Summary
Antibiyotik kalıcılığı, hassas bir izojenik popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme yeteneğini tanımlar. Bu protokol, Escherichia coli'yi ölümcül ofloksasin dozlarına maruz bıraktıktan sonra moleküler ve hücresel seviyelerde antibiyotik kalıcılık fenotipini karakterize etmek için yaklaşımları birleştirmektedir.
Abstract
Antibiyotik kalıcılığı, küçük bakteri alt popülasyonlarının yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme kapasitesini ifade eder. Bakterisidal antibiyotik tedavisi üzerine, bakteri popülasyonunun büyük kısmı hızla öldürülür. Öldürmenin bu ilk hızlı aşamasını, kalıcı hücreler canlı kaldığı için öldürme oranında önemli bir azalma izler. Klasik olarak, kalıcılık popülasyon düzeyinde yüksek dozda antibiyotiklerle yapılan zaman / öldürme testleri ve tanımlanmış maruz kalma süreleri ile belirlenir. Bu yöntem, persister hücrelerin seviyesi ve öldürücü kinetik hakkında bilgi sağlarken, kalıcılık fenomeninin altında yatan içsel hücreden hücreye heterojenliği yansıtmakta başarısız olur. Burada açıklanan protokol, klasik zaman / öldürme tahlillerini gerçek zamanlı floresan mikroskobu kullanarak tek hücreli analizle birleştirir. Uygun floresan muhabirleri kullanarak, canlı hücrelerin mikroskopi görüntülemesi, antibiyotiğin kromozom replikasyonu ve ayrışması, hücre uzaması ve hücre bölünmesi gibi hücresel süreçler üzerindeki etkileri hakkında bilgi sağlayabilir. Popülasyon ve tek hücreli analizin birleştirilmesi, kalıcılık fenotipinin moleküler ve hücresel karakterizasyonuna izin verir.
Introduction
Bu protokol, tek hücreli ve popülasyon seviyelerinde spesifik antibiyotik tedavisine yanıt olarak bakteriyel kalıcılık fenotipini analiz etmeyi amaçlamaktadır. Kalıcılık, izojenik bir popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotiklere (florokinolonlar, aminoglikozitler, β-laktamlar, vb.) dayanma kapasitesini tanımlar; sözde persister hücrelerin minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC), popülasyonun büyük bir kısmınınkiyle aynıdır. Bifazik öldürme dinamikleri, bir antibiyotik varlığında zaman içinde bakteriyel sağkalımı ölçerken, geçici olarak ilaca toleranslı hücrelerin varlığını, kalıcı olmayan hücrelerin başlangıçta hızlı bir şekilde yok edilmesini, ardından kalıcı hücrelerin çok daha yavaş bir öldürme oranını ortaya koymaktadır. Antibiyotiklerin uzaklaştırılması üzerine, bu hücreler aynı antibiyotik ile tedavi edildiğinde benzer öldürme dinamikleri gösteren genetik olarak özdeş bir popülasyona yol açar 1,2. Kalıcılığın aksine, antibiyotik direnci popülasyon düzeyinde tanımlanır ve genellikle de novo mutasyonların veya direnç kazandıran plazmid3'ün yatay gen transferinin bir sonucudur. Dirençten sorumlu mutasyonlar çoğunlukla ilacın hedefinde veya ilaç efflux pompalarının promotor bölgelerinde bulunurken, genom çapında ve hedeflenen mutant analiz yaklaşımları ile tanımlanan kalıcılık frekansını değiştiren genlerin çok sayıda ve çeşitli olduğu kanıtlanmıştır 2,3,4,5,6,7,8 . Bu nedenle, bakteri hücrelerinin 9,10,11 numaralı çoklu yollardan persister duruma girmesi muhtemeldir ve bu persister hücrelerin fizyolojisini karakterize etmek için kalıcılık fenomenini tek hücre düzeyinde araştırmak için yaklaşımlara ihtiyaç vardır.
Floresan mikroskobu ile kombinasyon halinde kullanılan mikroakışkan aletlerin son zamanlardaki gelişimi, kalıcılık fenotipinin karakterizasyonunun yolunu açmış ve kromozom replikasyonu12, DNA onarımı13 ve hücre bölünmesi14 gibi anahtar hücresel süreçlerin kalıcı hücre oluşumundaki rolünü vurgulamıştır. Bu yazıda, yüksek dozda ofloksasin ile tedavi edilen katlanarak büyüyen Escherichia coli kültürlerinde üretilen kalıcı hücreleri karakterize etmek için klasik mikrobiyoloji tahlillerini tek hücreli canlı görüntüleme ile birleştiren entegre bir yaklaşım açıklanmaktadır. Burada açıklanan protokol, Bacillus subtilis15 gibi diğer bakteri türlerinde veya koşullarda (örneğin, β-laktam tedavisini takiben antibiyotik kalıcılığı 16) antibiyotik kalıcılığı fenomenini incelemek için uygulanabilir ve fenotipik heterojenliği içeren birçok fenomeni araştırmak için kolayca değiştirilebilir17,18,19 . Ayrıca, bu makalede açıklanan kurulum, tek hücreli düzeyde pH20 veya ATP21'in hücre içi seviyeleri gibi ilgilenilen farklı hücresel parametreleri araştırmak için diğer floresan muhabirlerle birleştirilebilir ve bu da antibiyotik kalıcılığı fenomeni hakkında potansiyel olarak yeni bilgiler üretebilir.
Protocol
NOT: Steril kültür cam eşyaları, pipet uçları ve büyüme ortamı kullanın. Burada, E. coli hücreleri kimyasal olarak tanımlanmış düşük otofloresanslı bir ortamda yetiştirilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Kontaminasyon riskini en aza indirmek için aşılamalar bir Bunsen brülörü varlığında gerçekleştirildi.
1. Hücre kültürü ve büyüme eğrisi
- Bir Luria-Bertaini (LB) agar plakası (gerekirse seçici bir antibiyotik ile desteklenmiş) üzerinde dondurulmuş bir gliserol stoğundan gelen ilgi suşunu çizin ve tek koloniler elde etmek için gece boyunca 37 ° C'de (15 saat ile 19 saat arasında) inkübe edin.
NOT: Burada sunulan deney, wt suşuna karşılık gelen E. coli K-12 MG1655 ve izojenik MG1655 hupA-mCherry suşu22 olmak üzere iki suş kullanmaktadır. İkinci suş, HU nükleoid ile ilişkili proteinin floresan etiketli α alt birimini ifade eder. HupA-mCherry muhabiri, hupA'nın doğal lokusuna entegre edilmiştir. HU-mCherry, DNA'ya spesifik olmayan bir şekilde bağlandığı için canlı hücrelerdeki nükleoid dinamiklerini takip etmek için bir vekil görevi görür. - 5 mL ortamı aşılayın (burada, 3-[N-morfolino] propansülfonik asit bazlı ortam [MOPS]; Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3)% 0.4 glikoz ve bir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile seçici bir antibiyotik (gerekirse) ile desteklenmiş ve tüpü gece boyunca (15 saat ile 19 saat arasında) 37 ° C ve dakikada 180 rotasyon (rpm) olarak ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin. Alternatif olarak, cam tüpler yerine plastik tüpler, cam veya plastik şişeler (≥ 25 mL) kullanılabilir.
