Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

الحقن داخل القلب لخلايا سرطان البروستاتا البشرية لإنشاء نموذج فأر Xenograft نقيلي عظمي

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/64589
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,3, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 3Institute of Chinese Traditional Surgery, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للحقن داخل القلب لخلايا سرطان البروستاتا البشرية لإنشاء نموذج فأر مع آفات ورم خبيث في العظام.

Abstract

باعتباره أكثر الأورام الخبيثة شيوعا بين الذكور ، يحتل سرطان البروستاتا (PC) المرتبة الثانية في معدل الوفيات ، ويرجع ذلك أساسا إلى معدل ورم خبيث في العظام بنسبة 65٪ -75٪. لذلك ، من الضروري فهم العملية والآليات ذات الصلة لورم خبيث في العظام لسرطان البروستاتا لتطوير علاجات جديدة. لهذا ، فإن النموذج الحيواني لورم خبيث في العظام هو أداة أساسية. هنا ، نبلغ عن إجراءات مفصلة لإنشاء نموذج فأر ورم خبيث عظمي عن طريق الحقن داخل القلب لخلايا سرطان البروستاتا. يمكن لنظام تصوير التلألؤ الحيوي تحديد ما إذا كانت خلايا سرطان البروستاتا قد تم حقنها بدقة في القلب ومراقبة ورم خبيث للخلايا السرطانية نظرا لأنه يتمتع بمزايا كبيرة في مراقبة تطور الآفة النقيلية. يكرر هذا النموذج التطور الطبيعي للخلايا السرطانية المنتشرة لتشكيل النقائل الدقيقة في العظام ويحاكي العملية المرضية لورم خبيث في العظام بسرطان البروستاتا. يوفر أداة فعالة لمزيد من الاستكشاف للآليات الجزيئية والآثار العلاجية في الجسم الحي لهذا المرض.

Introduction

سرطان البروستاتا هو السرطان الأكثر شيوعا بين الرجال في 112 دولة ويحتل المرتبة الثانية من حيث الوفيات في البلدان ذات مؤشر التنمية البشريةالأعلى 1,2. تحدث معظم الوفيات في مرضى سرطان البروستاتا بسبب ورم خبيث ، وحوالي 65٪ -75٪ من الحالات ستتطور إلى ورم خبيث في العظام 3,4. لذلك ، هناك حاجة ماسة للوقاية والعلاج من النقائل العظمية لسرطان البروستاتا لتحسين النتائج السريرية لمرضى سرطان البروستاتا. يعد النموذج الحيواني لورم خبيث في العظام أداة لا غنى عنها لاستكشاف العملية متعددة المراحل والآليات الجزيئية التي تنطوي عليها كل مرحلة من مراحل ورم خبيث في العظام بسرطان البروستاتا ، وبالتالي تحديد الأهداف العلاجية وتطوير علاجات جديدة5.

تشمل الطرق الأكثر شيوعا لإنشاء نماذج حيوانية تجريبية لورم خبيث عظمي لسرطان البروستاتا تقويم العظام ، وداخل الحجاب الحاجز (مثل داخل الظنبوب) ، والحقن داخل القلب لخلايا سرطان البروستاتا. يتم إنشاء نموذج ورم خبيث عظمي مع حقن تقويم العظام عن طريق حقن خلايا سرطان البروستاتا مباشرة في البروستاتا من الفأر 6,7. هذا النموذج الحيواني التجريبي له خصائص سريرية مشابهة جدا لورم خبيث في العظام بسرطان البروستاتا. ومع ذلك ، يحدث ورم خبيث بشكل رئيسي في العقدة الليمفاوية الإبطية والرئة بدلا من العظام 8,9. يقوم نموذج الحقن داخل الظنبوب لسرطان البروستاتا بحقن خلايا سرطان البروستاتا مباشرة في الساق بمعدل تكوين ورم مرتفع في العظام (الظنبوب)10,11; ومع ذلك ، فإن قشرة العظام وتجويف نخاع العظام تتلف بسهولة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن لطريقة حقن الظنبوب تحفيز العملية المرضية لورم خبيث عظمي لسرطان البروستاتا حيث تستعمر الخلايا السرطانية العظام من خلال الدورة الدموية. للتحقيق في الدورة الدموية ، وتسرب الأوعية الدموية ، وورم خبيث بعيد مع ارتفاع معدل ورم خبيث في العظام للخلايا السرطانية ، تم تطوير تقنية الحقن داخل القلب عن طريق الحقن المباشر لخلايا سرطان البروستاتا في البطين الأيسر للفأر8،12،13. هذا يجعله نموذجا حيوانيا قيما لأبحاث ورم خبيثفي العظام 8. تظهر طريقة الحقن داخل القلب معدل ورم خبيث في العظام يبلغ حوالي 75٪ 9,14 ، وهو أعلى بكثير من طريقة الحقن التقويمي. لذلك ، فإن الحقن داخل القلب هو وسيلة مثالية لتوليد نموذج حيواني مع ورم خبيث في العظام سرطان البروستاتا.

