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Biology

एस्चेरिचिया कोलाई में एंटीबायोटिक दृढ़ता की जनसंख्या और एकल-कोशिका विश्लेषण

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64550
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Bacterial Genetics and Physiology, Département de Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences, Université Libre de Bruxelles (ULB)
* These authors contributed equally

Summary

एंटीबायोटिक दृढ़ता एक संवेदनशील इसोजेनिक आबादी के भीतर छोटी उप-आबादी की क्षमता का वर्णन करती है ताकि जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक दवाओं की उच्च खुराक को क्षणिक रूप से सहन किया जा सके। वर्तमान प्रोटोकॉल एस्चेरिचिया कोलाई को ओफ्लोक्सासिन की घातक खुराक के संपर्क में लाने के बाद आणविक और सेलुलर स्तरों पर एंटीबायोटिक दृढ़ता फेनोटाइप को चिह्नित करने के दृष्टिकोण को जोड़ता है।

Abstract

एंटीबायोटिक दृढ़ता छोटे जीवाणु उप-आबादी की क्षमता को संदर्भित करती है जो जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक दवाओं की उच्च खुराक को क्षणिक रूप से सहन करती है। जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक उपचार पर, जीवाणु आबादी का बड़ा हिस्सा तेजी से मारा जाता है। हत्या के इस पहले तेजी से चरण के बाद हत्या की दर में काफी कमी आती है क्योंकि परसिस्टर कोशिकाएं व्यवहार्य रहती हैं। शास्त्रीय रूप से, दृढ़ता जनसंख्या स्तर पर एंटीबायोटिक दवाओं की उच्च खुराक के साथ और परिभाषित जोखिम समय के लिए किए गए समय / हत्या परख द्वारा निर्धारित की जाती है। जबकि यह विधि परसिस्टर कोशिकाओं के स्तर और हत्या कैनेटीक्स के बारे में जानकारी प्रदान करती है, यह दृढ़ता घटना को अंतर्निहित आंतरिक सेल-टू-सेल विषमता को प्रतिबिंबित करने में विफल रहती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल वास्तविक समय फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-सेल विश्लेषण के साथ शास्त्रीय समय / किल परख को जोड़ता है। उपयुक्त फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग करके, जीवित कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सेलुलर प्रक्रियाओं पर एंटीबायोटिक के प्रभावों के बारे में जानकारी प्रदान कर सकती है, जैसे कि गुणसूत्र प्रतिकृति और अलगाव, कोशिका बढ़ाव और कोशिका विभाजन। जनसंख्या और एकल-कोशिका विश्लेषण का संयोजन दृढ़ता फेनोटाइप के आणविक और सेलुलर लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एकल-कोशिका और जनसंख्या स्तरों पर विशिष्ट एंटीबायोटिक उपचार के जवाब में जीवाणु दृढ़ता फेनोटाइप का विश्लेषण करना है। दृढ़ता एक आइसोजेनिक आबादी के भीतर छोटी उप-आबादी की क्षमता का वर्णन करती है जो जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक दवाओं (फ्लोरोक्विनोलोन, एमिनोग्लाइकोसाइड्स, β-लैक्टम, आदि) की उच्च खुराक को सहन करती है, जिसमें तथाकथित परसिस्टर कोशिकाओं की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) आबादी के थोक के समान होती है। एंटीबायोटिक की उपस्थिति में समय के साथ बैक्टीरिया के अस्तित्व को मापते समय बिफैसिक किलिंग डायनेमिक्स, क्षणिक रूप से दवा-सहिष्णु कोशिकाओं की उपस्थिति को प्रकट करता है, जिसमें गैर-परसिस्टर कोशिकाओं का प्रारंभिक तेजी से उन्मूलन होता है, इसके बाद परसिस्टर कोशिकाओं की बहुत धीमी हत्या दर होती है। एंटीबायोटिक हटाने पर, ये कोशिकाएं आनुवंशिक रूप से समान आबादी को जन्म देती हैं जो एक ही एंटीबायोटिक 1,2 के साथ इलाज किए जाने पर समान हत्या गतिशीलता प्रदर्शित करती हैं। दृढ़ता के विपरीत, एंटीबायोटिक प्रतिरोध को जनसंख्या स्तर पर परिभाषित किया जाता है और आम तौर पर या तो नए उत्परिवर्तन या प्रतिरोध-प्रदान करने वाले प्लास्मिड3 के क्षैतिज जीन हस्तांतरण का परिणाम होता है। जबकि प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार उत्परिवर्तन ज्यादातर दवा के लक्ष्य में या दवा एफ्लक्स पंपों के प्रोमोटर क्षेत्रों में स्थित होते हैं, जीनोम-वाइड और लक्षित उत्परिवर्ती विश्लेषण दृष्टिकोणों द्वारा पहचाने गए दृढ़ता आवृत्ति को बदलने वाले जीन कई और विविध साबित हुए हैं 2,3,4,5,6,7,8 . इसलिए, यह संभावना है कि जीवाणु कोशिकाएं कईमार्गों 9,10,11 के माध्यम से परसिस्टर अवस्था में प्रवेश कर सकती हैं, और इन परसिस्टर कोशिकाओं के शरीर विज्ञान को चिह्नित करने के लिए एकल-कोशिका स्तर पर दृढ़ता की घटना की जांच करने के दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के हालिया विकास ने दृढ़ता फेनोटाइप के लक्षण वर्णन के लिए मार्ग प्रशस्त किया है और प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं की भूमिका पर प्रकाश डाला है, जैसे क्रोमोसोम प्रतिकृति12, डीएनए मरम्मत13, और सेल डिवीजन14, परसिस्टर सेल गठन में। इस पेपर में, हम एकल-कोशिका लाइव इमेजिंग के साथ शास्त्रीय सूक्ष्म जीव विज्ञान परख के संयोजन के एक एकीकृत दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं ताकि तेजी से बढ़ते एस्चेरिचिया कोलाई संस्कृतियों में उत्पन्न परसिस्टर कोशिकाओं को चिह्नित किया जा सके, जिनका इलाज ओफ्लोक्सासिन की उच्च खुराक के साथ किया जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को अन्य जीवाणु प्रजातियों में एंटीबायोटिक दृढ़ता की घटना का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि बैसिलस सब्टिलिस15, या स्थितियां (जैसे, β-लैक्टम उपचार16 के बाद एंटीबायोटिक दृढ़ता) और आसानी से फेनोटाइपिक विषमता17,18,19 से जुड़ी कई घटनाओं की जांच के लिए संशोधित किया जा सकता है। . इसके अलावा, इस पेपर में वर्णित सेटअप को रुचि के अलग-अलग सेलुलर मापदंडों की जांच करने के लिए अन्य फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे कि एकल-सेल स्तर पर पीएच20 या एटीपी21 के इंट्रासेल्युलर स्तर, जो संभावित रूप से एंटीबायोटिक दृढ़ता घटना में नई अंतर्दृष्टि पैदा कर सकते हैं।

Protocol

नोट: बाँझ संस्कृति ग्लासवेयर, पिपेट टिप्स और विकास माध्यम का उपयोग करें। कोलाई कोशिकाओं को कम-ऑटोफ्लोरेसेंस रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम में उगाया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए एक बनसेन बर्नर की उपस्थिति में टीकाकरण किया गया था।