NOT: Bu yazıda açıklanan deneyler boyunca,% 0.4'lük bir nihai konsantrasyonda gliserol ile takviye edilen MOPS ortamı, MOPS glikozunda% 0.4'lük bir gece kültürleri hariç, kullanılmıştır. Glikoz ile desteklenen MOPS'ta E. coli'nin üretim süresi, MOPS gliseroldekinden daha kısadır. Bu adımda MOPS gliserol %0.4 yerine %0.4 MOPS glukoz kullanılması, hücrelerin 19 saat içinde durağan faza ulaşmasını sağlar. M9 veya farklı karbon kaynaklarıyla desteklenmiş zengin tanımlı ortam (RDM) gibi diğer büyüme ortamları da kullanılabilir. Bununla birlikte, büyüme hızının ve kalıcılık sıklığının, kullanılan ortama ve / veya karbona bağlı olarak farklı olduğu belirtilmelidir23. - Ertesi sabah, 1 mL kültürü 3 dakika boyunca 2.300 x g'de santrifüj edin, süpernatanı atın ve peleti aynı hacimde fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yavaşça askıya alın. Optik yoğunluğu 600 nm'de (OD600 nm) ölçün ve 2 mL'lik son hacimde 0,01'lik ilk OD600 nm için gereken hacmi hesaplayın.
- 2 mL MOPS gliserol% 0.4 ortamını berrak bir taban 24 delikli plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin ve hesaplanan gece kültür hacmi ile aşılayın. OD600 nm'yi 24 saat boyunca izlemek için 24 delikli plakayı otomatik bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin (bkz. Mikroplaka okuyucuyu, OD600 nm'yi her 15 dakikada bir 37 °C sıcaklıkta ve yüksek yörüngesel dönüşle (140 rpm) ölçecek şekilde ayarlayın.
NOT: Deneyde kullanılan suş bir floresan muhabiri kodluyorsa, büyüme hızı antibiyotik kalıcılık sıklığını etkilediğinden, sonraki deneylerde herhangi bir artefakttan kaçınmak için büyüme hızının wt'ninkiyle karşılaştırılabilir olduğundan emin olun23. Çok düşük hücre yoğunluklarındaki algılama sınırlamaları ve OD600 nm/koloni oluşturan birimler (CFU) ilişkisi üzerindeki potansiyel suşa özgü etkiler nedeniyle, karakterize edilmemiş suşlarla çalışırken CFU·mL-1'i izleyerek büyüme kinetiğinin değerlendirilmesi önerilir.
2. Antibiyotiklerin minimal inhibitör konsantrasyonunun belirlenmesi
NOT: Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC), bakteri üremesinin gözlenmediği en düşük antibiyotik dozu olarak tanımlanır. MIC'nin belirlenmesi her antibiyotik ve suş için yapılmalıdır. Burada açıklanan deneylerde, florokinolon antibiyotik ofloksasin (OFX) kullanılmıştır. MIC'nin belirlenmesi, antibiyotik çözeltisinin doğru hazırlandığının, antibiyotiğin aktif olduğunun ve suşların antibiyotiğe eşit derecede duyarlı olduğunun doğrulanmasını sağlar. Burada,24 kullanılan farklı suşların MIC'den OFX'e MIC'sini belirlemek için yayınlanan agar seyreltme yöntemi uygulanmıştır. Belirli bir bakteri suşuna karşı belirli bir antibiyotiğin MIC'si, et suyu seyreltme yöntemi24 ile de belirlenebilir.
- MIC tayini için plakaların hazırlanması
- 5 mg OFX'i 1 mL ultra saf suda çözerek deneylerde kullanılan antibiyotik için bir ana stok çözeltisi hazırlayın. OFX'in çözünürlüğünü artırmak için 20 μL% 37 HCl ekleyin.
- 100 mL steril LB agarını eritin ve katılaşmayı önlemek için 55 °C'de tutun. Altı küçük cam şişe (25 mL) hazırlayın ve steril bir pipet kullanarak her şişeye 5 mL sıvı LB agar ortamı pipetin.
- 5 mg·mL-1 OFX ana stok çözeltisinin 10 μL'sini 90 μL ultra saf su içinde seyreltin (ana stokun 1:10 seyreltilmesi). Son konsantrasyonları 0 μg·mL−1, 0,02 μg·mL−1, 0,04 μg·mL−1 nihai konsantrasyonlarda LB agar ortamı üretmek için 5 mL LB agar ortamı içeren altı cam şişenin her birine 500 μg·mL-1 OFX çözeltisinden 0 μL, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL veya 10 μL 500 μg·mL-1 çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin, Sırasıyla 0,06 μg·mL−1, 0,08 μg·mL−1 ve 0,1 μg·mL-1 OFX. Şişeleri birkaç kez döndürerek çözeltiyi karıştırın.
NOT: İlgili antibiyotiğin MIC'si biliniyorsa, konsantrasyon aralığı gerçek MIC'nin aşağıdan üstüne ulaşmalıdır. MIC bilinmiyorsa, log2 seyreltme serisine sahip geniş bir konsantrasyon aralığı önerilir. Antibiyotik eklemeden önce LB agar ortamının soğuduğundan emin olun, çünkü yüksek sıcaklıklar onu etkisiz hale getirebilir. Bununla birlikte, antibiyotiği eklemeden önce LB agar ortamının katılaşmasına izin vermemek önemlidir, çünkü bu, antibiyotiğin LB agar ortamında homojen olmayan dağılımına yol açabilir. - Adım 2.1.3'te hazırlanan altı LB agar ortamının her birinin 5 mL'sini doz artırıcı bir şekilde steril bir pipet kullanarak 6 delikli bir kültür plakasına dökün. Agarın katılaşana kadar soğumasını bekleyin ve kullanmadan önce plakayı kurutun.
NOT: Antibiyotik solüsyonunu ve kültür plakasını tahlilin yapıldığı gün hazırlayın.
- MIC belirleme testi
- Bir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile 5 mL LB ortamını aşılayın ve cam tüpü gece boyunca 37 ° C ve 180 rpm'ye (15 saat ile 19 saat arasında) ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin.
- Ertesi sabah, OD600 nm'yi ölçün ve kültürü PBS'de 1 x 107 CFU · mL-1'lik bir son hücre yoğunluğuna kadar bir test tüpüne seyreltin. Burada test edilen suşlar için, 1 x 107 CFU · mL − 1 , 0.0125'lik bir OD600 nm'ye karşılık gelir.
NOT: CFU·mL-1 ve OD 600 nm arasındaki korelasyon bilinmiyorsa, CFU·mL-1 ve OD600 nm arasındaki korelasyon faktörünü hesaplamak için CFU ve OD600 nm ölçümleri ile belirlenen büyüme eğrisi oluşturulmalıdır. - Daha önce seyreltilmiş kültürün 2 μL'sini kurutulmuş 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirin. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de (15 saat ile 19 saat arasında) bir inkübatöre yerleştirmeden önce lekelerin kurumasını bekleyin.
- Ertesi gün, her kuyuda oluşan kolonileri sayın. MIC, bakteri üremesinin tespit edilmediği minimum antibiyotik konsantrasyonuna sahip kuyuya karşılık gelir.
3. Nokta testi
NOT: Nokta tahlili yöntemi, canlı hücrelerin (antibiyotik stresinden sonra koloni üretebilen hücreler) sayısının tahmin edilmesini sağlayan kalitatif bir yaklaşımdır. Nokta tahlili, test edilen koşullarda kullanılan suşun yaşayabilirliği hakkında fikir vermek ve zaman öldürme testi sırasında ihtiyaç duyulan seyreltmeler hakkında bilgi vermek için zaman öldürme testinden önce gerçekleştirilir (bkz. bölüm 4).
- LB agar plakalarını spot tahlillere hazırlamak için, kare bir Petri kabına (144cm2) 50 mL LB agar dökün. Her zaman noktası için bir kare Petri kabı hazırlayın. LB agarının katılaşmasına izin verin ve kullanmadan önce plakaları kurutun.