يهدف هذا العمل إلى وصف عملية إنشاء نموذج فأر لنقائل عظام سرطان البروستاتا ، مما يسمح للقراء بتصور إنشاء النموذج. يوفر العمل الحالي عمليات مفصلة واحتياطات وصورا توضيحية لتوليد نموذج xenograft للنقائل العظمية عن طريق الحقن داخل القلب لخلايا سرطان البروستاتا البشرية في الفئران الأثيمية. توفر هذه الطريقة أداة فعالة لمزيد من استكشاف الآليات الجزيئية والآثار العلاجية في الجسم الحي لورم خبيث في العظام بسرطان البروستاتا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إيواء ذكور الفئران الأثيمية BALB / c البالغة من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع (ن = 10) في أقفاص فئران جيدة التهوية (5 فئران / قفص) في غرفة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في ظل ظروف دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، مع حرية الوصول إلى علف SPF والمياه المعقمة. تم تغذية الفئران بشكل تكيفي لمدة أسبوع قبل التجارب. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان بجامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي.

1. إعداد الخلية

  1. في يوم حقن خلايا سرطان البروستاتا ، اغسل 80٪ -90٪ من خلايا لوسيفيراز المتقاربة المسمى PC-3 (PC-3-luciferase) المزروعة في طبق زراعة الخلايا 10 سم مع PBS المعقم قبل البرودة (درجة الحموضة 7.4) مرتين. التربسين لمدة 3 دقائق مع 1.5 مل من 0.25 ٪ التربسين ، وجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي 15 مل بعد إخماد التربسين مع 6 مل من F-12 المتوسطة التي تحتوي على 10 ٪ مصل.
    ملاحظة: يتم اشتقاق خط خلية PC-3-luciferase من خط خلية PC-3 بعد نقله باستخدام ناقل pLV-luciferase15.
  2. استخدم عداد خلية أوتوماتيكي واحسب تركيز الخلية عن طريق نقل 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى لوحة عد الخلايا (انظر جدول المواد).
  3. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 800 × غرام في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
  4. استخدم ماصة للتخلص من المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط F-12 (انظر جدول المواد) إلى كثافة خلية نهائية تبلغ 1 × 107 خلايا / مل.
  5. الحفاظ على الخلايا على الجليد في جميع الأوقات حتى الحقن.
  6. إحضار الخلايا إلى غرفة الجراحة وإنهاء حقن الخلايا في غضون 2 ساعة.
    ملاحظة: قم بإعداد معلقات خلايا إضافية (عادة ما تكون مضاعفة الأحجام حسب الحاجة) لضمان جرعات حقن دقيقة (على سبيل المثال ، لتجنب المساحات الميتة داخل المحاقن).

2. جراحة الحقن داخل القلب لخلايا سرطان البروستاتا البشرية

ملاحظة: الجهاز الجراحي المستخدم للحقن داخل القلب هو حقنة 1 مل (الشكل 1). توفير الدعم الحراري طوال العملية حتى تعافي الحيوان من التخدير.