1. सेल संस्कृति और विकास वक्र

  1. लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेट (यदि आवश्यक हो तो चयनात्मक एंटीबायोटिक के साथ पूरक) पर जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से रुचि के तनाव को दूर करें, और एकल उपनिवेश प्राप्त करने के लिए रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यहां प्रस्तुत प्रयोग दो उपभेदों का उपयोग करता है, ई कोलाई के -12 एमजी 1655 डब्ल्यूटी तनाव के अनुरूप और इसोजेनिक एमजी 1655 एचयूपीए-एमचेरी स्ट्रेन22। उत्तरार्द्ध तनाव एचयू न्यूक्लियोइड से जुड़े प्रोटीन के प्रतिदीप्ति-टैग α-सबयूनिट को व्यक्त करता है। एचयूपीए-एमचेरी रिपोर्टर हूपा के मूल स्थान पर एकीकृत है। एचयू-एमचेरी जीवित कोशिकाओं में न्यूक्लियोइड गतिशीलता का पालन करने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है क्योंकि यह गैर-विशिष्ट तरीके से डीएनए को बांधता है।
  2. 5 एमएल माध्यम का टीका लगाएं (यहां, 3-[एन-मोर्फोलिनो] प्रोपेनसल्फोनिक एसिड-आधारित माध्यम [एमओपीएस]; तालिका 1, तालिका 2, और तालिका 3) को ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ ग्लूकोज 0.4% और एक चयनात्मक एंटीबायोटिक (यदि आवश्यक हो) के साथ पूरक किया जाता है, और ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 रोटेशन प्रति मिनट (आरपीएम) पर सेट किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, ग्लास ट्यूबों के बजाय प्लास्टिक ट्यूब, ग्लास या प्लास्टिक फ्लास्क (≥ 25 एमएल) का उपयोग किया जा सकता है।
    नोट: 0.4% की अंतिम सांद्रता पर ग्लिसरॉल के साथ पूरक एमओपीएस माध्यम का उपयोग इस पेपर में वर्णित प्रयोगों में किया गया था, रात भर की संस्कृतियों को छोड़कर जो एमओपीएस ग्लूकोज 0.4% में किए गए थे। ग्लूकोज के साथ पूरक एमओपीएस में ई कोलाई का उत्पादन समय एमओपीएस ग्लिसरॉल की तुलना में कम है। इस चरण में एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% के बजाय एमओपीएस ग्लूकोज 0.4% का उपयोग करना यह सुनिश्चित करता है कि कोशिकाएं 19 घंटे के भीतर स्थिर चरण तक पहुंच जाएं। अन्य विकास मीडिया, जैसे कि एम 9 या समृद्ध परिभाषित माध्यम (आरडीएम) को अलग-अलग कार्बन स्रोतों के साथ पूरक किया जा सकता है, का भी उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विकास दर और दृढ़ता आवृत्ति माध्यम और /या उपयोग किए गए कार्बन के आधार पर अलग-अलग हैं।
  3. अगली सुबह, सेंट्रीफ्यूज 1 एमएल कल्चर 3 मिनट के लिए 2,300 x g पर, सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, और धीरे से फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) की समान मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें। ऑप्टिकल घनत्व को 600 एनएम (ओडी600 एनएम) पर मापें, और 2 एमएल की अंतिम मात्रा में0.01 के प्रारंभिक ओडी 600 एनएम के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें।
  4. एमओपीएस ग्लिसरॉल के 2 एमएल 0.4% मध्यम को एक स्पष्ट निचले 24-वेल प्लेट के कुएं में रखें, और रात भर की संस्कृति मात्रा के साथ गणना की गई। 24 घंटे के लिए ओडी600 एनएम की निगरानी करने के लिए एक स्वचालित माइक्रोप्लेट रीडर (सामग्री की तालिका देखें) में 24-वेल प्लेट रखें। 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर और उच्च कक्षीय रोटेशन (140 आरपीएम) के साथ हर 15 मिनट में ओडी600 एनएम को मापने के लिए माइक्रोप्लेट रीडर सेट करें।
    नोट: यदि प्रयोग में उपयोग किया जाने वाला तनाव एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को एन्कोड करता है, तो सुनिश्चित करें कि इसकी वृद्धि दर बाद के प्रयोगों में किसी भी कलाकृति से बचने के लिए डब्ल्यूटी के बराबर है, क्योंकि विकास दर एंटीबायोटिक दृढ़ता आवृत्ति23 को प्रभावित करती है। कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) संबंध पर बहुत कम सेल घनत्व पर पहचान सीमाओं औरसंभावित तनाव-विशिष्ट प्रभावों के कारण, अस्पष्ट उपभेदों के साथ काम करते समय सीएफयू-एमएल -1 की निगरानी करके विकास कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है।

2. एंटीबायोटिक दवाओं की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता का निर्धारण

नोट: न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) को एंटीबायोटिक की सबसे कम खुराक के रूप में परिभाषित किया गया है जिस पर कोई जीवाणु वृद्धि नहीं देखी जाती है। प्रत्येक एंटीबायोटिक और तनाव के लिए एमआईसी का निर्धारण किया जाना चाहिए। यहां वर्णित प्रयोगों में, फ्लोरोक्विनोलोन एंटीबायोटिक ऑफलॉक्सासिन (ओएफएक्स) का उपयोग किया गया था। एमआईसी का निर्धारण पुष्टि के लिए अनुमति देता है कि एंटीबायोटिक समाधान सही ढंग से तैयार किया गया है, एंटीबायोटिक सक्रिय है, और उपभेद एंटीबायोटिक के प्रति समान रूप से संवेदनशील हैं। यहां,24 का उपयोग किए गए विभिन्न उपभेदों के एमआईसी से ओएफएक्स को निर्धारित करने के लिए प्रकाशित एगर तनुकरण विधि का प्रदर्शन किया गया था। किसी दिए गए जीवाणु तनाव के लिए दिए गए एंटीबायोटिक के एमआईसी को शोरबा कमजोर पड़ने की विधि24 के माध्यम से भी निर्धारित किया जा सकता है।

  1. एमआईसी निर्धारण के लिए प्लेटों की तैयारी
    1. अल्ट्राप्योर पानी के 1 एमएल में 5 मिलीग्राम ओएफएक्स को घोलकर प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक के लिए एक मास्टर स्टॉक समाधान तैयार करें। OFX की घुलनशीलता बढ़ाने के लिए 37% HCl का 20 μL जोड़ें।
    2. 100 एमएल बाँझ एलबी एगर पिघलाएं, और जमने से बचने के लिए इसे 55 डिग्री सेल्सियस पर रखें। बाँझ पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक फ्लास्क में छह छोटे ग्लास फ्लास्क (25 एमएल) और 5 एमएल तरल एलबी एगर माध्यम तैयार करें।
    3. अल्ट्राप्योर पानी के 90 μL (मास्टर स्टॉक का 1: 10 कमजोर पड़ना) में 5 mg.mL-1 OFX मास्टर स्टॉक समाधान के 10 μL को पतला करें। 5 0 μl, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL, या 500 μg.mL-1 OFX घोल में से प्रत्येक में 5 mL LB agar माध्यम वाले 5 mL l agar माध्यम वाले 0 μg.mL-1, 0.02 μl-mL-1, 0.04 μg.mL-1, 0.04 μg.mL-1, 0.04 μg.mL-1, 0.04 μg.mL-1, 0.04 μll-1, 0.04 μll-1, 0.04 μl,6l,8 μL, 6 μL, 8 μL, 8 μL, या 10 μL 500 μg.mL-1, 0.04 μl l-1, 0.04 μll-1, 0.04 μll-1, 0.02 μL, 6 μL, 8 μL, 6 μL, 8 μL, 8 μL, या 10 μL 5g.mL-1 OFX घोल में से प्रत्येक में 5 mL L lg-1, 0.04 μL ll-1, 0. 0.06 μg.mL-1, 0.08 μg.mL-1, और 0.1 μg.mL-1 OFX, क्रमशः। फ्लास्क को कई बार घुमाकर घोल को मिलाएं।
      नोट: यदि रुचि के एंटीबायोटिक का एमआईसी ज्ञात है, तो सांद्रता की सीमा वास्तविक एमआईसी के नीचे से ऊपर तक पहुंचनी चाहिए। यदि एमआईसी अज्ञात है, तो लॉग2 कमजोर पड़ने की श्रृंखला के साथ सांद्रता की एक बड़ी श्रृंखला की सिफारिश की जाती है। सुनिश्चित करें कि एंटीबायोटिक जोड़ने से पहले एलबी आगर माध्यम ठंडा हो गया है, क्योंकि उच्च तापमान इसे निष्क्रिय कर सकता है। फिर भी, एंटीबायोटिक जोड़ने से पहले एलबी एगर माध्यम को ठोस नहीं होने देना महत्वपूर्ण है, क्योंकि इससे एलबी एगर माध्यम में एंटीबायोटिक का गैर-समरूप वितरण हो सकता है।
    4. चरण 2.1.3 में तैयार किए गए छह एलबी एगर मीडिया में से प्रत्येक को एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके 6-वेल कल्चर प्लेट में खुराक बढ़ाने वाले तरीके से डालें। आगर को जमने तक ठंडा होने दें, और उपयोग करने से पहले प्लेट को सुखाएं।
      नोट: एंटीबायोटिक समाधान तैयार करें, और जिस दिन परख का प्रदर्शन किया जाता है, उस दिन संस्कृति प्लेट।
  2. एमआईसी निर्धारण परख
    1. एक ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ एलबी माध्यम के 5 एमएल को टीका लगाएं, और ग्लास ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें।
    2. अगली सुबह, ओडी600 एनएम को मापें, और पीबीएस में 1 x 107 सीएफयू-एमएल - 1 के अंतिम सेल घनत्व के लिए एक टेस्ट ट्यूब में संस्कृति को पतला करें। यहां परीक्षण किए गए उपभेदों के लिए, 1 x 107 CFU.mL-1 0.0125 के OD 600 nm से मेल खाता है।
      नोट: यदि सीएफयूएमएल -1 और ओडी600 एनएम के बीच सहसंबंध ज्ञात नहीं है, तो सीएफयू और ओडी600 एनएम माप द्वारा निर्धारित विकास वक्र को सीएफयू-एमएल -1 और ओडी600 एनएम के बीच सहसंबंध कारक की गणना करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए।
    3. सूखे 6-वेल प्लेट के हर कुएं पर पहले से पतला संस्कृति का स्पॉट 2 μL। प्लेट को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखने से पहले धब्बों को सूखने दें।
    4. अगले दिन, प्रत्येक कुएं में बनने वाली कॉलोनियों की गिनती करें। एमआईसी एंटीबायोटिक की न्यूनतम एकाग्रता के साथ कुएं से मेल खाता है जहां कोई जीवाणु वृद्धि का पता नहीं चलता है।