- 5 mL ortamı (MOPS glukoz% 0.4) bir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile aşılayın ve tüpü gece boyunca 37 ° C ve 180 rpm'ye ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin (15 saat ile 19 saat arasında).
- Ertesi gün, OD 600 nm'yi ölçün ve kültürü taze sıcaklık ayarlı ortama (37 ° C, MOPS gliserol% 0.4) bir cam tüp (≥25 mL) içinde ~ 0.001'lik nihai bir OD600 nm'ye kadar seyreltin. Kültürün bir inkübatörde bir gecede 37 ° C'de 180 rpm'de (15 saat ile 19 saat arasında) büyümesine izin verin.
- Ertesi gün, OD600 nm'yi ölçün ve kültürü 0,3'lük son OD600 nm'ye kadar inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında, ilk sıradaki (satır A) kuyucuklar hariç her kuyucuğa 90 μL 0.01 M MgSO4 çözeltisi yerleştirerek 96 kuyucuklu plakalar hazırlayın. 96 delikli plakalar, adım 3.7'de 10 kat seri seyreltme için kullanılacaktır.
NOT: Bu deneyde, iki suş (wt ve hupA-mCherry suşu) yedi farklı zaman noktasında üçlü olarak test edilmiştir. Bir plaka 12 sütundan oluştuğundan, bir plaka iki zaman noktası için kullanılabilir ve böylece toplam dört plaka hazırlanmıştır. - 0.3'lük bir OD600 nm'de , her bakteri kültürünün 200 μL'sini geri çekin. Bu örnekler, antibiyotik tedavisinden önceki t0 (tedavi edilmemiş) zaman noktasına karşılık gelir ve antibiyotik tedavisinden önce CFU · mL-1'in belirlenmesine izin verir.
- Numuneleri 3 dakika boyunca 2.300 x g'de santrifüjleyin. Santrifüjleme süresi boyunca, sıvı kültüre istenen OFX konsantrasyonunu ekleyin ve çalkalama sırasında 37 ° C'de inkübe etmeye devam edin.
NOT: Burada, OFX 5 μg · mL-1 konsantrasyonunda kullanılmıştır (MIC'nin 83 kat çarpımına karşılık gelir). Önceki bir çalışmada, bu konsantrasyon OFX maruziyeti25 altındaki kalıcılık fenomenini karakterize etmek için kullanılmıştır. Zaman / öldürme testleri için kullanılan antibiyotik konsantrasyonu, antibiyotik, kültür ortamı ve bakteri üreme durumuna bağlı olarak değişebilir. - Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 200 μL 0.01 M MgSO4 çözeltisi içinde yeniden askıya alın. Adım 3.5'te hazırlanan 96 delikli plakanın boş kuyucuğuna 100 μL yerleştirin. A sırasındaki kuyunun 10 μL'sini, 90 μL 0,01 M MgSO4 içeren B sırasındaki kuyuya aktararak bir seyreltme gerçekleştirin. B sırasındaki kuyunun 10 μL'sini C sırasındaki kuyuya aktararak seri seyreltmelere devam edin. 10−7'lik bir seyreltmeye ulaşana kadar tekrarlayın (her transfer 10 kat seyreltme ile).
NOT: Bu deneyde, her zaman noktası için altı kültür ( wt suşu için üç ve hupA-mCherry suşu için üç) test edilmiştir. Protokole göre, altı suşun seri seyreltmelerini aynı anda gerçekleştirmek için çok kanallı bir pipet kullanılır. Teknik hatayı en aza indirmek için pipet uçları her transfer arasında değiştirilir. - Adım 3.1'de hazırlanan LB agar plakaları üzerine her seyreltmenin 10 μL'sini tespit edin.
NOT: Çok kanallı pipet, altı kültür için aynı seyreltmeyi (ör. 10-4 seyreltme) aynı anda tespit etmek için kullanılır. Tespit sırasında, çok kanallı pipetin ilk durağı, ikinci durağa itmeden kullanılmalıdır, çünkü bu, mikrodamlacıkların plakaya dağıtılmasına neden olabilir. - Antibiyotik ilavesinden sonraki ilgili zaman noktalarında, kültürün 200 μL'sini geri çekin ve adım 3.8'de açıklandığı gibi seri seyreltmeler gerçekleştirin. Adım 3.9'da açıklandığı gibi her seyreltmenin 10 μL'sini tespit edin.
NOT: Burada açıklanan deney için yedi zaman noktası toplanmıştır (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). WT'ye kıyasla artmış antibiyotik duyarlılığı sergileyen suşlar için, artık antibiyotikleri çıkarmak için MgSO4 0.01 M'de çoklu yıkamalar yapılabilir. - Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin (15 saat ile 19 saat arasında). Ertesi gün, kolonilerin tespit edilebileceği en yüksek iki seyreltmedeki koloni sayısını sayın. İdeal olarak, bu seyreltmeler için agar plakaları üzerindeki noktalar, her numune için CFU · mL-1'in doğru bir şekilde belirlenmesini sağlayan 3 ila 30 koloni içerir.
- Her zaman noktasının hesaplanan CFU·mL-1'ini, t0'daki başlangıç popülasyonunun CFU·mL-1'ine bölerek hayatta kalma oranını hesaplayın.
4. Zaman öldürme testleri
NOT: Spot tahliller, belirli bir antibiyotik için belirli bir suşun hayatta kalma oranını tahmin etmek için kullanımı kolay bir yöntem olsa da, zaman öldürme testleri daha yüksek çözünürlüklü bir hayatta kalma oranı verir ve bakteriyel canlılığı doğru bir şekilde ölçmek için gerçekleştirilir. Öldürme eğrisinin profili, belirli bir bakteri suşunun belirli bir durumda antibiyotiğe duyarlı, toleranslı veya dirençli olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Dahası, zaman öldürme testleri, kalıcılık fenomenini (bifazik öldürme eğrisinin ikinci eğiminin başlangıcı) ve kalıcılık sıklığını tespit etmek için gereken antibiyotik maruziyet zamanının belirlenmesine izin verir.
- Zaman öldürücü kaplama testi için LB agar plakaları hazırlayın. Bir Petri kabına (±57cm2) 25 mL LB agar dökün. Zaman noktası başına en az iki Petri kabı hazırlayın (gerinim başına zaman noktası başına iki seyreltme kaplanır).
- LB agarının katılaşmasına izin verin ve her plakaya beş ila sekiz steril cam boncuk eklemeden önce plakaları kurutun. Plakaları gerinim/durum/zaman noktasına göre ters çevirin ve etiketleyin.
NOT: Cam boncuklar, adım 4.7 ve adım 4.9 sırasında bakterilerin agar plakalarına yayılmasına izin verir. Alternatif olarak, hücreler bir yayıcı kullanılarak agar plakası üzerinde dağıtılabilir. - Her numune için, 900 μL 0,01 M MgSO4 çözeltisi içeren 10 katlı seri seyreltme cam tüpleri hazırlayın. Hazırlanması gereken numune başına seyreltme cam tüplerinin sayısı, nokta tahlilindeki kolonileri tespit etmek için gereken seyreltmelere karşılık gelir.
- 5 mL ortamı (MOPS glukoz% 0.4) bir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile aşılayın ve tüpü gece boyunca 37 ° C ve 180 rpm'ye ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin (15 saat ile 19 saat arasında).
- 16 saatlik büyümeden sonra, OD 600 nm'yi ölçün ve kültürü bir cam tüp içinde taze sıcaklık ayarlı ortama (37 ° C, MOPS gliserol% 0.4) ~ 0.001 nihai OD600 nm'ye kadar seyreltin. Kültürün bir inkübatörde bir gecede 37 ° C'de 180 rpm'de (15 saat ile 19 saat arasında) büyümesine izin verin.