  1. احتفظ بالماوس في غرفة الحيوانات SPF. تنفيذ جميع الإجراءات مع الأجهزة المعقمة داخل خزانة معقمة.
  2. تخدير الفأر باستخدام 2٪ إيزوفلوران مع 98٪ أكسجين تحت معدل تدفق أكسجين 2 لتر / دقيقة.
    ملاحظة: تشويه كمية صغيرة من مرهم العيون على عيون الفأر لتجنب الجفاف أثناء التخدير. إجراء الجراحة بأكملها في منطقة جيدة التهوية. تأكد من تخدير الفأر بعمق عن طريق الضغط على أصابع الفأر قبل حقن الخلية. إذا بقيت الاستجابات (على سبيل المثال ، رعشة أو ارتعاش) ، فانتظر وقتا إضافيا حتى يصبح التخدير ساري المفعول.
  3. ضع الماوس في وضع داعم وشل حركة كلا الطرفين العلويين بشكل عمودي بعيدا عن خط الوسط (الشكل 2 أ).
  4. شل حركة الماوس من البطن إلى أسفل بشريط لاصق جراحي. تجنب الضغط بشدة وتشريد الأعضاء الداخلية (الشكل 2 ب).
    ملاحظة: الحفاظ على التشريح الطبوغرافي (أي التثبيت بشريط لاصق) أمر ضروري لأن الحقن داخل القلب أعمى (أي أن موقع الحقن الدقيق على القلب غير مرئي للعين المجردة).
  5. تطهير جلد الصدر مع مسحة الإيثانول 70 ٪.
  6. تحديد عملية خنجري الفأر في الاكتئاب في الطرف الأدنى من منتصف القص عن طريق ملامسة منتصف جدار الصدر الأمامي. حدد الشق الوداجي للفأر في المنخفض المركزي عند الحد العلوي للمانوبريوم عن طريق الجس من منتصف جدار الصدر الأمامي.
  7. قم بتسمية النقطة الأكثر سخفا في عملية الخنجري والشق الوداجي بقلم تحديد (الشكل 2 أ). ضع علامة ثالثة في منتصف هذين المعلمين وقليلا إلى اليمين (يسار الحيوان) فوق القلب مباشرة في الفضاء الوربي الثالث.
    ملاحظة: موقع الحقن هو 1-2 مم يسار خط الوسط ، ونقطة الحقن بين الضلعين الثالث والرابع للفأر (الشكل 2 أ).
  8. قم بتحميل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة سعة 1 مل.
    ملاحظة: احتفظ بفقاعة هواء في المحقنة ، كما هو موضح في الشكل 2 ج ، للتأكد من أن الدم ينبض. يجب خلط تعليق الخلية جيدا قبل التحميل.
  9. أدخل إبرة 26 جم عموديا عبر موقع الحقن (الشكل 2 د).
  10. حافظ على ثبات اليد التي تمسك المحقنة على الطاولة ، أو استخدم اليد الأخرى لتثبيتها بقوة. تأكد من أن المحور الطويل للمحقنة عمودي على موقع الحقن ، وأدخل المحقنة حوالي 2 مم تحت الجلد.
  11. يظهر نبض الدم الأحمر الفاتح في محور الإبرة و / أو تعليق الخلية عندما يتم إدخال طرف الإبرة بشكل صحيح في البطين الأيسر. إذا كان نبض الدم غير مرئي ، فإن طرف الإبرة ليس في القلب. سحب واستبدال الإبرة (في حالة تخثر الدم داخل الإبرة توقف نبض الدم). أدخل الإبرة مرة أخرى.
