El método se puede utilizar para probar por lotes las interacciones proteína-proteína. Se muestran resultados representativos para estudios de interacciones entre el dominio BTB y proteínas intrínsecamente desordenadas, y de heterodímeros de dominios asociados a dedos de zinc.

Introducción

El pulldown convencional es ampliamente utilizado para estudiar las interacciones proteína-proteína¹. Sin embargo, las proteínas purificadas a menudo no interactúan eficazmente in vitro^2,3, y algunas de ellas son insolubles sin su compañero de unión ^4,5. Tales proteínas pueden requerir ensamblaje co-traduccional o la presencia de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9.

Protocolo

La representación esquemática del flujo de trabajo del método se muestra en la figura 1.

1. Cotransformación de E. coli

1. Preparar vectores de expresión para proteínas diana utilizando métodos de clonación estándar.
   NOTA: Típicamente, un buen punto de partida es utilizar vectores pGEX/pMAL convencionales con un gen de resistencia a la ampicilina y un origen ColE1 para la expresión de proteínas marcadas con GST/MBP y un vector compatible con origen p15A o RSF y resistencia a la kanamicina para expresar proteínas marcadas con 6xHis, en algunos casos combinadas con tiorredoxina....

Resultados

El método descrito se utilizó rutinariamente con muchos objetivos diferentes. Aquí se presentan algunos resultados representativos que probablemente no se puedan obtener utilizando técnicas convencionales de pulldown. El primero es el estudio de la dimerización específica ZAD (Zinc-finger-associated domain)¹¹. Los ZAD forman dímeros estables y específicos, con heterodímeros posibles solo entre dominios estrechamente relacionados dentro de grupos parálogos. Los dímeros formados por estos dominios s.......

Discusión

El método descrito permite probar las interacciones proteína-proteína que no se pueden ensamblar eficientemente in vitro y requieren coexpresión. El método es uno de los pocos enfoques adecuados para estudiar proteínas heterodimerizantes, que también son capaces de homodimerización ya que, cuando se purifican por separado, tales proteínas forman homodímeros estables que con mayor frecuencia no pueden disociarse y volver a asociarse durante el experimento ^3,11<.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sonda de 8 elementos	Sonics	630-0586	Las sondas sonicadoras de 8 elementos de alto rendimiento
Agar	AppliChem	A0949
Resina de amilosa	New England Biolabs	E8021	Resina para la purificación de proteínas marcadas con MBP
Antibióticos	AppliChem	A4789 (kanamicina); A0839 (ampicilina)
Beta-mercaptoetanol	AppliChem	A1108
BL21(DE3)	Novagen	69450-M
CaCl2	Centrífuga AppliChem	A4689
	Eppendorf	5415R (Z605212)
Glutatión	AppliChem	A9782
Glutatión agarosa	Pierce	16100	Resina para la purificación de proteínas marcadas con GST
Glicerol	AppliChem	A2926
HEPES	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose	Thermo Scientific	25214	Resina para la purificación de proteínas marcadas con 6xHis
Imidazol	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
Maltose	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40	Roche	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	Vector para la coexpresión de proteínas con origen de replicación de p15A
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	Vector para la coexpresión de proteínas con origen de replicación de CloDF13
PMSF	AppliChem	A0999
Cóctel de inhibidores de proteasa VII	Calbiochem	539138	Cóctel de inhibidores de proteasa
pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	Vector para la coexpresión de proteínas con origen de replicación RSF
SDS	AppliChem	A2263
Tris	Sonicada por AppliChem	A2264
VC505 Sonics		CV334	Procesador de líquidos ultrasónico
ZnCl2	AppliChem	A6285