- Ertesi gün, OD600 nm'yi ölçün ve kültürü 0,3'lük son OD600 nm'ye kadar inkübe edin.
- 0.3'lük bir OD 600 nm'de, kültürün 100 μL'sini geri çekin, spot tahlilde elde edilen verilere göre seyreltin (0.3'lük bir OD600 nm'de ve antibiyotiksiz, 10−5 seyreltme genellikle 200-300 koloni verir) ve 4.1-4.2 adımlarında hazırlanan LB agar plakalarında100 μL plaka. Boncukların çanak kenarlarına temas etmesini önlemek için plakaları hafifçe sallayın, çünkü bu, bakteri hücrelerinin LB agar ortamına homojen olmayan bir şekilde yayılmasına neden olabilir. Antibiyotik tedavisinden önceki bu ilk örnek, t0 zaman noktasına karşılık gelir (antibiyotik tedavisinden önce CFU · mL-1).
- İstenilen OFX konsantrasyonunu ekleyin ve sallarken 37 ° C'de inkübe etmeye devam edin.
NOT: Burada, OFX 5 μg · mL-1 konsantrasyonunda kullanılmıştır (MIC'nin 83 kat çarpımına karşılık gelir). - Antibiyotik ilavesinden sonra ilgili zaman noktalarında, kültürün 100 μL'sini geri çekin, nokta tahlilinde elde edilen verilere göre seyreltin ve 4.1-4.2 adımlarında hazırlanan LB agar plakaları üzerinde 100 μL plaka plakası. Hücreleri adım 4.7'de açıklandığı gibi plakalayın.
NOT: Burada açıklanan deney için yedi zaman noktası toplanmıştır (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Wt'ye kıyasla artmış antibiyotik duyarlılığı sergileyen suşlar için, artık antibiyotikleri çıkarmak için MgSO4 0.01 M'de çoklu yıkamalar yapılabilir. - Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin (15 saat ile 19 saat arasında). Ertesi gün, kolonilerin tespit edilebileceği en yüksek iki seyreltmedeki koloni sayısını sayın. İdeal olarak, plakalar, her numunede CFU · mL-1'in doğru bir şekilde belirlenmesini sağlamak için 30-300 koloni içermelidir.
- CFU·mL-1'i her zaman noktasında CFU·mL-1 ile t0'da normalleştirerek hayatta kalma oranını hesaplayın. Günlük10 normalleştirilmiş CFU·mL-1'i zamanın bir fonksiyonu olarak çizin.
5. Mikroakışkan hızlandırılmış mikroskopi görüntüleme
NOT: Aşağıdaki bölümde, mikroakışkan plakanın hazırlanmasının yanı sıra hızlandırılmış görüntü toplama ve görüntü analizi prosedürü açıklanmaktadır. Bu deneyin amacı, antibiyotik tedavisi üzerine kalıcılık fenotipini tek hücre düzeyinde gözlemlemek ve analiz etmektir. Bu deney sırasında toplanan veriler, ele alınan soruya ve / veya deney sırasında kullanılan floresan muhabirlerine bağlı olarak çok çeşitli sonuçlar üretmek için kullanılabilir. Burada açıklanan deneyde, hücre uzunluğunun ve HU-mCherry floresan22'nin, persister ve persister olmayan hücrelerdeki nükleoid organizasyonunu yansıtan kantitatif analizi yapılmıştır.
- Mikroakışkan hızlandırılmış mikroskopi için bakteriyel hücre kültürü
- Bir cam tüp (≥25 mL) içinde izole bir koloni ile 5 mL ortamı (MOPS gliserol% 0.4, gerekirse seçici bir antibiyotik ile desteklenmiş) aşılayın ve tüpü gece boyunca 37 ° C ve 180 rpm'ye (15 saat ile 19 saat arasında) ayarlanmış bir sallama inkübatörüne yerleştirin.
- Ertesi gün, OD 600 nm'yi ölçün ve kültürü taze sıcaklık ayarlı ortamda (37 ° C, MOPS gliserol% 0.4) bir cam tüp içinde ~ 0.001'lik nihai bir OD600 nm'ye kadar seyreltin. Ertesi gün erken bir üstel faz kültürü elde etmek için kültürün gece boyunca (15 saat ile 19 saat arasında) 37 ° C ve 180 rpm'de sallanan bir inkübatörde büyümesine izin verin.
- Mikroakışkan plağın hazırlanması ve hızlandırılmış mikroskopi görüntüleme
NOT: Mikroakışkan deneyler, ticari olarak temin edilebilen mikroakışkan cihazlarda (burada açıklandığı gibi) veya şirket içinde üretilen mikroakışkan sistemlerde gerçekleştirilebilir.- Koruma çözeltisini (varsa) mikroakışkan plakanın her bir kuyucuğundan çıkarın ve taze bir kültür ortamı ile değiştirin.
NOT: Mikroakışkan plaka bir atık çıkış kuyusu içeriyorsa, çıkış kuyusunun koruma çözeltisi çıkarılmalı, ancak ortam ile değiştirilmemelidir. - Mühürle düğmesine tıklayarak veya mikroakışkan yazılım aracılığıyla mikroakışkan plakayı manifold sistemi ile kapatın (önce Alet'i seçin, ardından Sızdırmazlık Plakası'nı seçin).
NOT: Plakayı kapatmak için, plakayı manifolda karşı manuel olarak sıkarak plakaya ve manifolda eşit bir basınç uygulanmalıdır. Doğru şekilde gerçekleştirilirse, ONIX2 arayüzünde "mühürlü" notu görünmelidir. Manifoldun kırılma riskini önlemek için cam kızağa herhangi bir basınç uygulamamak önemlidir. - Mühürlendikten sonra, ilk astarlama sırasını gerçekleştirin (mikroakışkan yazılım arayüzünde Run Liquid Priming Sequence'a (Sıvı Astarlama Sırasını Çalıştır ) tıklayın).
NOT: Sıvı Besleme Dizisini Çalıştır , 1-5 kuyuları için 6,9 kPa'da 5 dakikalık perfüzyona, ardından kuyu 8 için 6,9 kPa'da 5 dakikalık perfüzyona ve 6,9 kPa'da 5 dakika boyunca kuyu 6 için son perfüzyon turuna karşılık gelir. Çalışma Sıvısı Astarlama Sekansı , farklı kuyucukları birbirine bağlayan kanallarda hala mevcut olabilecek koruma çözeltisinin uzaklaştırılmasını sağlar. - Plakayı, mikroskop görüntülemenin başlamasından önce en az 2 saat boyunca istenen sıcaklıkta (burada, 37 ° C) mikroskobun termostatik olarak kontrol edilen bir kabininde inkübe edin.
- Denemeye başlamadan önce ikinci bir Sıvı Hazırlama Sırası Çalıştır başlatın.
- Mikroakışkan yazılım arayüzünde Mühürle kapat'a tıklayarak mikroakışkan plakayı kapatın. Ortamı kuyu 1 ve kuyu 2'de 200 μL taze ortamla, kuyu 3'te antibiyotik içeren 200 μL taze ortamla (burada, 5 μg · mL−1'de OFX), kuyu 4'te ve kuyu 5'te 200 μL taze ortamla, kuyu 6'da 200 μL taze ortamla ve kuyu 8'de 200 μL kültür örneğinle (adım 5.1.2'den itibaren) bir OD600 nm'ye seyreltilmiş olarak değiştirin taze ortamda 0.01'dir.