  12. حقن الخلايا. حقن تعليق الخلية (100 ميكرولتر) ببطء شديد أكثر من 40-60 ثانية والحفاظ على اليد التي تمسك المحقنة مستقرة طوال الوقت.
    ملاحظة: راقب عن كثب تعليق الخلية في المحقنة ، ولا تحقن فقاعة الهواء داخل المحقنة في القلب.
  13. اضغط على موقع الحقن باستخدام قطعة قطن جافة لمدة 15 ثانية لضمان الإرقاء عند سحب الإبرة.
  14. أعد الماوس إلى القفص النظيف وراقب الحيوان حتى يتعافى تماما من التخدير.
  15. تخيل الفأر بنظام التلألؤ الحيوي في الجسم الحي في غضون 24 ساعة بعد الحقن للتأكد من دخول الخلايا السرطانية إلى الدورة الدموية الجهازية.
    ملاحظة: تدخل الخلايا السرطانية المحقونة بشكل صحيح الدورة الدموية الشريانية عبر البطين الأيسر للقلب ، والذي يظهر من خلال إشارات التلألؤ الحيوي المرئية في جميع أنحاء الجسم (على سبيل المثال ، انظر الشكل 3 أ).
  16. أداء التصوير الحيوي في الجسم الحي .
    1. قم بتشغيل الجهاز والكمبيوتر. افتح البرنامج عندما يضيء مؤشر الطاقة على الجهاز والكمبيوتر ، ثم افتح نافذة الحصول على الصور .
    2. حدد نظام التصوير في الجسم الحي المتصل بالكمبيوتر في جزء الجهاز. ضع الماوس المراد تصويره في غرفة التصوير في وضع ضعيف. ثم أغلق باب غرفة التصوير.
    3. قم بتعيين المعلمات في جزء الإعداد المتوفر في نافذة الحصول على الصورة .
      1. اضبط المعلمات باستخدام عدسة > التكبير/التصغير > 1x وعدسة التركيز > > 108 وعدسة > Iris > F 2.8 لجعل الصور واضحة.
      2. اضبط قناة التصوير في Filter & Light: Filter وLight > Filter > Luminescence و Filter وLight > Light > OFF و Filter وLight > شدة الضوء > المنتصف.
      3. اضبط نوع الصورة المراد التقاطها: التصوير من النوع > > إطار واحد، وقت التعرض للتصوير > > 500 مللي ثانية، وضع التصوير > HDR > وضع الكسب المنخفض. انقر فوق الزر "اكتساب " للحصول على الصورة.
  17. تصور نمو السرطان النقيلي مع التلألؤ الحيوي في الجسم الحي .
    ملاحظة: في كل نقطة زمنية من التصور ، قم بحقن 200 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيرين داخل الصفاق في فأر 20 جم (150 مجم / كجم) وانتظر 15 دقيقة قبل التخدير (2٪ إيزوفلوران ممزوج بأكسجين 98٪ في غرفة الحث). ضع الماوس على منصة نظام التصوير الحيوي التلألؤ. الحفاظ على التخدير من خلال قناع الأنف مع 2 ٪ إيزوفلوران.