3. स्पॉट परख

नोट: स्पॉट परख विधि एक गुणात्मक दृष्टिकोण है जो व्यवहार्य कोशिकाओं (एंटीबायोटिक तनाव के बाद कॉलोनियों को उत्पन्न करने में सक्षम कोशिकाओं) की संख्या का अनुमान लगाने की अनुमति देता है। स्पॉट परख को टाइम-किल परख से पहले किया जाता है ताकि परीक्षण की गई स्थितियों में उपयोग किए जाने वाले तनाव की व्यवहार्यता में अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सके और टाइम-किल परख के दौरान आवश्यक कमजोर पड़ने के बारे में सूचित किया जा सके (अनुभाग 4 देखें)।

  1. स्पॉट परख के लिए एलबी एगर प्लेटों को तैयार करने के लिए, एक वर्ग पेट्री डिश (144 सेमी2) में 50 एमएल एलबी एगर डालें। प्रति समय बिंदु एक चौकोर पेट्री डिश तैयार करें। एलबी एगर को जमने दें, और उपयोग करने से पहले प्लेटों को सुखाएं।
  2. एक ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ 5 एमएल मध्यम (एमओपीएस ग्लूकोज 0.4%) को टीका लगाएं, और ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें।
  3. अगले दिन, ओडी600 एनएम को मापें, और ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में ताजा तापमान-समायोजित माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस, एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%) में संस्कृति को ~0.001 के अंतिम ओडी 600 एनएम तक पतला करें। 180 आरपीएम (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में संस्कृति को रात भर बढ़ने दें।
  4. अगले दिन, ओडी600 एनएम को मापें, और संस्कृति को 0.3 के अंतिम ओडी600 एनएम तक इनक्यूबेट करें।
  5. इनक्यूबेट करते समय, पहली पंक्ति (पंक्ति ए) के कुओं को छोड़कर हर कुएं में 0.01 एम एमजीएसओ4 घोल के 90 μL रखकर 96-वेल प्लेटें तैयार करें। चरण 3.7 में 96-वेल प्लेटों का उपयोग 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने के लिए किया जाएगा।
    नोट: इस प्रयोग में, दो उपभेदों (डब्ल्यूटी और एचयूपीए-एमचेरी स्ट्रेन) को सात अलग-अलग समय बिंदुओं पर तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया था। चूंकि एक प्लेट में 12 कॉलम होते हैं, इसलिए एक प्लेट का उपयोग दो समय बिंदुओं के लिए किया जा सकता है, और इस प्रकार, कुल चार प्लेटें तैयार की गईं।
  6. 0.3 के ओडी600 एनएम पर, प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के 200 μL को वापस लें। ये नमूने एंटीबायोटिक उपचार से पहले टी 0 (अनुपचारित) टाइमपॉइंट के अनुरूप हैं और एंटीबायोटिक उपचार से पहले सीएफयू-एमएल -1 के निर्धारण की अनुमति देते हैं।
  7. 3 मिनट के लिए 2,300 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन समय के दौरान, तरल संस्कृति में ओएफएक्स की वांछित एकाग्रता जोड़ें, और हिलाते समय 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना जारी रखें।
    नोट: यहां, ओएफएक्स का उपयोग 5 μg.mL-1 की एकाग्रता पर किया गया था (एमआईसी के अनुरूप 83 गुना गुणा)। पिछले अध्ययन में, इस एकाग्रता का उपयोग ओएफएक्स एक्सपोजर25 के तहत दृढ़ता की घटना को चिह्नित करने के लिए किया गया था। समय / हत्या परख के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबायोटिक एकाग्रता एंटीबायोटिक, संस्कृति माध्यम और जीवाणु विकास की स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकती है।
  8. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेल पेलेट को 0.01 एम एमजीएसओ4 समाधान के 200 μL में पुन: निलंबित करें। चरण 3.5 में तैयार 96-वेल प्लेट के खाली कुएं में 100 μL रखें। पंक्ति A में कुएं के 10 μL को पंक्ति B में कुएं में स्थानांतरित करके तनुकरण करें जिसमें 0.01 M MgSO4 का 90 μL है। पंक्ति B में कुएं के 10 μL को पंक्ति C में कुएं में स्थानांतरित करके सीरियल कमजोर पड़ने को जारी रखें। 10−7 के कमजोर पड़ने तक पहुंचने तक दोहराएं (प्रत्येक स्थानांतरण 10 गुना कमजोर पड़ने के साथ)।
    नोट: इस प्रयोग में, छह संस्कृतियों ( डब्ल्यूटी स्ट्रेन के लिए तीन और एचयूपीए-एमचेरी स्ट्रेन के लिए तीन) का हर टाइमपॉइंट के लिए परीक्षण किया गया था। प्रोटोकॉल के अनुसार, एक ही समय में छह उपभेदों के लिए सीरियल कमजोर पड़ने के लिए एक म्यूटी-चैनल पिपेट का उपयोग किया जाता है। तकनीकी त्रुटि को कम करने के लिए, पिपेट युक्तियों को हर हस्तांतरण के बीच बदल दिया जाता है।
  9. चरण 3.1 में तैयार एलबी एगर प्लेटों पर प्रत्येक तनुकरण का 10 μL स्पॉट करें।
    नोट: एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग एक साथ छह संस्कृतियों के लिए एक ही कमजोर पड़ने (जैसे, 10-4 कमजोर पड़ने) को देखने के लिए किया जाता है। स्पॉटिंग के दौरान, मल्टी-चैनल पिपेट के पहले स्टॉप का उपयोग दूसरे स्टॉप को धक्का दिए बिना किया जाना चाहिए, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप माइक्रोड्रॉपलेट्स को प्लेट पर वितरित किया जा सकता है।
  10. एंटीबायोटिक जोड़ने के बाद प्रासंगिक समय बिंदुओं पर, संस्कृति के 200 μL को वापस लें, और चरण 3.8 में वर्णित सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। चरण 3.9 में वर्णित प्रत्येक कमजोर पड़ने का स्पॉट 10 μL।
    नोट: यहां वर्णित प्रयोग के लिए, सात समय बिंदु एकत्र किए गए थे (टी 0, टी 1 एच, टी 2 एच, टी 3 एच, टी 4 एच, टी 5 एच, टी 6 एच)। डब्ल्यूटी की तुलना में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता में वृद्धि का प्रदर्शन करने वाले उपभेदों के लिए, अवशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं को हटाने के लिए एमजीएसओ4 0.01 एम में कई वॉश किए जा सकते हैं।
  11. प्लेटों को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, कॉलोनियों की संख्या को दो सबसे अधिक कमजोर पड़ने पर गिना जाए, जिनके लिए कॉलोनियों का पता लगाया जा सकता है। आदर्श रूप से, इन कमजोर पड़ने के लिए आगर प्लेटों पर धब्बे में 3 से 30 कॉलोनियां होती हैं जो प्रत्येक नमूने के लिए सीएफयू-एमएल -1 के सटीक निर्धारण की अनुमति देती हैं।
  12. प्रारंभिक जनसंख्या के सीएफयू-एमएल -1 द्वारा प्रत्येक समय बिंदु के गणना किए गए सीएफयू-एमएल -1 को टी 0 पर विभाजित करके उत्तरजीविता अनुपात की गणना करें।

4. टाइम-किल परख

नोट: जबकि स्पॉट परख किसी दिए गए एंटीबायोटिक के लिए दिए गए तनाव की जीवित रहने की दर का अनुमान लगाने के लिए उपयोग में आसान तरीका है, टाइम-किल परख एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन उत्तरजीविता दर देते हैं और बैक्टीरिया की व्यवहार्यता को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए किए जाते हैं। हत्या वक्र की प्रोफ़ाइल का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या कोई दिया गया जीवाणु तनाव किसी दिए गए स्थिति में एंटीबायोटिक के प्रति संवेदनशील, सहिष्णु या प्रतिरोधी है। इसके अलावा, टाइम-किल परख दृढ़ता घटना (बाइफैसिक किलिंग वक्र की दूसरी ढलान की शुरुआत) के साथ-साथ दृढ़ता आवृत्ति का पता लगाने के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक जोखिम के समय के निर्धारण की अनुमति देता है।