- Mikroakışkan plakayı adım 5.2.2'de açıklandığı gibi kapatın ve plakayı mikroskop dolabının içindeki mikroskop hedefine yerleştirin.
NOT: Mikroakışkan plakayı yerleştirmeden önce mikroskop hedefine bir damla daldırma yağı koyduğunuzdan emin olun. - Mikroakışkan yazılımda, hücrenin mikroakışkan plakaya yüklenmesine izin vermek için Hücre Yükleme'ye tıklayın.
NOT: Hücre Yükleme adımı, kuyu 8 için 13,8 kPa'da 15 s perfüzyon, ardından kuyu 6 ve kuyu 8 için 27,6 kPa'da 15 s perfüzyon ve 6,9 kPa'da 30 s için kuyu 6 için son perfüzyon turundan oluşur. Mikroakışkan plakadaki hücrelerin yoğunluğu deney için kritik öneme sahiptir. Bu mikroakışkan protokolün ilk kısmı, antibiyotik tedavisinden önce taze bir ortamda 6 saat boyunca büyüyen bakterilerden oluşur. 6 saatlik büyümeden sonra, hücre yoğunluğu nadir persister hücreleri tespit etmek için yeterli olmalıdır (bu çalışmada kullanılan koşullarda, persister hücreler 10-4 frekansında üretilir). Hücre yoğunluğu çok yüksekse, tek tek hücreleri ayırt etmek zordur, bu da hassas tek hücreli analizi önler. Büyüme hızı doğrudan ortama bağlı olduğundan, deneyi başlatmadan önce mikroskopi alanlarındaki hücrelerin yoğunluğu değerlendirilmelidir. - İletilen ışık modunu kullanarak optimum bir odak ayarlayın ve uygun bir hücre numarasının gözlemlendiği birkaç ilgi alanı (ROI) seçin (alan başına 300 hücreye kadar).
NOT: Nadir kalıcı hücrelerin görüntülendiğinden emin olmak için en az 40 YG seçin. - Mikroakışkan yazılımda, Protokol Oluştur'a tıklayın. Taze ortamın 6 saat boyunca 6.9 kPa'da enjeksiyonunu programlayın (kuyu 1-2), ardından antibiyotiği içeren ortamın 6 saat boyunca 6.9 kPa'da enjeksiyonu (kuyu 3) ve son olarak, taze ortamın 20 saat boyunca 6.9 kPa'da enjeksiyonu (kuyu 4-5).
NOT: 0.01'lik bir OD600 nm'ye seyreltilmiş bir bakteri kültürü, bakterilerin mikroakışkan odada 6 saat boyunca büyümesine izin vererek hücrelerin üstel büyüme fazında olmasını sağlar. Yükleme adımı sırasında mikroakışkan cihaza sokulan hücre sayısına bağlı olarak (bkz. adım 5.2.8), büyüme fazının süresi, ROI başına 300 hücreye kadar elde edilecek şekilde uyarlanabilir. Kalıcılık nadir görülen bir fenomen olduğundan, ROI başına hücre sayısının arttırılması, kalıcı hücreleri gözlemleme olasılığını artırır. Bununla birlikte, hücre sayısı, ROI başına 300 hücreyi geçmemelidir, çünkü bu, tek hücreli analizi sıkıcı hale getirir. - İletilen ışığı ve floresan muhabir için uyarma ışık kaynağını kullanarak her 15 dakikada bir kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin. Burada, mCherry sinyali için 560 nm uyarma ışık kaynağı kullanıldı (filtre 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] ile% 10 güçte 580 nm LED ve mCherry için 100 ms pozlama). Hücre görüntülemesi için Zeiss uyumlu Zen3.2 yazılımı kullanıldı.
- Koruma çözeltisini (varsa) mikroakışkan plakanın her bir kuyucuğundan çıkarın ve taze bir kültür ortamı ile değiştirin.
- Görüntü analizi
NOT: Mikroskopi görüntülerinin açılması ve görselleştirilmesi açık kaynaklı ImageJ/Fiji yazılımı (https://fiji.sc/)26 ile gerçekleştirilir. Kantitatif görüntü analizi, açık kaynaklı ImageJ/Fiji yazılımı ve ücretsiz MicrobeJ eklentisi (https://microbej.com)27 kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokolde MicrobeJ 5.13I(14) versiyonu kullanılmıştır.- Bilgisayarda ImageJ/Fiji yazılımını açın ve hiper yığın hızlandırılmış mikroskopi görüntülerini Fiji yükleme çubuğuna sürükleyin. Hiperstack'in farklı kanallarını birleştirmek için Image > Color > Make Composite'i kullanın. Hızlandırılmış denemenin kanalları istenen renge karşılık gelmiyorsa (ör. faz kontrastı gri yerine kırmızı renkle gösteriliyorsa), kanallara uygun rengi uygulamak için Görüntü > Renk > Kanalları Düzenle'yi kullanın.
- MicrobeJ eklentisini açın ve manuel düzenleme arayüzünü kullanarak bakteri hücrelerini tespit edin. Otomatik olarak algılanan hücreleri silin ve ilgilenilen kalıcı hücreleri kare kare el ile ana hatlarıyla belirtin.
NOT: Tek tek hücreleri otomatik olarak algılamak için farklı ayarlar kullanılabilir. Analiz edilen persister hücreler, otomatik algılama kullanılarak nadiren doğru bir şekilde tespit edilen uzun filamentler oluşturduğu için burada manuel algılama kullanılmıştır. - Algılamadan sonra, bir ResultJ tablosu oluşturmak için MicrobeJ manuel düzenleme arayüzündeki Sonuç simgesini kullanın. ResultJ dosyasını kaydedin ve tek hücreli analizin ilgilendiği farklı parametreler hakkında içgörüler elde etmek için ResultJ tablosunu kullanın. Bu protokol durumunda, HU-mCherry yoğunluğunun, hücre uzunluğunun ve bireysel hücrelerin hücre alanının ortalama floresansı ihraç edildi.
Representative Results
Yukarıda tarif edildiği gibi, persister hücrelerin tek hücreli fenotipik analizi için kullanılan suşlar, MOPS gliserol% 0.4 oranında besiyerinde karakterize edilmiştir. OD600nm'nin zaman içinde izlenmesi, wt ve hupA-mCherry suşları arasında bir fark göstermedi (Şekil 1). Bu, HU-mCherry füzyon proteininin ekspresyonunun bu koşullarda büyümeyi etkilemediğini göstermektedir. Başlangıçta 0.01'lik bir OD600 nm'de aşılanan her iki suşun bakteri hücreleri, aşılamadan sonra üstel faza ±8 saat ulaştı.
OFX'in MIC'si standartlaştırılmış yöntemlerle belirlendi (burada, seri agar seyreltmesi)24. MIC, görünür bir büyümenin tespit edilmediği minimum konsantrasyon olarak tanımlanır. Her iki suş için OFX'in MIC'si 0.06 μg · mL−1 olarak belirlenmiştir, bu da hupA-mCherry füzyonunun izojenik wt suşu ile karşılaştırıldığında OFX'e duyarlılık üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir (Şekil 2).
Ayrıca, ölümcül bir OFX tedavisinin (83 kat MIC) bu çalışmada kullanılan her iki suşun yaşayabilirliği üzerindeki etkisini belirledik. Canlı hücre sayısı OFX maruziyeti ile zamanla azaldığından, bakteri kültürlerinin seyreltmelerinin plaka başına 30 ila 300 koloniye ulaşmak için uygun şekilde ayarlanması gerekir. Zaman içinde uygun seyreltmeleri belirlemek için, çok kanallı bir pipet kullanılarak kare Petri kaplarına 0 ila 10−7 seri 10 kat seyreltme 10 μL arasında bir nokta testi yapıldı. Uygun seyreltmeler, izole klonların görülebildiği yerlerdi (örneğin, t0 = 10−5, t1h = 10−4/10−3, t4h = 10−2/10−1) (Şekil 3).