3. التحقيق المرضي

  1. بعد أربعة أسابيع من حقن الخلية ، التضحية بالفأر عن طريق استنشاق CO2 ثم خلع عنق الرحم.
  2. شل حركة الماوس في وضع ضعيف. قم بعمل شق عمودي (حوالي 6 سم) من البطن إلى الصدر باستخدام مقص جراحي لكشف وفحص جميع الأعضاء في البطن والصدر بحثا عن آفات سرطانية و / أو تغيرات مرضية.
    ملاحظة: بالنسبة لدراسة حقن الخلايا السرطانية داخل القلب ، تشير الآفات السرطانية في المنصف المجاور للقلب إلى خلايا سرطانية محقونة بشكل خاطئ (خلايا غير محقونة في البطين القلبي الأيسر) ؛ لذلك ، لا يتم تضمين هذه الفئران في جمع البيانات النهائية.
  3. استئصال الأورام النقيلي بالمقص. قم بقياس الأقطار الطويلة (أ) والأقطار القصيرة (ب) للورم باستخدام الفرجار لحساب حجم الورم (V) باستخدام الصيغة V = 1/2 × a × b2 ، ووزن الورم باستخدام مقياس إلكتروني.
  4. إصلاح أنسجة الورم في محلول الفورمالين 10 ٪ تليها التضمين في البارافين. بدلا من ذلك ، قم بتجميد الأورام في النيتروجين السائل.
  5. استئصال العظام (الأطراف الخلفية والفقرات و / أو الأضلاع) مع الآفات النقيلية. ثبت عينة كل فأر في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 20 مل من محلول الفورمالين بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة بعد إزالة الجلد والعضلات ، متبوعا بإزالة الكلس لمدة 14 يوما في محلول EDTA بنسبة 10٪ مع تغيير المخزن المؤقت المتكرر (كل 3 أيام).
  6. تضمين العينة في البارافين وتقسيم العينات للفحص النسيجي الروتيني16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوفر تصوير التلألؤ البيولوجي مزايا هائلة في مراقبة تطور الآفة النقيلية لنموذج الحقن داخل القلب. بعد فترة وجيزة من حقن الخلايا السرطانية (في غضون 24 ساعة) ، تم استخدام تصوير التلألؤ الحيوي لتصور الخلايا السرطانية التي تدخل الدورة الدموية العامة (الشكل 3 أ). سيظهر التلألؤ الحيوي الواضح الذي يشير إلى جميع أنحاء الجسم عندما يتم حقن الخلايا السرطانية في الدورة الدموية الشريانية بشكل صحيح. يجب استبعاد البيانات من الفئران التي تظهر إشارات التلألؤ الحيوي فقط في موقع الحقن (القلب) من جمع البيانات النهائية. لوحظت آفات نقيلية في الأطراف الخلفية (الشكل 3B-D) بعد أسبوعين من حقن الخلية. مع تقدم الوقت ، أصبحت الآفات النقيلية أكبر وظهرت في مواقع أخرى ، بما في ذلك القص والأضلاع والفك السفلي.

أظهرت صور الأشعة السينية تدمير العظام الذي يمثل الآفات النقيلية في العظام (الشكل 4 أ). كما تم الكشف عن تدمير العظام عن طريق التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. تم إجراء المسح بالأشعة المقطعية الدقيقة في وضع ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT80) المرتبط ب 3Dcalc ، وإعادة البناء المخروطي ، وتطبيق برنامج تصور النموذج. تم الحصول على إعادة بناء البيانات النقطية لبناء نموذج 3D. يوضح الشكل 4 ب صورة تمثيلية للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتدمير العظام في الظنبوب القريب. تم تأكيد الآفات النقيلية بشكل أكبر في الأنسجة المدمجة بالبارافين عن طريق تلطيخ H&E (الشكل 4C).

Figure 1
الشكل 1: الجهاز الجراحي. حقنة 1 مل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: حقن خلايا سرطان البروستاتا داخل القلب . (أ) توضح اللوحة الشق الوداجي، وعملية الخنجري، والقفص الصدري (الهامش السفلي)، وخط الوسط. موقع الحقن على مسافة متساوية من عملية الخنجري والشق الوداجي. (ب) يستخدم الشريط الجراحي أفقيا عبر البطن لمنع حركة الفأر أثناء الحقن. ج: حقنة محملة بالتعليق الخلوي ووجود فقاعة هواء. تساعد فقاعة الهواء على تصور نبض الدم. د: تدخل الإبرة رأسيا عبر موقع الحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تأكيد نموذج الحقن داخل القلب باستخدام نظام تصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي. (أ) تصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي لفأر أثيمي ذكر 24 ساعة بعد حقن خلايا لوسيفيراز المسمى PC-3 (1 × 106 خلايا) في البطين الأيسر للقلب. يتم رؤية الخلايا السرطانية المحقونة بشكل صحيح في الدورة الدموية الجهازية من خلال إشارة التلألؤ الحيوي المنبعثة من الجسم بأكمله. (ب-د) صور التلألؤ الحيوي لفأر تمثيلي يعرض تطور ورم خبيث تدريجي. (ب) صورة توضح خلايا سرطان البروستاتا بعد أسبوعين من الحقن. ج: صورة توضح خلايا سرطان البروستاتا بعد 3 أسابيع من الحقن. د: صورة توضح خلايا سرطان البروستاتا بعد 4 أسابيع من الحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: طرق الكشف المختلفة عن النقائل العظمية التي تسببها خلايا سرطان البروستاتا. (أ) صورة تمثيلية بالأشعة السينية؛ يظهر السهم الأحمر تدمير العظام في الساق القريبة. ب: صورة تمثيلية للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق للظنبوب. (ج) صورة H&E توضح النقائل العظمية لخلايا سرطان البروستاتا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد الحقن داخل القلب لخلايا سرطان البروستاتا البشرية لتوليد ورم خبيث في العظام نموذجا مثاليا للفأر لاستكشاف وظائف وآليات ورم خبيث في العظام بسرطان البروستاتا وتقييم الفعالية العلاجية. أظهرت الدراسات أن تلف العظام يحدث على الأرجح في الساق القريبة وعظم الفخذالبعيد 17 ، والذي قد يكون بسبب ارتفاع الأوعية الدموية والنشاط الأيضي.