  1. टाइम-किल प्लेटिंग परख के लिए एलबी एगर प्लेट्स तैयार करें। पेट्री डिश (±57 सेमी 2) में25 एमएल एलबी आगर डालें। प्रति टाइमपॉइंट कम से कम दो पेट्री व्यंजन तैयार करें (प्रति तनाव प्रति टाइमपॉइंट पर दो कमजोर पड़ने वाले व्यंजन चढ़ाए जाते हैं)।
  2. एलबी एगर को जमने दें, और प्रत्येक प्लेट में पांच से आठ बाँझ ग्लास मोती जोड़ने से पहले प्लेटों को सुखाएं। तनाव/स्थिति/टाइमपॉइंट के अनुसार प्लेटों को इनवर्ट और लेबल करें।
    नोट: ग्लास मोती चरण 4.7 और चरण 4.9 के दौरान आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया के प्रसार की अनुमति देते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को स्प्रेडर का उपयोग करके आगर प्लेट पर फैलाया जा सकता है।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए, 0.01 एमजीएसओ4 समाधान के 900 μL युक्त 10 गुना सीरियल तनुकरण ग्लास ट्यूब तैयार करें। प्रति नमूना कमजोर पड़ने वाले ग्लास ट्यूबों की संख्या जिसे तैयार करने की आवश्यकता होती है, स्पॉट परख में कॉलोनियों का पता लगाने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने से मेल खाती है।
  4. एक ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ 5 एमएल मध्यम (एमओपीएस ग्लूकोज 0.4%) को टीका लगाएं, और ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें।
  5. 16 घंटे की वृद्धि के बाद, ओडी600 एनएम को मापें, और ग्लास ट्यूब में ताजा तापमान-समायोजित माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस, एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%) में संस्कृति को ~0.001 के अंतिम ओडी 600 एनएम तक पतला करें। 180 आरपीएम (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में संस्कृति को रात भर बढ़ने दें।
  6. अगले दिन, ओडी600 एनएम को मापें, और संस्कृति को 0.3 के अंतिम ओडी600 एनएम तक इनक्यूबेट करें।
  7. 0.3 के ओडी600 एनएम पर, कल्चर के 100 μL को वापस लें, स्पॉट परख में प्राप्त आंकड़ों के अनुसार पतला करें (0.3 के OD 600 nm पर और एंटीबायोटिक के बिना, 10−5 कमजोर पड़ने से आमतौर पर 200-300 कॉलोनियां मिलती हैं), और चरण 4.1-4.2 में तैयार एलबी एगर प्लेटों पर प्लेट 100 μL। डिश किनारों से संपर्क करने वाले मोतियों से बचने के लिए प्लेटों को धीरे से हिलाएं, क्योंकि इससे एलबी एगर माध्यम पर बैक्टीरिया कोशिकाओं का गैर-समरूप प्रसार हो सकता है। एंटीबायोटिक उपचार से पहले यह पहला नमूना टी 0 समय बिंदु (एंटीबायोटिक उपचार से पहले सीएफयूएमएल -1 ) से मेल खाता है।
  8. OFX की वांछित एकाग्रता जोड़ें, और हिलाते समय 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना जारी रखें।
    नोट: यहां, ओएफएक्स का उपयोग 5 μg.mL-1 की एकाग्रता पर किया गया था (एमआईसी के अनुरूप 83 गुना गुणा)।
  9. एंटीबायोटिक जोड़ने के बाद प्रासंगिक समय बिंदुओं पर, कल्चर के 100 μL को वापस लें, स्पॉट परख में प्राप्त आंकड़ों के अनुसार पतला करें, और चरण 4.1-4.2 में तैयार एलबी एगर प्लेटों पर प्लेट 100 μL। चरण 4.7 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को प्लेट करें।
    नोट: यहां वर्णित प्रयोग के लिए, सात समय बिंदु एकत्र किए गए थे (टी 0, टी 1 एच, टी 2 एच, टी 3 एच, टी 4 एच, टी 5 एच, टी 6 एच)। डब्ल्यूटी की तुलना में बढ़ी हुई एंटीबायोटिक संवेदनशीलता का प्रदर्शन करने वाले उपभेदों के लिए, अवशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं को हटाने के लिए एमजीएसओ4 0.01 एम में कई वॉश किए जा सकते हैं।
  10. प्लेटों को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, कॉलोनियों की संख्या को दो सबसे अधिक कमजोर पड़ने पर गिना जाए, जिनके लिए कॉलोनियों का पता लगाया जा सकता है। आदर्श रूप से, प्लेटों में प्रत्येक नमूने में सीएफयू-एमएल -1 के सटीक निर्धारण की अनुमति देने के लिए 30-300 कॉलोनियां होनी चाहिए।
  11. T0 पर CFU.mL-1 द्वारा प्रत्येक समय-बिंदु पर CFU.mL-1 को सामान्य करके उत्तरजीविता अनुपात की गणना करें। लॉग10 सामान्यीकृत CFU.mL-1 को समय के कार्य के रूप में प्लॉट करें।

5. माइक्रोफ्लुइडिक टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

नोट: निम्नलिखित खंड माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट की तैयारी के साथ-साथ टाइम-लैप्स छवि अधिग्रहण और छवि विश्लेषण प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस प्रयोग का उद्देश्य एकल-कोशिका स्तर पर एंटीबायोटिक उपचार पर दृढ़ता फेनोटाइप का निरीक्षण और विश्लेषण करना है। इस प्रयोग के दौरान एकत्र किए गए डेटा का उपयोग प्रयोग के दौरान संबोधित प्रश्न और / या फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के आधार पर परिणामों की एक विस्तृत श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रयोग में, सेल की लंबाई और एचयू-एमचेरी फ्लोरेसेंस22 का मात्रात्मक विश्लेषण, जो परसिस्टर और गैर-परसिस्टर कोशिकाओं में न्यूक्लियोइड संगठन को दर्शाता है, किया गया था।