Nokta tahlili, OFX aracılı öldürmenin kinetiği hakkında fikir edinmek için kolay bir yöntem olsa da, öldürme dinamiklerini doğru bir şekilde belirlemekte başarısız olur. OFX ile tedavi edilen üstel olarak büyüyen hücrelerin yaşayabilirliği zaman öldürme testi ile izlendiğinde, tipik bir bifazik eğri gözlenmiştir (Şekil 4). Eğrinin ilk eğimi, kalıcı olmayan popülasyonun hızlı bir şekilde öldürülmesini yansıtır (kırmızı kesikli çizgi). Burada test edilen koşullarda, hücrelerin% 99.9'una kadarı, OFX varlığında 3 saat sonra koloni oluşturamamıştır. Öldürmenin bu ilk aşamasını, ilaca toleranslı kalıcı hücrelerin varlığını ortaya koyan daha yavaş bir öldürme oranı (mavi kesikli çizgi) gösteren ikinci bir aşama izler. Test edilen koşullarda, persister faz, OFX ilavesinden yaklaşık 3 saat sonra başladı ve kalıcı fenotipleri araştırmak için hücreleri 3 saatten daha uzun süre OFX'e maruz bırakmanın gerekliliğini vurguladı. Önemli olarak, zaman öldürme eğrisi, hupA-mCherry füzyon proteininin zaman öldürücü kinetik üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir. Bu nedenle, translasyonel floresan füzyonunu kodlayan suş, floresan mikroskobu kullanarak persistan hücreleri izlemek için kullanılabilir.
Ayrıca, kalıcılık fenomenini tek hücre düzeyinde araştırmaya devam ettik. Bunu yapmak için, hupA-mCherry suşu, belirli bir ROI üzerinde hızlandırılmış mikroskopi gerçekleştirirken orta koşulların (burada, büyüme, tedavi ve iyileşme) değişmesine izin veren mikroakışkan bir plakaya sokuldu. Mikroakışkan deneyin ilk adımında, mikroakışkan cihaza sokulan hücreler büyüme ortamı (MOPS gliserol% 0.4) ile perfüze edildi ve ~ 2 saatlik bir üretim süresine bölündü (Şekil 5 ve Şekil 6). Büyümenin bu ilk aşaması, hücrelerin OFX tedavisinden önce canlı ve aktif olarak bölündüğünü gösterir.
Büyümenin bu ilk aşamasından sonra, hücreler 6 saat boyunca 5 μg · mL-1 OFX ile desteklenen büyüme ortamı ile perfüze edildi. Antibiyotik hücrelere ulaşır ulaşmaz hücre bölünmesi bloke edildi (Şekil 5 ve Şekil 6). 6 saatlik OFX tedavisinden sonra, hücreler taze ortam ile perfüze edildi. Hücrelerin büyük çoğunluğu büyümeye devam edemezken (Şekil 5 ve Şekil 6), küçük bir bakteri alt popülasyonu filamentli hücreleri uzatabilir ve üretebilirdi25. OFX tedavisinden sonra bölünebilen ve canlı yavru hücreler üretebilen bu hücreler, persister hücreler olarak tanımlanabilir.
Bu kurulum, tedavi öncesinde, sırasında ve sonrasında persister hücrelerin görselleştirilmesine izin verdiğinden, sadece iyileşme aşamasında persister fenotip hakkında değil, aynı zamanda persister hücrelerin tedaviden önceki fizyolojik durumu hakkında da bilgi sağlar (Şekil 6). Test edilen koşullarda, persister hücreler OFX tedavisinden önce persister olmayan hücrelere benzer şekilde bölünmüştür, bu da gözlenen persister hücrelerin uykuda olan bir alt popülasyondan kaynaklanmadığını göstermektedir (Şekil 6)25.
İyileşme aşamasında persister hücrelerin hücre uzunluğu analizi, her filamentin belirli bir uzama oranına sahip olduğunu ortaya koymuştur. İlk bölünmeden önce her bir persister tarafından ulaşılan hücre uzunluğu, bir kalıcıdan diğerine farklılık gösteriyordu. Benzer şekilde, ilk bölünme olayının zamanlaması oldukça heterojendi (Şekil 6). Bölünen persister filament, çoğunlukla tedavi edilmemiş hücrelere benzer şekilde büyümeye ve bölünmeye başlayan çoklu yavru hücreler üretti (Şekil 7). Filamentin ardışık bölünmesi daha sonra hücre uzunluğunda ilerleyici bir azalmaya neden oldu ve sonuçta OFX tedavisinden öncekine benzer hücre uzunluğuna sahip yavru hücrelere yol açtı (Şekil 6 ve Şekil 7B). Hücrelerin büyük çoğunluğu OFX çıkarılmasından sonra filamentasyonu indükleyemedi. Bu büyük hücre popülasyonu ölü hücrelere karşılık gelir (Şekil 5 ve Şekil 6).
Nükleoid ile ilişkili protein HU'nun floresan füzyonu, nükleoid22'nin dinamiklerinin görselleştirilmesine izin verir. Hücre içindeki HU-mCherry'nin toplam floresan yoğunluğunun analizi,DNA içeriği 22,25 için bir vekil olarak kullanılabilir. Büyüme fazı sırasında (OFX tedavisinden önce), toplam mCherry floresan yoğunluğu, hücre döngüsü sırasında kromozom replikasyonu ve ayrışma dinamiklerini yansıtacak şekilde değişmiştir (Şekil 8). OFX ilavesinden sonra, mCherry floresansı, çift sarmallı DNA kırılmalarının28 oluşumu ile indüklendiği gösterilen nükleoid sıkışmasının göstergesi olan orta hücrede artmıştır (Şekil 5). Çift sarmallı DNA kırılmaları, tip II topoizomeraz DNA-giraz ve topoizomeraz IV 29,30'u bozan OFX'in etki mekanizmasının bir sonucudur. E. coli'de DNA-jiraz, OFX 29,30'un birincil hedefidir. OFX, hedefini çift iplikli geçiş mekanizmasının kritik bir adımına bağlayarak, parçalanmış DNA iplikçiklerinin küme düşmesini engeller ve sonuçta çift sarmallı DNA kırılmalarının30'un salınmasına yol açar. Yukarıda tarif edildiği gibi, OFX tedavisine persistan hücreler iyileşme sırasında filamentlenmeye başladı25 (Şekil 6). Hücre uzunluğundaki artış, toplam mCherry floresan yoğunluğundaki bir artışla korelasyon gösterdi, bu da replikasyonun yeniden başlatılmasını ve filament25'teki nükleoid bolluğundaki artışı yansıtıyordu (Şekil 7a ve Şekil 8). Ölü hücreler için, toplam mCherry floresan yoğunluğu, tedavi sırasında ve iyileşme aşamasında sabit kalmıştır, bu da bu hücrelerin OFX çıkarıldıktan sonra kromozomlarını kopyalayamadıklarını göstermektedir (Şekil 8). E. coli HU-mCherry hücrelerinin ofloksasin tedavisi öncesinde, sırasında ve sonrasında mikroakışkan videosu (Video 1) de gösterilmiştir.