نظرا لأن ورم خبيث في العظام هو آفة نقيلية يتم ملاحظتها بشكل متكرر في مرضى سرطان الثدي ، فإن نموذج ورم خبيث عظمي ينتج عن طريق الحقن داخل القلب لخلايا سرطان الثدي يستخدم أيضا بشكل شائع في الدراسات التي أجريت على سرطان الثدي18,19. لذلك ، يمكن أن يساعد العمل الحالي في تطوير نموذج ورم خبيث عظمي ينتج عن طريق الحقن داخل القلب مع خلايا سرطان الثدي والبروستاتا.

لتشكيل الورم بشكل متسق ، هناك بعض الاعتبارات الرئيسية. يجب حقن الخلايا في أقرب وقت ممكن بعد الانفصال عن الثقافة. يجب أن تكون الفئران عشوائية في مجموعات تجريبية بعد حقن الخلايا السرطانية. يجب أن يكون حجم الحقن ثابتا ويجب على نفس الشخص حقن الخلايا السرطانية لجميع الفئران باستخدام نفس التقنية.

يحتوي الإجراء بأكمله على عدة خطوات حاسمة. إذا تم وضع موقع الحقن بشكل صحيح ، فيجب ملاحظة الدم النابض أثناء الحقن. يعد فقدان ثبات اليد التي تمسك المحقنة والتغيير في موضع الإبرة أثناء تقدم مكبس المحقنة من المشاكل المحتملة. حقنة ذات محور ملون بداخلها تجعل نبض الدم مرئيا بسهولة. إذا ظهرت فقاعات هواء في محور الإبرة عند إدخال الإبرة (مما يشير إلى سوء الإدخال في الرئتين) ، فيجب إزالة الإبرة وإدخالها مرة أخرى بعد النقل. إذا لم يكن هناك نبض دم أحمر في محور الإبرة، ولكن الشخص الذي يحقن واثق من صحة موقع الحقن، اسحب مكبس المحقنة قليلا للتحقق من الحقن في البطين القلبي. يشير عدم وجود ورم خبيث بعد 2-3 أسابيع من حقن الخلايا السرطانية إلى خطأ في الحقن. تأكيد الدورة الدموية للخلايا السرطانية في الجسم كله عن طريق التصوير الحيوي في غضون 24 ساعة بعد الحقن20. يمكن رؤية إشارات التلألؤ البيولوجي في جميع أنحاء الجسم إذا تم حقن الخلايا السرطانية بدقة في البطين القلبي. علاوة على ذلك ، قد يختلف معدل النقيلي والموقع وعدد الأورام النقيلية في خطوط الخلايا المختلفة 8,21.