  1. माइक्रोफ्लुइडिक टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के लिए बैक्टीरियल सेल कल्चर
    1. एक ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ मध्यम (एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%, यदि आवश्यक हो तो चयनात्मक एंटीबायोटिक के साथ पूरक) का टीका लगाएं, और ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें।
    2. अगले दिन, ओडी600 एनएम को मापें, और कांच की ट्यूब में ताजा तापमान-समायोजित माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस, एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%) में संस्कृति को ~0.001 के अंतिम ओडी 600 एनएम तक पतला करें। अगले दिन प्रारंभिक घातीय-चरण संस्कृति प्राप्त करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में संस्कृति को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) बढ़ने दें।
  2. माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट और टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की तैयारी
    नोट: माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोगों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (जैसा कि यहां वर्णित है) या इन-हाउस उत्पादित माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में किया जा सकता है।
    1. माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट के हर कुएं से संरक्षण समाधान (यदि मौजूद है) को हटा दें, और इसे एक ताजा संस्कृति माध्यम के साथ बदलें।
      नोट: यदि माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में एक अपशिष्ट आउटलेट अच्छी तरह से होता है, तो आउटलेट वेल के संरक्षण समाधान को हटा दिया जाना चाहिए लेकिन माध्यम द्वारा प्रतिस्थापित नहीं किया जाना चाहिए।
    2. सील बटन पर क्लिक करके या माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर के माध्यम से कई गुना सिस्टम के साथ माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करें (पहले टूल का चयन करें, उसके बाद सील प्लेट)।
      नोट: प्लेट को सील करने के लिए, प्लेट पर एक समान दबाव लागू किया जाना चाहिए और प्लेट को कई गुना के खिलाफ मैन्युअल रूप से निचोड़कर कई गुना। यदि सही तरीके से प्रदर्शन किया जाता है, तो नोट "सील" ONIX2 इंटरफ़ेस पर दिखाई देना चाहिए। कई गुना टूटने के किसी भी संभावित जोखिम से बचने के लिए ग्लास स्लाइड पर कोई दबाव लागू नहीं करना महत्वपूर्ण है।
    3. एक बार सील होने के बाद, पहला प्राइमिंग अनुक्रम निष्पादित करें (माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर रन लिक्विड प्राइमिंग सीक्वेंस पर क्लिक करें)।
      नोट: रन लिक्विड प्राइमिंग अनुक्रम कुएं 1-5 के लिए 6.9 केपीए पर छिड़काव के 5 मिनट से मेल खाता है, इसके बाद कुएं 8 के लिए 6.9 केपीए पर छिड़काव के 5 मिनट से मेल खाता है, और 6.9 केपीए पर 5 मिनट के लिए अच्छी तरह से 6 के लिए अंतिम छिड़काव राउंड होता है। रन लिक्विड प्राइमिंग सीक्वेंस संरक्षण समाधान को हटाने की अनुमति देता है जो अभी भी विभिन्न कुओं को जोड़ने वाले चैनलों में मौजूद हो सकता है।
    4. माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की शुरुआत से पहले न्यूनतम 2 घंटे के लिए वांछित तापमान (यहां, 37 डिग्री सेल्सियस) पर माइक्रोस्कोप के थर्मोस्टेटिक रूप से नियंत्रित कैबिनेट में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    5. प्रयोग शुरू करने से पहले एक दूसरा रन लिक्विड प्राइमिंग सीक्वेंस शुरू करें।
    6. माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर सील ऑफ पर क्लिक करके माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करें। कुएं 1 और कुएं 2 में माध्यम को 200 μL ताजा माध्यम के साथ बदलें, अच्छी तरह से 3 में एंटीबायोटिक युक्त 200 μL ताजा माध्यम के साथ (यहां, OFX 5 μ mL−1 पर), कुएं 4 और कुएं 5 में 200 μL ताजा माध्यम के साथ, कुएं 6 में 200 μL ताजा माध्यम के साथ, और अच्छी तरह से 8 में 200 μL संस्कृति नमूने के साथ (चरण 5.1.2 से) पतला करके600 nm तक पतला किया गया ताजा माध्यम में 0.01 की वृद्धि।
    7. चरण 5.2.2 में वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करें, और प्लेट को माइक्रोस्कोप कैबिनेट के अंदर माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर रखें।
      नोट: माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट रखने से पहले माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखना सुनिश्चित करें।
    8. माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर में, सेल लोडिंग पर क्लिक करें ताकि सेल को माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में ले जाने की अनुमति मिल सके।
      नोट: सेल लोडिंग चरण में कुएं 8 के लिए 13.8 केपीए पर छिड़काव के 15 एस शामिल हैं, इसके बाद वेल 6 और वेल 8 के लिए 27.6 केपीए पर 15 एस छिड़काव शामिल है, और 6.9 केपीए पर 30 सेकंड के लिए वेल 6 के लिए अंतिम छिड़काव राउंड है। प्रयोग के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में कोशिकाओं का घनत्व महत्वपूर्ण है। इस माइक्रोफ्लुइडिक प्रोटोकॉल के पहले भाग में एंटीबायोटिक उपचार से पहले एक ताजा माध्यम में 6 घंटे के लिए बढ़ते बैक्टीरिया होते हैं। विकास के 6 घंटे के बाद, सेल घनत्व दुर्लभ परसिस्टर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए (इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली स्थितियों में, परसिस्टर कोशिकाएं 10−4 की आवृत्ति पर उत्पन्न होती हैं)। यदि सेल घनत्व बहुत अधिक है, तो व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करना मुश्किल है, जो सटीक एकल-कोशिका विश्लेषण को रोकता है। चूंकि विकास दर सीधे माध्यम पर निर्भर है, प्रयोग शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोपी क्षेत्रों में कोशिकाओं के घनत्व का आकलन किया जाना चाहिए।
    9. संचारित प्रकाश मोड का उपयोग करके एक इष्टतम फोकस सेट करें, और रुचि के कई क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करें जहां एक उपयुक्त सेल संख्या देखी जाती है (प्रति क्षेत्र 300 कोशिकाओं तक)।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 40 ROIs का चयन करें कि दुर्लभ परसिस्टर कोशिकाओं को चित्रित किया गया है।
    10. माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ़्टवेयर पर, प्रोटोकॉल बनाएँ पर क्लिक करें। 6 घंटे (अच्छी तरह से 1-2) के लिए 6.9 केपीए पर ताजा माध्यम के इंजेक्शन को प्रोग्राम करें, इसके बाद 6 घंटे (अच्छी तरह से 3) के लिए 6.9 केपीए पर एंटीबायोटिक युक्त माध्यम का इंजेक्शन, और अंत में, 20 घंटे (कुएं 4-5) के लिए 6.9 केपीए पर ताजा माध्यम का इंजेक्शन।
      नोट:0.01 के ओडी 600 एनएम तक पतला एक जीवाणु संस्कृति बैक्टीरिया को 6 घंटे के लिए माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष में बढ़ने की अनुमति देती है, यह सुनिश्चित करती है कि कोशिकाएं घातीय विकास चरण में हैं। लोडिंग चरण के दौरान माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में पेश की गई कोशिकाओं की संख्या के आधार पर (चरण 5.2.8 देखें), विकास चरण की अवधि को प्रति आरओआई 300 कोशिकाओं तक प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जैसा कि दृढ़ता एक दुर्लभ घटना है, प्रति आरओआई कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि से परसिस्टर कोशिकाओं को देखने की संभावना में सुधार होता है। सेल संख्या, हालांकि, प्रति आरओआई 300 कोशिकाओं से अधिक नहीं होनी चाहिए, क्योंकि यह एकल-सेल विश्लेषण को थकाऊ बनाता है।
    11. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए संचारित प्रकाश और उत्तेजना प्रकाश स्रोत का उपयोग करके हर 15 मिनट में एक फ्रेम के साथ टाइम-लैप्स मोड में माइक्रोस्कोपी इमेजिंग करें। यहां, एमचेरी सिग्नल के लिए 560 एनएम उत्तेजना प्रकाश स्रोत का उपयोग किया गया था (फिल्टर 00 के साथ 10% शक्ति पर 580 एनएम एलईडी [530-585 एक्स, 615 एलपी एम, ज़ीस] और एमचेरी के लिए 100 एमएस एक्सपोजर)। Zeiss-संगत Zen3.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग सेल इमेजिंग के लिए किया गया था।
  3. छवि विश्लेषण
    नोट: माइक्रोस्कोपी छवियों का उद्घाटन और विज़ुअलाइज़ेशन ओपन-सोर्स इमेजजे / फिजी सॉफ्टवेयर (https://fiji.sc/)26 के साथ किया जाता है। फिजी सॉफ्टवेयर और मुफ्त माइक्रोबजे प्लगइन (https://microbej.com)27 का उपयोग करके मात्रात्मक छवि विश्लेषण किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, MicrobeJ 5.13I(14) संस्करण का उपयोग किया गया था।
    1. कंप्यूटर पर ImageJ / Fiji सॉफ़्टवेयर खोलें, और फिजी लोडिंग बार में हाइपरस्टैक टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी छवियों को खींचें। हाइपरस्टैक के विभिन्न चैनलों को फ्यूज करने के लिए छवि > रंग > समग्र बनाएं का उपयोग करें। यदि टाइम-लैप्स प्रयोग के चैनल वांछित रंग के अनुरूप नहीं हैं (उदाहरण के लिए, चरण कंट्रास्ट ग्रे के बजाय लाल रंग में दिखाया गया है), तो चैनलों पर उपयुक्त रंग लागू करने के लिए छवि > रंग > व्यवस्थित चैनलों का उपयोग करें।
    2. MicrobeJ प्लगइन खोलें, और मैन्युअल संपादन इंटरफ़ेस का उपयोग करके जीवाणु कोशिकाओं का पता लगाएं। स्वचालित रूप से पता लगाए गए कक्षों को हटाएँ, और मैन्युअल रूप से फ्रेम द्वारा रुचि फ़्रेम के परसिस्टर कक्षों को रेखांकित करें.
      नोट: अलग-अलग कोशिकाओं का स्वचालित रूप से पता लगाने के लिए विभिन्न सेटिंग्स का उपयोग किया जा सकता है। मैनुअल डिटेक्शन का उपयोग यहां किया गया था क्योंकि विश्लेषण किए गए परसिस्टर कोशिकाएं लंबे फिलामेंट्स बनाती हैं, जिन्हें स्वचालित पहचान का उपयोग करके शायद ही कभी सही ढंग से पता लगाया जाता है।
    3. पता लगाने के बाद, एक परिणामजे तालिका उत्पन्न करने के लिए MicrobeJ मैन्युअल संपादन इंटरफ़ेस में परिणाम आइकन का उपयोग करें। परिणामजे फ़ाइल सहेजें, और एकल-सेल विश्लेषण के रुचि के विभिन्न मापदंडों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए परिणामजे तालिका का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल के मामले में, एचयू-एमचेरी तीव्रता, सेल की लंबाई और व्यक्तिगत कोशिकाओं के सेल क्षेत्र की औसत प्रतिदीप्ति निर्यात की गई थी।

Representative Results

जैसा कि ऊपर वर्णित है, परसिस्टर कोशिकाओं के एकल-सेल फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले उपभेदों को एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% माध्यम में चित्रित किया गया था। समय के साथ ओडी600 एनएम की निगरानी ने डब्ल्यूटी और एचयूपीए-एमचेरी उपभेदों के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया (चित्रा 1)। यह इंगित करता है कि एचयू-एमचेरी संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति ने इन स्थितियों में विकास को प्रभावित नहीं किया। दोनों उपभेदों की जीवाणु कोशिकाओं को शुरू में0.01 के ओडी 600 एनएम पर टीका लगाया गया था, जो टीकाकरण के बाद ±8 घंटे के घातीय चरण में पहुंच गया।

ओएफएक्स के एमआईसी को मानकीकृत तरीकों (यहां, सीरियल एगर कमजोर पड़ने) द्वारा निर्धारित किया गया था। एमआईसी को न्यूनतम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है जहां कोई दृश्य वृद्धि का पता नहीं चलता है। दोनों उपभेदों के लिए ओएफएक्स का एमआईसी 0.06 μg.mL-1 निर्धारित किया गया था, यह दर्शाता है कि इसोजेनिक डब्ल्यूटी स्ट्रेन (चित्रा 2) की तुलना में एचयूपीए-एमचेरी संलयन का ओएफएक्स की संवेदनशीलता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