Şekil 1: Wt ve hupA-mCherry E. coli suşlarının büyüme izlemesi. Optik yoğunluk izleme (OD600 nm) wt (siyah) ve hupA-mCherry (kırmızı). Gölgeler ve kesikli çizgiler, biyolojik üçlülerin standart sapmalarını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: wt ve hupA-mCherry E. coli suşları için OFX MIC'sinin belirlenmesi. Wt () ve hupA-mCherry (●) LB ortamında yetiştirildi ve OFX içeren LB agar'ın seri seyreltmelerinde 2 μL tespit edildi (♦ her panelde μg · mL− 1 cinsinden belirtilen konsantrasyon). Büyüme inhibisyonu minimum 0.06 μg · mL−1'de görülebilir. Şekil, biyolojik üçlülerin temsili bir deneyidir. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OFX'e maruz kaldıktan sonra wt ve hupA-mCherry E. coli suşlarının spot analizi. (A) wt ve (B) hupA-mCherry suşları, protokolde (bölüm 3) tarif edildiği gibi% 0.4 MOPS gliserol içinde yetiştirildi ve üstel olarak büyüyen hücreler (OD600 nm = 0.3) 5 μg · mL − 1 OFX ile muamele edildi. T0, OFX'in eklenmesinden önceki zaman noktasına karşılık gelir. T1, T2, T3, T4, T5 ve T6, OFX ilavesinden sonra 1-6 saate karşılık gelir. Şekil, biyolojik üçlülerin temsili bir deneyidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: OFX'e maruz kaldıktan sonra wt ve hupA-mCherry E. coli suşlarının zaman öldürme testi. Wt () ve hupA-mCherry (●) suşları, protokolde (bölüm 4) tarif edildiği gibi% 0.4 MOPS gliserol içinde yetiştirildi ve üstel olarak büyüyen hücreler (♦ OD600 nm = 0.3) 5 μg · mL − 1 OFX ile muamele edildi. Kesikli çizgiler, hassas ve kalıcı alt popülasyonlara karşılık gelen ilk "hızlı" (kırmızı) öldürme fazını ve ikinci "yavaş" (mavi) öldürme fazını gösterir (sırasıyla T0 ve T2 arasındaki doğrusal regresyon ile elde edilir) ve ayrıca T3 ve T6 arasında). Hata çubukları, biyolojik üçlülerin standart sapmalarını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Mikroakışkan aletler kullanılarak OFX persister ve ölü hücrelerin temsili görüntüleri. HupA-mCherry suşu ile gerçekleştirilen mikroakışkan deneyin ilgili zaman noktalarını gösteren temsili mikroskopi görüntüleri (gri renkte faz kontrastı, kırmızı renkte HU-mCherry sinyali). Etiketli hupA-mCherry'yi ifade eden hücreler mikroakışkan bir plakada (burada, 4 saat) büyütüldü, bunu bir OFX mücadelesi (5 μg · mL−1) izledi. OFX varlığında 6 saat sonra, hücreler taze ortam ile perfüze edildi ve kalıcı hücrelerin iyileşmesine izin verildi. OFX tedavisi sırasında ve OFX'in çıkarılmasından sonra persister hücre ve onun soy hücreleri sırasıyla yeşil ve mavi renkle vurgulanır. İlgili zaman noktaları her panelde belirtilir. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kalıcı ve ölü hücrelerin uzunluğunun mikroskopi hızlandırılmış analizi. Ölü hücrelerin (kırmızı, n = 109) ve kalıcı hücrelerin (gri, n = 13) hücre uzunluğu analizi. OFX işleminin başlangıcı (5 μg · mL−1) kırmızı kesikli çizgi (5 saat) ile gösterilir ve OFX çıkarılması mavi kesikli çizgi ile gösterilir. İç kısım, OFX ilavesinden önceki büyüme aşamasına karşılık gelir. Deneyler üçlü olarak gerçekleştirildi. Gölgeler ve kesikli çizgiler ölü hücre popülasyonu için standart sapmaları gösterir (n = 109). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: OFX'e temsili bir kalıcının mikroskopi hızlandırılmış analizi. (A) OFX'in çıkarılmasından sonraki 8.5 saat boyunca filament bölünmeleri tarafından üretilen temsili bir OFX persisterinin ve kızı hücrelerinin kimografı (mikroakışkan deneyin başlangıcından 18.5 saat sonra, 4 saatlik büyüme, 6 saatlik 5 μg · mL−1 OFX tedavisi ve OFX çıkarılmasından sonra 8.5 saatlik iyileşmeden oluşan). Bir kare 15 dakikaya karşılık gelir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) A'daki kalıcı kimograftan üretilen maske. İzlenen kalıcı hücre mavi bir anahat ile gösterilir ve yavru hücreler farklı renklerle vurgulanır. (C) B'den üretilen kalıcı hücre soyunun şematik gösterimi. Renk kodlaması B ile aynıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Temsili persister ve ölü hücrelerin hücre uzunluğu ve mCherry floresan analizi. Mikroakışkan hızlandırılmış deney sırasında temsili bir persisterin (katı siyah ve kırmızı çizgiler) ve temsili bir ölü hücrenin (kesikli siyah ve kırmızı çizgi) hücre uzunluğunun (sol eksen) ve toplam HU-mCherry floresan yoğunluğunun (rastgele birimlerle gösterilen sağ eksen) analizi. OFX işleminin başlangıcı (5 μg·mL−1) kırmızı kesikli çizgiyle, OFX giderimi ise mavi kesikli çizgiyle gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: E. coli HU-mCherry hücrelerinin ofloksasin tedavisinden önce, sırasında ve sonrasında mikroakışkan videosu. HU-mCherry hücrelerini gösteren mikroakışkan hızlandırılmış görüntüleme. Hücreler MOPS gliserolde% 0.4 oranında 4 saat boyunca büyütüldü. 6 saatlik OFX tedavisinden sonra (5 μg · mL−1), antibiyotiksiz ortam, kalıcı hücrelerin iyileşmesine izin vermek için mikroakışkan plakaya perfüze edildi. Ölçek çubuğu = 5 μm. Zaman (dakika cinsinden) belirtilir. Büyüme ve iyileşme aşamaları "MOPS- Gly. %0.4" ve "OFX 5 μg/mL" ile OFX tedavisi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
| 10x MOPS | |||
| Stok çözümü | 1 L 10x MOPS için stok çözeltisi hacmi | 10x MOPS bazında nihai konsantrasyon | |
| MOPS asit | 1 M (KOH kullanılarak pH 7,4'e ayarlanır) | 400 mL | 0,4 milyon |
| Trikin | 1 M (KOH kullanılarak pH 7,4'e ayarlanır) | 40 mL | 0,04 milyon |
| FeSO4.7H2O | 0,01 milyon | 10 mL | 0.0001 milyon |
| NH4Cl | 1,9 milyon | 50 mL | 0,095 milyon |
| K2S04 | 0.276 milyon | 10 mL | 0,00276 milyon |
| CaCl2.2H 2O | 0.0005 milyon | 10 mL | 0,000005 milyon |
| MgCl 2.6H2O | 0,528 milyon | 10 mL | 0,00528 milyon |
| Arjantin | doğrudan ekle 29,2 g | 0,5 milyon | |
| Damıtılmış su | 460 mL | ||
| Mikro besinler 1000x (bakınız Tablo 2) | 10 mL | ||
Tablo 1: 10x MOPS'nin bileşimi.
| Mikro besinler 1000x | ||
| Mikro besinlerde konsantrasyon 1000x stok çözeltisi | 10x MOPS bazında nihai konsantrasyon | |
| (NH4)6Mo7O24.4H2O | 0,000003 M | 0.00000003 M |
| H3 BO3 | 0.0004 milyon | 0,000004 M |
| CoCl2.6H 2O | 0,00003 milyon | 0,0000003 M |
| CuSO4.5H 2O | 0,00001 milyon | 0,0000001 M |
| MnCl2.4H 2O | 0,00008 milyon | 0,0000008 M |
| ZnSO.7H2O | 0,00001 milyon | 0,0000001milyon |
Tablo 2: 1.000x mikro besin maddesinin bileşimi.