بعد الجراحة ، يجب فحص الفئران بانتظام. بسبب الجراحة والتعرض للتخدير ، قد تعاني الفئران من ضائقة كبيرة أو حتى تموت. لذلك ، فإن الأسبوع الأول بعد الجراحة أمر بالغ الأهمية ، ويجب مراقبة الفئران بعناية. خلال تجربة ورم خبيث في العظام ، يجب مراقبة الفئران يوميا بحثا عن التغيرات في مستويات النشاط والتنقل وظهور دنف (متلازمة الأباعد الورمية في الفئران التي تتميز بفقدان الوزن وضمور العضلات وضعفها والمظهر المقوس والخمول22,23). يجب القتل الرحيم للفئران عند فقدان 10٪ -20٪ من وزن الجسم ؛ تطور الورم يضعف الحركة (على سبيل المثال ، كسر العظام الطويل ، إمالة الرأس ، الشلل النصفي) ؛ أو يبدو أن الفئران في ضائقة تنفسية24.

ميزة هذا النموذج هي أن الخلايا السرطانية المكتشفة في العظام قد "زرعت التربة" 25 ، وبالتالي تكرار التقدم الطبيعي لتشكيل النقائل الدقيقة للخلايا السرطانية المنتشرة. يحتوي هذا النموذج أيضا على العديد من القيود. هذا هو نموذج سرطان xenograft باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة. هذا النموذج غير مفيد لدراسة التفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية في البيئة المكروية لورم خبيث في العظام. تشير التقديرات إلى أن حوالي 30 ٪ من الفئران سوف تموت أثناء النمذجة. لذلك ، ستعمل الممارسة على تحسين معدل نجاح تطوير النموذج بشكل كبير. علاوة على ذلك ، يمكن أن تحدث آفة ورم خبيث أيضا في الدماغ والرئتين والكلى. يتداخل تكوين النقائل المتعددة مع دراسة آليات ورم خبيث في العظام9،26،27،28. على الرغم من أن معدل ورم خبيث في العظام أعلى بكثير عن طريق الحقن داخل القلب منه عن طريق الحقن التقويمي ، إلا أن تقنية الحقن داخل القلب تظهر معدل ورم خبيث في العظام يبلغ حوالي 75٪ بدلا من 100٪ 9,14. قد تكون الكفاءة المنخفضة بسبب فشل الخلايا السرطانية المحقونة في دخول الدورة الدموية أو وفاة الفأر المتلقي أثناء حقن القلب بسبب ثقب الإبرة للقلب أو الرئة.