हमने इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले दोनों उपभेदों की व्यवहार्यता पर एक घातक ओएफएक्स उपचार (83 गुना एमआईसी) के प्रभाव को निर्धारित किया। चूंकि ओएफएक्स एक्सपोजर के साथ व्यवहार्य सेल गिनती समय के साथ कम हो जाती है, इसलिए प्रति प्लेट 30 से 300 कॉलोनियों तक पहुंचने के लिए बैक्टीरियल कल्चर के कमजोर पड़ने को उचित रूप से समायोजित करने की आवश्यकता होती है। समय के साथ उपयुक्त कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए, एक स्पॉट परख का प्रदर्शन किया गया था, जहां मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके स्क्वायर पेट्री व्यंजनों पर 0 से 10-7 सीरियल 10 गुना कमजोर पड़ने से 10 μL रखा गया था। उपयुक्त कमजोर पड़ने वाले वे थे जहां पृथक क्लोन दिखाई दे रहे थे (उदाहरण के लिए, t0 = 10−5, t1h = 10−4/10−3, t4h = 10−2/10−1) (चित्र 3)।

जबकि स्पॉट परख ओएफएक्स-मध्यस्थता हत्या के कैनेटीक्स में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने का एक आसान तरीका है, यह हत्या की गतिशीलता को सटीक रूप से निर्धारित करने में विफल रहता है। जब ओएफएक्स के साथ इलाज की जाने वाली तेजी से बढ़ती कोशिकाओं की व्यवहार्यता की निगरानी टाइम-किल परख द्वारा की गई थी, तो एक विशिष्ट द्विध्रुवीय वक्र देखा गया था (चित्रा 4)। वक्र का पहला ढलान गैर-परसिस्टर आबादी (लाल डैश्ड लाइन) की तेजी से हत्या को दर्शाता है। यहां परीक्षण की गई स्थितियों में, ओएफएक्स की उपस्थिति में 3 घंटे के बाद 99.9% तक कोशिकाएं कॉलोनियां बनाने में असमर्थ थीं। हत्या के इस पहले चरण के बाद एक दूसरा चरण होता है, जो धीमी हत्या दर (नीली डैश्ड लाइन) दिखाता है, जो दवा-सहिष्णु परसिस्टर कोशिकाओं की उपस्थिति का खुलासा करता है। परीक्षण की गई स्थितियों में, ओएफएक्स जोड़ने के लगभग 3 घंटे बाद परसिस्टर चरण शुरू हुआ, जिसमें परसिस्टर फेनोटाइप्स की जांच करने के लिए कोशिकाओं को 3 घंटे से अधिक समय तक ओएफएक्स में उजागर करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया। महत्वपूर्ण रूप से, टाइम-किल वक्र से पता चलता है कि हूपा-एमचेरी फ्यूजन प्रोटीन का टाइम-किल कैनेटीक्स पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। ट्रांसलेशनल फ्लोरोसेंट फ्यूजन को एन्कोडिंग करने वाले तनाव का उपयोग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके परसिस्टर कोशिकाओं की निगरानी के लिए किया जा सकता है।

हमने आगे एकल-कोशिका स्तर पर दृढ़ता की घटना की जांच की। ऐसा करने के लिए, एचयूपीए-एमचेरी स्ट्रेन को एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में पेश किया गया था, जिसने किसी दिए गए आरओआई पर टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी करते समय मध्यम स्थितियों (यहां, विकास, उपचार और वसूली) के परिवर्तन की अनुमति दी थी। माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग के पहले चरण के दौरान, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में पेश की गई कोशिकाओं को विकास माध्यम (एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%) के साथ जोड़ा गया था और ~ 2 घंटे (चित्रा 5 और चित्रा 6) के पीढ़ी के समय के साथ विभाजित किया गया था। विकास का यह पहला चरण इंगित करता है कि ओएफएक्स उपचार से पहले कोशिकाएं व्यवहार्य और सक्रिय रूप से विभाजित थीं।

विकास के इस पहले चरण के बाद, कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए 5 μg.mL-1 OFX के साथ पूरक विकास माध्यम के साथ जोड़ा गया था। जैसे ही एंटीबायोटिक कोशिकाओं तक पहुंचा, कोशिका विभाजन अवरुद्ध हो गया (चित्रा 5 और चित्रा 6)। ओएफएक्स उपचार के 6 घंटे के बाद, कोशिकाओं को ताजा माध्यम के साथ संक्रमित किया गया था। जबकि अधिकांश कोशिकाएं विकास को फिर से शुरू करने में असमर्थ थीं (चित्रा 5 और चित्रा 6), बैक्टीरिया की एक छोटी उप-आबादी फिलामेंटस कोशिकाओंको बढ़ावा देने और उत्पन्न करने में सक्षम थी। ये कोशिकाएं, जो ओएफएक्स उपचार के बाद व्यवहार्य बेटी कोशिकाओं को विभाजित करने और उत्पन्न करने में सक्षम थीं, को परसिस्टर कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया जा सकता है।

चूंकि यह सेटअप उपचार से पहले, दौरान और बाद में परसिस्टर कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, यह न केवल वसूली चरण के दौरान परसिस्टर फेनोटाइप के बारे में जानकारी प्रदान करता है, बल्कि उपचार से पहले परसिस्टर कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति के बारे में भी जानकारी प्रदान करता है (चित्रा 6)। परीक्षण की गई स्थितियों में, परसिस्टर कोशिकाओं को ओएफएक्स उपचार से पहले गैर-परसिस्टर कोशिकाओं के समान विभाजित किया गया था, यह दर्शाता है कि देखी गई परसिस्टर कोशिकाएं निष्क्रिय उप-जनसंख्या (चित्रा 6)25 से उत्पन्न नहीं हुई थीं।

रिकवरी चरण के दौरान परसिस्टर कोशिकाओं के सेल लंबाई विश्लेषण से पता चला कि प्रत्येक फिलामेंट में बढ़ाव की एक विशिष्ट दर थी। पहले डिवीजन से पहले प्रत्येक परसिस्टर द्वारा पहुंचने वाली कोशिका की लंबाई एक परसिस्टर से दूसरे में भिन्न होती है। इसी तरह, प्रथम श्रेणी की घटना का समय अत्यधिक विषम था (चित्रा 6)। विभाजित परसिस्टर फिलामेंट ने कई बेटी कोशिकाओं को उत्पन्न किया, जो अधिकांश भाग के लिए, अनुपचारित कोशिकाओं के समान बढ़ने और विभाजित होने लगे (चित्रा 7)। फिलामेंट के क्रमिक विभाजन के परिणामस्वरूप कोशिका की लंबाई में प्रगतिशील कमी आई, अंततः ओएफएक्स उपचार (चित्रा 6 और चित्रा 7 बी) से पहले समान सेल लंबाई वाली बेटी कोशिकाओं को जन्म दिया। अधिकांश कोशिकाएं ओएफएक्स हटाने के बाद फिलामेंटेशन को प्रेरित करने में असमर्थ थीं। यह बड़ी कोशिका आबादी मृत कोशिकाओं से मेल खाती है (चित्रा 5 और चित्रा 6)।

न्यूक्लियोइड से जुड़े प्रोटीन एचयू का फ्लोरोसेंट संलयन न्यूक्लियोइड22 की गतिशीलता के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। सेल के भीतर एचयू-एमचेरी की कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण डीएनए सामग्री22,25 के लिए प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। विकास चरण के दौरान (ओएफएक्स उपचार से पहले), कुल एमचेरी फ्लोरेसेंस तीव्रता भिन्न होती है, जो कोशिका चक्र के दौरान गुणसूत्र प्रतिकृति और अलगाव की गतिशीलता को दर्शाती है (चित्रा 8)। ओएफएक्स जोड़ने के बाद, एमचेरी फ्लोरेसेंस मध्य-कोशिका में बढ़ गया, जो न्यूक्लियोइड संघनन का संकेत है, जिसे डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक28 (चित्रा 5) के गठन से प्रेरित दिखाया गया है। डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक ओएफएक्स की कार्रवाई के तंत्र का एक परिणाम है, जो टाइप II टोपोइसोमेरेस डीएनए-गाइरेस और टोपोइसोमेरेस IV29,30 को भ्रष्ट करता है। ई कोलाई में, डीएनए-गाइरेस ओएफएक्स29,30 का प्राथमिक लक्ष्य है। डबल-स्ट्रैंड मार्ग तंत्र के एक महत्वपूर्ण चरण में अपने लक्ष्य को बांधकर, ओएफएक्स क्लीवर डीएनए स्ट्रैंड के रेलीगेशन को रोकता है, जिससे अंततः डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक30 की रिहाई होती है। जैसा कि ऊपर वर्णित है, ओएफएक्स उपचार के लिए परसिस्टर कोशिकाओं ने वसूली25 (चित्रा 6) के दौरान फिलामेंट करना शुरू कर दिया। सेल की लंबाई में वृद्धि कुल एमचेरी फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि के साथ सहसंबद्ध है, जो प्रतिकृति पुनरारंभ और फिलामेंट25 (चित्रा 7 ए और चित्रा 8) में न्यूक्लियोइड बहुतायत में वृद्धि को दर्शाती है। मृत कोशिकाओं के लिए, उपचार के दौरान और वसूली चरण के दौरान कुल एमचेरी फ्लोरेसेंस तीव्रता स्थिर रही, यह दर्शाता है कि ये कोशिकाएं ओएफएक्स हटाने के बाद अपने गुणसूत्रों को दोहराने में असमर्थ थीं (चित्रा 8)। कोलाई एचयू-एमचेरी कोशिकाओं के माइक्रोफ्लुइडिक वीडियो (वीडियो 1) को ओफ्लॉक्सिन उपचार से पहले, दौरान और बाद में भी दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: डब्ल्यूटी और एचयूपीए-एमचेरी ई कोलाई उपभेदों की विकास निगरानी। डब्ल्यूटी (काले) और एचयूपीए-एमचेरी (लाल) के ऑप्टिकल घनत्व निगरानी (ओडी600 एनएम)। रंग और धराशायी रेखाएं जैविक तीन प्रतियों के मानक विचलन को इंगित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: डब्ल्यूटी और एचयूपीए-एमचेरी ई कोलाई उपभेदों के लिए ओएफएक्स के एमआईसी का निर्धारण। डब्ल्यूटी (♦) और एचयूपीए-एमचेरी (●) को एलबी माध्यम में उगाया गया था, और ओएफएक्स युक्त एलबी एगर के सीरियल कमजोर पड़ने पर 2 μL को देखा गया था (प्रत्येक पैनल में μmL-1 में इंगित एकाग्रता)। विकास अवरोध न्यूनतम 0.06 μg.mL-1 पर दिखाई देता है। यह आंकड़ा जैविक तीन प्रतियों का एक प्रतिनिधि प्रयोग है। स्केल पट्टी = 1 सेमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओएफएक्स के संपर्क में आने पर डब्ल्यूटी और एचयूपीए-एमचेरी ई कोलाई उपभेदों की स्पॉट परख। प्रोटोकॉल (खंड 3) में वर्णित एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% में (ए) डब्ल्यूटी और (बी) एचयूपीए-एमचेरी उपभेदों को उगाया गया था, और तेजी से बढ़ती कोशिकाओं (ओडी600 एनएम = 0.3) को 5 μg.mL-1 OFX के साथ इलाज किया गया था। टी 0 ओएफएक्स को जोड़ने से पहले समय बिंदु से मेल खाती है। टी 1, टी 2, टी 3, टी 4, टी 5, और टी 6 ओएफएक्स जोड़ने के बाद 1-6 घंटे के अनुरूप हैं। यह आंकड़ा जैविक तीन प्रतियों का एक प्रतिनिधि प्रयोग है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ओएफएक्स के संपर्क में आने पर डब्ल्यूटी और एचयूपीए-एमचेरी ई कोलाई उपभेदों की टाइम-किल परख। डब्ल्यूटी (♦) और एचयूपीए-एमचेरी (●) उपभेदों को प्रोटोकॉल (अनुभाग 4) में वर्णित एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% में उगाया गया था, और तेजी से बढ़ती कोशिकाओं (ओडी600 एनएम = 0.3) को 5 μg.mL-1 OFX के साथ इलाज किया गया था। धराशायी रेखाएं पहले "रैपिड" (लाल) हत्या चरण और दूसरे "धीमी" (नीली) हत्या चरण को इंगित करती हैं, जो संवेदनशील और लगातार उप-आबादी (क्रमशः टी 0 और टी 2 के बीच रैखिक प्रतिगमन द्वारा प्राप्त) के अनुरूप होती हैं। त्रुटि पट्टियाँ जैविक तीन प्रतियों के मानक विचलन को इंगित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके ओएफएक्स परसिस्टर और मृत कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियां हूपा-एमचेरी स्ट्रेन (ग्रे में चरण कंट्रास्ट, लाल रंग में एचयू-एमचेरी सिग्नल) के साथ किए गए माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग के प्रासंगिक समय बिंदुओं को दिखाती हैं। टैग किए गए एचयूपीए-एमचेरी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट (यहां, 4 घंटे) में उगाया गया था, इसके बाद एक ओएफएक्स चैलेंज (5 μg.mL-1) था। ओएफएक्स की उपस्थिति में 6 घंटे के बाद, कोशिकाओं को ताजा माध्यम से संक्रमित किया गया, जिससे परसिस्टर कोशिकाओं को ठीक होने की अनुमति मिली। ओएफएक्स उपचार के दौरान और ओएफएक्स हटाने के बाद परसिसर सेल और इसकी संतान कोशिकाओं को क्रमशः हरे और नीले रंग में हाइलाइट किया जाता है। संबंधित समय बिंदु प्रत्येक पैनल पर इंगित किए जाते हैं। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: परसिस्टर और मृत कोशिकाओं की लंबाई का माइक्रोस्कोपी टाइम-लैप्स विश्लेषण। मृत कोशिकाओं (लाल, एन = 109 में) और परसिस्टर कोशिकाओं (ग्रे में, एन = 13) का सेल लंबाई विश्लेषण। OFX उपचार (5 μg.mL-1) की शुरुआत लाल डैश्ड लाइन (5 घंटे) द्वारा इंगित की जाती है, और ओएफएक्स हटाने को नीली डैश्ड लाइन द्वारा इंगित किया जाता है। इनसेट ओएफएक्स जोड़ने से पहले विकास चरण से मेल खाता है। प्रयोगों को तीन प्रतियों में किया गया था। रंग और धराशायी रेखाएं मृत कोशिका आबादी (एन = 109) के लिए मानक विचलन का संकेत देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
(ए) ओएफएक्स हटाने के बाद 8.5 घंटे के दौरान फिलामेंट डिवीजनों द्वारा उत्पन्न एक प्रतिनिधि ओएफएक्स परसिस्टर और उसकी बेटी कोशिकाओं का काइमोग्राफ (माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग की शुरुआत के बाद 18.5 घंटे, जिसमें 4 घंटे की वृद्धि, 5 μg.mL-1 OFX उपचार का 6 घंटे और OFX हटाने के बाद 8.5 घंटे की वसूली शामिल है)। एक फ्रेम 15 मिनट से मेल खाता है। स्केल बार = 5 μm. (B) A में परसिस्टर काइमोग्राफ से उत्पन्न मास्क। मॉनिटर किए गए परसिस्टर सेल को नीले रंग की रूपरेखा के साथ इंगित किया जाता है, और बेटी कोशिकाओं को अलग-अलग रंगों में हाइलाइट किया जाता है। (सी) बी से उत्पन्न परसिस्टर सेल वंश का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। रंग कोडिंग B के समान है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: प्रतिनिधि परसिस्टर और मृत कोशिकाओं के सेल की लंबाई और एमचेरी फ्लोरेसेंस विश्लेषण। माइक्रोफ्लुइडिक टाइम-लैप्स प्रयोग के दौरान एक प्रतिनिधि परसिस्टर (ठोस काली और लाल रेखाओं) और एक प्रतिनिधि मृत कोशिका (डैश्ड ब्लैक और रेड लाइन) की सेल लंबाई (बाएं अक्ष) और कुल एचयू-एमचेरी फ्लोरेसेंस तीव्रता (दाएं अक्ष, मनमानी इकाइयों में दिखाया गया) का विश्लेषण। OFX उपचार की शुरुआत (5 μg.mL-1) को लाल डैश्ड लाइन द्वारा इंगित किया जाता है, और ओएफएक्स को नीली डैश लाइन द्वारा हटा दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: ओफ्लॉक्सासिन उपचार से पहले, दौरान और बाद में ई कोलाई एचयू-एमचेरी कोशिकाओं का माइक्रोफ्लुइडिक वीडियो। माइक्रोफ्लुइडिक टाइम-लैप्स इमेजिंग एचयू-एमचेरी कोशिकाओं को दिखाती है। कोशिकाओं को एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% में 4 घंटे के लिए उगाया गया था। ओएफएक्स उपचार के 6 घंटे (5 μg.mL-1) के बाद, एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम को माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में डाला गया था ताकि परसिस्टर कोशिकाओं को ठीक करने की अनुमति मिल सके। स्केल बार = 5 μm. समय (मिनट में) इंगित किया गया है। विकास और वसूली चरणों को "एमओपीएस-ग्लाइ" द्वारा इंगित किया जाता है। 0.4%" और ओएफएक्स उपचार "ओएफएक्स 5 μg / mL" द्वारा। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

10x MOPS
स्टॉक समाधान 10x MOPS के 1 L के लिए स्टॉक समाधान की मात्रा 10x MOPS आधार में अंतिम एकाग्रता
एमओपीएस एसिड 1 एम (KOH का उपयोग करके pH 7.4 में समायोजित) 400 mL 0.4 M
ट्राइसिन 1 एम (KOH का उपयोग करके pH 7.4 में समायोजित) 40 mL 0.04 M
FeSO4.7H2O 0.01 M 10 mL 0.0001 M
NH4Cl 1.9 M 50 mL 0.095 M
K2SO4  0.276 M 10 mL 0.00276 M
CaCl2.2H 2O 0.0005 M 10 mL 0.000005 M
MgCl 2.6H2O 0.528 M 10 mL 0.00528 M
NaCl सीधे 29.2 ग्राम जोड़ें 0.5 M
आसुत जल 460 एमएल
सूक्ष्म पोषक तत्व 1000x (तालिका 2 देखें) 10 mL

तालिका 1: 10x MOPS की संरचना।

सूक्ष्म पोषक तत्व 1000x
सूक्ष्म पोषक तत्वों में एकाग्रता 1000x स्टॉक समाधान 10x MOPS आधार में अंतिम एकाग्रता
(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.000003 M 0.00000003 M
H3BO3 0.0004 M 0.000004 M
CoCl2.6H 2O 0.00003 M 0.0000003 M
CuSO4.5H 2O 0.00001 M 0.0000001 M
MnCl2.4H 2O 0.00008 M 0.0000008 M
ZnSO.7H2O 0.00001 M 0.0000001M

तालिका 2: 1,000x सूक्ष्म पोषक तत्वों की संरचना।

एमओपीएस ग्लूकोज 0.4% या एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%
स्टॉक समाधान 1 एल एमओपीएस ग्लूकोज 0.4% या एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% के लिए मात्रा एमओपीएस ग्लूकोज में अंतिम एकाग्रता 0.4% या एमओपीएस ग्लिसरल 0.4%
10x MOPS तालिका 1 देखें 100 mL
K2HPO4 0.132 M 10 mL 0.00132 M
ग्लूकोज (एमओपीएस ग्लूकोज 0.4%) के लिए 20% (100 एमएल आसुत जल में 20 ग्राम) 20 mL 0.40%
ग्लिसरॉल (एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% के लिए) ≤99% 4 mL 0.40%
आसुत जल एमओपीएस ग्लूकोज के लिए 870 एमएल 0.4% या एमओपीएस ग्लिसरॉल के लिए 886 एमएल 0.4%

तालिका 3: एमओपीएस ग्लूकोज 0.4% और एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% की संरचना।

Discussion

इस पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल जनसंख्या और एकल-कोशिका स्तरों पर एंटीबायोटिक उपचार के जवाब में देखे गए दृढ़ता फेनोटाइप के विश्लेषण की अनुमति देता है। प्रयोग ई कोलाई एमजी 1655 स्ट्रेन के साथ किए गए थे, जिसे रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम (एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%) में उगाया गया था। घातीय-चरण संस्कृतियों पर टाइम-किल परख और माइक्रोस्कोपी प्रयोग किए गए थे। हमने परसिस्टर कोशिकाओं को प्रकट करने के लिए 5 μg.mL-1 की एकाग्रता पर OFX, एक फ़्लोरोक्विनोलोन का उपयोग किया। यहां वर्णित दृष्टिकोण को अन्य जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक दवाओं पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि β-लैक्टम, एमिनोग्लाइकोसाइड, या रोगाणुरोधी यौगिक31। तदनुसार, अन्य जीवाणु उपभेदों, मीडिया या विकास स्थितियों का उपयोग किया जा सकता है। यहां वर्णित एक समान सेटअप में विभिन्न फ्लोरोसेंट संलयन की निगरानी करना सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे डीएनए प्रतिकृति 32, डीएनए मरम्मत25,33, और कोशिका विभाजन 34 एंटीबायोटिक उपचार से पहले, दौरान और बाद में उपयोगी हो सकता है। इसी तरह, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग सेल फिजियोलॉजी के अलग-अलग पहलुओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि इंट्रासेल्युलर पीएच35, एटीपी36, या आरओएस37 स्तर। वैकल्पिक रूप से फ्लोरोसेंट संलयन के लिए, रासायनिक रंगों को भी लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एचयूपीए-एमचेरी संलयन को 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, एक फ्लोरोसेंट डाई जो डीएनए38 को दाग देता है। हालांकि, इस तरह के फ्लोरोसेंट रंगों के साथ युग्मित टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन करने से बचा जाना चाहिए, क्योंकि ये धुंधला तकनीक समय-चूक प्रयोगों के दौरान सेल चक्र की गतिशीलता को परेशान कर सकती है। वैकल्पिक रूप से, ऐसे प्रयोगों को प्रासंगिक टाइमपॉइंट पर स्नैप-शॉट इमेजिंग के टाइम-कोर्स विश्लेषण द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

जबकि ऐसे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सहायक होते हैं, चरण-कंट्रास्ट छवियों के विश्लेषण के माध्यम से निकाली जा सकने वाली जानकारी की मात्रा की उपेक्षा नहीं की जानी चाहिए। यहां, हमने विकास, ओएफएक्स उपचार और वसूली चरणों में सेल लंबाई विकास की निगरानी की। चरण-कंट्रास्ट छवियों पर आधारित अन्य पैरामीटर, जैसे सेल की चौड़ाई, चरण-कंट्रास्ट तीव्रता, और जीवाणु कोशिकाओं की वक्रता, को भी पर्याप्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आसानी से निकाला जा सकता है, जैसे कि माइक्रोबजे27।

सारांश में, यहां वर्णित प्रक्रिया को बदलते वातावरण या तनाव18,19 के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए अन्य स्थितियों और जीवाणु प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है। जनसंख्या विश्लेषण के साथ संयोजन में अन्य फ्लोरोसेंट संवाददाताओं (ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल रिपोर्टर, रासायनिक डाई) का उपयोग करके, जैसे कि फ्लो साइटोमेट्री / एफएसीएस, दिलचस्प प्रश्नों को बहु-स्तरीय ढांचे में संबोधित किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

वैन मेल्डरेन प्रयोगशाला में काम एआरसी कार्यों 2018-2023, द फोंड्स नेशनल डे ला रेचरचे साइंटिफिक (एफएनआरएस सीडीआर जे.0182.21 एफ) द्वारा समर्थित है। टीओ एक यूएलबी फैलोशिप द्वारा समर्थित है। टीएस एक एफआरआईए फैलोशिप (एफएनआरएस) द्वारा समर्थित है। जेसी एक पोस्ट-डॉक्टरेट फैलोशिप "चारगे डी रेचरचेस" (एफएनआरएस) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axio Observer Zeiss Inverted fluorescence microscope
CaCl2.2H2O  Merck 1.02382.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CellASIC ONIX Microfluidic System  Merck CAX2-S0000  Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG Merck ONIX2 1.0.1  Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic  Merck CAX2-MBC20 Manifold system
CoCl2.6H2O Merck 1.02539.0100 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CuSO4.5H2O Merck 1.02790.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
D-(+)-glucose Sigma Aldrich G7021-1KG Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) BE10 wt reference strain, lab strain
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT BE16 HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain
FeSO4.7H2O  VWR Chemicals 24244.232 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Fiji ImageJ https://fiji.sc/  Image software; Schindelin et al. if used in publication
Glycerol Merck 56815 Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium
Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate Merck M8812-100EA 24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader
H3BO3  Sigma-Aldrich B6768-1KG For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera Hamamatsu C13440-20CU Digital Image Acqusition
K2HPO4 Merck 1.05099.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
KOH Merck 1.05029.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
K2SO4  Merck 1.05153.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Luria-Broth agar medium Invitrogen 22700041 Growth medium for plating assay
Luria-Broth medium Invitrogen 12780029 Growth medium for MIC determination
MgCl2.6H2O  Merck 1.05832.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MgSO4 Merck 7487-88-9 Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM
MicrobeJ  Imagej/Fiji plugin https://www.microbej.com/ Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. 
Microfluidic Plates CellASIC ONIX Merck B04A-03-5PK  Plate for microfluidic system
MnCl2.4H2O Merck 1.05927.0100 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MOPS, Free Acid ULTROL® Grade Merck 475898-500GM For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NaCl SIgma-Aldrich S5886-1KG For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
(NH4)6Mo7O24.4H2O Merck 1.01180.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NH4Cl  Merck 1.01145.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Ofloxacin Merck 82419-36-1 Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x Merck P3813 Dilution buffer
GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer Thermofisher Scientific  840-208200 UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm
SoftMax Pro Molecular Devices Microplate reader software
SpectraMax i3x Molecular Devices Microplate reader
N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine Merck 1.08602.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Zeiss® immersion Oil 518F Zeiss Immersion oil to increase resolution of microscope
Zen3.2 Pro Zeiss Microscopic image acquisition and processing software
ZnSO4.7H2O  Merck 1.08883.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium

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जीव विज्ञान अंक 193 एंटीबायोटिक दृढ़ता जनसंख्या विश्लेषण एकल-कोशिका विश्लेषण एस्चेरिचिया कोलाई ओफ्लोक्सासिन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी माइक्रोफ्लुइडिक्स
<em>एस्चेरिचिया कोलाई</em> में एंटीबायोटिक दृढ़ता की जनसंख्या और एकल-कोशिका विश्लेषण
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Oms, T., Schlechtweg, T., Cayron,… More

Oms, T., Schlechtweg, T., Cayron, J., Van Melderen, L. Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (193), e64550, doi:10.3791/64550 (2023).

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