| MOPS glikoz% 0.4 veya MOPS gliserol 0.4% | |||
| Stok çözümü | 1 L için hacim MOPS glikoz % 0.4 veya MOPS gliserol % 0.4 | MOPS glikoz% 0.4 veya MOPS gliserl% 0.4'teki nihai konsantrasyon | |
| 10x MOPS | Tablo 1'e bakınız | 100 mL | |
| K2HPO4 | 0,132 milyon | 10 mL | 0,00132 milyon |
| Glikoz (MOPS glikoz için% 0.4) | %20 (100 mL damıtılmış suda 20 g) | 20 mL | 0.40% |
| Gliserol (MOPS gliserol için% 0.4) | %≤99 | 4 mL | 0.40% |
| Damıtılmış su | MOPS glikoz için 870 mL, %0,4 veya MOPS gliserol için 886 mL, %0,4 | ||
Tablo 3: MOPS glukoz% 0.4 ve MOPS gliserol bileşimi% 0.4.
Discussion
Bu yazıda sunulan protokol, popülasyonda ve tek hücreli seviyelerde antibiyotik tedavisine yanıt olarak gözlenen kalıcılık fenotipinin analizine olanak sağlamaktadır. Deneyler, kimyasal olarak tanımlanmış bir ortamda (MOPS gliserol% 0.4) yetiştirilen E. coli MG1655 suşu ile gerçekleştirildi. Üstel faz kültürleri üzerinde zaman öldürme testleri ve mikroskopi deneyleri yapıldı. Kalıcı hücreleri ortaya çıkarmak için 5 μg · mL−1 konsantrasyonunda bir florokinolon olan OFX'i kullandık. Burada açıklanan yaklaşımlar, β-laktamlar, aminoglikozitler veya antimikrobiyal bileşikler gibi diğer bakterisidal antibiyotiklere uygulanabilir31. Buna göre, diğer bakteri suşları, ortamlar veya büyüme koşulları kullanılabilir. Farklı floresan füzyonlarının burada tarif edilene benzer bir kurulumda izlenmesi, antibiyotik tedavisinden önce, sırasında ve sonrasında DNA replikasyonu32, DNA onarımı25,33 ve hücre bölünmesi 34 gibi hücresel süreçleri takip etmek için yararlı olabilir. Benzer şekilde, floresan muhabirler, hücre içi pH35, ATP 36 veya ROS37 seviyeleri gibi hücre fizyolojisinin farklı yönlerini araştırmak için kullanılabilir. Floresan füzyonlara alternatif olarak, kimyasal boyalar da uygulanabilir. Örneğin, hupA-mCherry füzyonu, DNA38'i boyayan floresan bir boya olan 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile değiştirilebilir. Bununla birlikte, bu tür floresan boyalarla birleştirilmiş hızlandırılmış mikroskopi yapmaktan kaçınılmalıdır, çünkü bu boyama teknikleri, hızlandırılmış deneyler sırasında hücre döngüsünün dinamiklerini bozabilir. Alternatif olarak, bu tür deneyler, ilgili zaman noktalarında anlık görüntülemenin zaman rotası analizleri ile değiştirilebilir.
Bu tür floresan muhabirler yardımcı olsa da, faz-kontrast görüntülerinin analizi yoluyla çıkarılabilecek bilgi miktarı ihmal edilmemelidir. Burada, büyüme, OFX tedavisi ve iyileşme aşamaları boyunca hücre uzunluğu evrimini izledik. Hücre genişliği, faz-kontrast yoğunluğu ve bakteri hücrelerinin eğrilikleri gibi faz-kontrast görüntülerine dayanan diğer parametreler de MicrobeJ27 gibi yeterli yazılım kullanılarak kolaylıkla çıkarılabilir.
Özetle, burada açıklanan prosedür, değişen ortamlara veya stresörlere hücresel tepkileri izlemek için diğer koşullara ve bakteri türlerine uygulanabilir18,19. Diğer floresan muhabirleri (transkripsiyonel ve translasyonel muhabirler, kimyasal boya) akış sitometrisi / FACS gibi bir popülasyon analizi ile birlikte kullanarak, ilginç sorular çok ölçekli bir çerçevede ele alınabilir.
Disclosures
Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Van Melderen laboratuvarındaki çalışmalar, ARC eylemleri 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F) tarafından desteklenmektedir. T.O. bir ULB bursu ile desteklenmektedir. T.S. bir FRIA bursu (FNRS) tarafından desteklenmektedir. J.C., doktora sonrası bir burs olan "chargé de recherches" (FNRS) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer | Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| CaCl2.2H2O | Merck | 1.02382.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CoCl2.6H2O | Merck | 1.02539.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| CuSO4.5H2O | Merck | 1.02790.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| D-(+)-glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium |
| E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) | BE10 | wt reference strain, lab strain | |
| E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT | BE16 | HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain | |
| FeSO4.7H2O | VWR Chemicals | 24244.232 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software; Schindelin et al. if used in publication |
| Glycerol | Merck | 56815 | Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate | Merck | M8812-100EA | 24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader |
| H3BO3 | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Digital Image Acqusition |
| K2HPO4 | Merck | 1.05099.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| KOH | Merck | 1.05029.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| K2SO4 | Merck | 1.05153.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Luria-Broth agar medium | Invitrogen | 22700041 | Growth medium for plating assay |
| Luria-Broth medium | Invitrogen | 12780029 | Growth medium for MIC determination |
| MgCl2.6H2O | Merck | 1.05832.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| MgSO4 | Merck | 7487-88-9 | Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck | B04A-03-5PK | Plate for microfluidic system |
| MnCl2.4H2O | Merck | 1.05927.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| MOPS, Free Acid ULTROL® Grade | Merck | 475898-500GM | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| NaCl | SIgma-Aldrich | S5886-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| (NH4)6Mo7O24.4H2O | Merck | 1.01180.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Ofloxacin | Merck | 82419-36-1 | Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x | Merck | P3813 | Dilution buffer |
| GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | 840-208200 | UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | Microplate reader software | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
| N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine | Merck | 1.08602.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Zeiss® immersion Oil 518F | Zeiss | Immersion oil to increase resolution of microscope | |
| Zen3.2 Pro | Zeiss | Microscopic image acquisition and processing software | |
| ZnSO4.7H2O | Merck | 1.08883.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
References
- Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).
- Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
- Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution. mBio. 13 (3), 01074 (2022).
- Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).
- Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).
- Cui, P., et al. Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation. Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).
- Li, T., et al. Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).
- Verstraeten, N., et al. Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance. Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).
- Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).
- Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives. EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).
- Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. General mechanisms leading to persister formation and awakening. Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).
- Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival. Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).
- Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations. Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
- Morawska, L. P., Kuipers, O. P. Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state. microLife. 3, (2022).
- Windels, E. M., et al. Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening. Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).
- Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).
- Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).
- Shi, H., et al. Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).
- Goode, O., et al. Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment. mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).
- Manuse, S., et al. Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells. PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).
- Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
- Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
- Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures. Science Advances. 5 (6), (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
- Odsbu, I., Skarstad, K. DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA. Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).
- Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T.
- Drlica, K., et al. Quinolones: Action and resistance updated. Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: From targets to networks. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).
- Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli. Science. 328 (5977), 498-501 (2010).
- Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair. Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).
- Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET. Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
- Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
- Kapuscinski, J. DAPI: A DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