على الرغم من هذه القيود ، أثبت نموذج الفأر الراسخ هذا لورم خبيث في العظام بسرطان البروستاتا أنه أداة ممتازة لدراسة الحديث المتبادل بين العظام والسرطان وتقييم العلاجات المحتملة لمنع تطور السرطان وتعطيل دورة تدمير العظام الناجم عن ورم خبيث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2018YFC1704300 و 2020YFE0201600) ، والمؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (81973877 و 82174408) ، والمشاريع البحثية ضمن ميزانية جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي (2021LK047) ، ومركز شنغهاي للابتكار التعاوني للتحول الصناعي لإعداد الطب الصيني التقليدي في المستشفى.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringes and needles Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd 20200411 The cells were injected into the ventricles of mice
Anesthesia machine Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd R500IP Equipment for anesthetizing mice
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000  For counting cells
BALB/c athymic mice Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. Male 6-8 week old, male mice
Bioluminescence imaging system Shanghai Baitai Technology Co., Ltd Vieworks For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning
EDTA solution Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd G1105  For decalcification of bone tissure
F-12 medium Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 21700075, GIBCO Cell culture medium
Formalin solution Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd BL539A For fixing the specimen of each mouse
Isoflurane Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd VETEASY For anesthesia 
Lipofectamine 2000 Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 11668027, Thermo fisher Plasmid transfection reagent
PC-3 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences TCHu 158 Prostate cancer cell line
Phosphate-buffered saline Beyotime Biotechnology ST447 Wash the human osteosarcoma cells
Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco For detaching the cells
Vector (pLV-luciferase) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd VL3613 Plasmid for transfection
X-ray imaging system Brook (Beijing) Technology Co., Ltd FX PRO For obtaining x-ray images to detect tumor growth
μCT80 Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd Scanco Medical AG,Switzerland For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction,  and μCT Ray V3.4A model visualization software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer Cancerstatistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
  2. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  3. Coleman, R. E. Skeletal complications of malignancy. Cancer. 80, 1588-1594 (1997).
  4. Macedo, F., et al. Bone metastases: An overview. Oncology Reviews. 11 (1), 321 (2017).
  5. Rea, D., et al. Mouse models in prostate cancer translational research: From xenograft to PDX. BioMed Research International. 2016, 9750795 (2016).
  6. Zhang, Y., et al. Real-time GFP intravital imaging of the differences in cellular and angiogenic behavior of subcutaneous and orthotopic nude-mouse models of human PC-3 prostate cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (11), 2546-2551 (2016).
  7. Stephenson, R. A., et al. Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice. Journal of the National Cancer Institute. 84 (12), 951-957 (1992).
  8. Simmons, J. K., et al. Animal models of bone metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  9. Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Research: BCR. 7 (4), 444-454 (2005).
  10. Corey, E., et al. Establishment and characterization of osseous prostate cancer models: intra-tibial injection of human prostate cancer cells. The Prostate. 52 (1), 20-33 (2002).
  11. Andersen, C., Bagi, C. M., Adams, S. W. Intra-tibial injection of human prostate cancer cell line CWR22 elicits osteoblastic response in immunodeficient rats. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 3 (2), 148-155 (2003).
  12. Sudhan, D. R., Pampo, C., Rice, L., Siemann, D. W. Cathepsin L inactivation leads to multimodal inhibition of prostate cancer cell dissemination in a preclinical bone metastasis model. International Journal of Cancer. 138 (11), 2665-2677 (2016).
  13. Jinnah, A. H., Zacks, B. C., Gwam, C. U., Kerr, B. A. Emerging and established models of bone metastasis. Cancers. 10 (6), 176 (2018).
  14. Simmons, J. K., et al. Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo. The Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  16. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
  17. Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Research. 48 (23), 6876-6881 (1988).
  18. Brylka, L., et al. Spine Metastases in immunocompromised mice after intracardiac injection of MDA-MB-231-SCP2 breast cancer cells. Cancers. 14 (3), 556 (2022).
  19. Rahman, M. M., Veigas, J. M., Williams, P. J., Fernandes, G. DHA is a more potent inhibitor of breast cancer metastasis to bone and related osteolysis than EPA. Breast Cancer Research and Treatment. 141 (3), 341-352 (2013).
  20. Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 14, Unit 14.15 (2010).
  21. Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
  22. Fearon, K. C., Glass, D. J., Guttridge, D. C. Cancer cachexia: mediators, signaling, and metabolic pathways. Cell Metabolism. 16 (2), 153-166 (2012).
  23. Waning, D. L., et al. Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21 (11), 1262-1271 (2015).
  24. Talbot, S. R., et al. Defining body-weight reduction as a humane endpoint: a critical appraisal. Laboratory Animals. 54 (1), 99-110 (2020).
  25. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
  26. Yin, J. J., et al. TGF-beta signaling blockade inhibits PTHrP secretion by breast cancer cells and bone metastases development. The Journal of Clinical Investigation. 103 (2), 197-206 (1999).
  27. Schneider, A., et al. turnover mediates preferential localization of prostate cancer in the skeleton. Endocrinology. 146 (4), 1727-1736 (2005).
  28. Padalecki, S. S., et al. Chromosome 18 suppresses prostate cancer metastases. Urologic Oncology. 21 (5), 366-373 (2003).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 189 ،
الحقن داخل القلب لخلايا سرطان البروستاتا البشرية لإنشاء نموذج فأر Xenograft نقيلي عظمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J., Sun, X., Ma, X., Zhao,… More

Chang, J., Sun, X., Ma, X., Zhao, P., Shi, B., Wang, Y., Han, X., Yang, Y. Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (189), e64589, doi:10.3791/64589 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter