Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l'iniezione intra-cardiaca di cellule tumorali della prostata umane per generare un modello murino con lesioni da metastasi ossee.
Abstract
Come la neoplasia maschile più comune, il cancro alla prostata (PC) è al secondo posto nella mortalità, principalmente a causa di un tasso di metastasi ossee del 65% -75%. Pertanto, è essenziale comprendere il processo e i relativi meccanismi delle metastasi ossee del cancro alla prostata per lo sviluppo di nuove terapie. Per questo, un modello animale di metastasi ossee è uno strumento essenziale. Qui, riportiamo procedure dettagliate per generare un modello murino di metastasi ossee tramite iniezione intracardiaca di cellule tumorali della prostata. Un sistema di imaging a bioluminescenza può determinare se le cellule tumorali della prostata sono state accuratamente iniettate nel cuore e monitorare le metastasi delle cellule tumorali poiché ha grandi vantaggi nel monitoraggio dello sviluppo della lesione metastatica. Questo modello replica lo sviluppo naturale delle cellule tumorali disseminate per formare micro-metastasi nell'osso e imita il processo patologico delle metastasi ossee del cancro alla prostata. Fornisce uno strumento efficace per ulteriori esplorazioni dei meccanismi molecolari e degli effetti terapeutici in vivo di questa malattia.
Introduction
Il cancro alla prostata è il tumore più frequente negli uomini in 112 paesi e si colloca al secondo posto per mortalità nei paesi con un indice di sviluppo umano più elevato 1,2. La maggior parte dei decessi nei pazienti con cancro alla prostata sono causati da metastasi e circa il 65% -75% dei casi svilupperà metastasi ossee 3,4. Pertanto, la prevenzione e il trattamento delle metastasi ossee del cancro alla prostata sono urgentemente necessari per migliorare l'esito clinico dei pazienti con cancro alla prostata. Il modello animale di metastasi ossee è uno strumento indispensabile per esplorare il processo multistadio e i meccanismi molecolari coinvolti in ogni stadio delle metastasi ossee del cancro alla prostata, identificando così bersagli terapeutici e sviluppando nuove terapie5.
I metodi più comuni per generare modelli animali sperimentali di metastasi ossee del cancro alla prostata includono l'ortotopica, l'intra-diafisi (come l'iniezione intra-tibiale) e intra-cardiaca delle cellule tumorali della prostata. Il modello di metastasi ossea con iniezione ortotopica viene generato iniettando direttamente cellule tumorali della prostata nella prostata di un topo 6,7. Questo modello animale sperimentale ha caratteristiche cliniche molto simili alle metastasi ossee del cancro alla prostata. Tuttavia, le metastasi avvengono principalmente nel linfonodo ascellare e nel polmone piuttosto che nell'osso 8,9. Il modello di iniezione intratibiale per il cancro alla prostata inietta direttamente cellule tumorali della prostata nella tibia con un alto tasso di formazione tumorale nell'osso (tibia)10,11; Tuttavia, la corteccia ossea e la cavità del midollo osseo sono facilmente danneggiate. Inoltre, il metodo di iniezione tibiale non può stimolare il processo patologico delle metastasi ossee del cancro alla prostata in cui le cellule tumorali colonizzano l'osso attraverso la circolazione. Per studiare la circolazione, lo stravaso vascolare e le metastasi a distanza con un più alto tasso di metastasi ossee delle cellule tumorali, è stata sviluppata una tecnica di iniezione intracardiaca iniettando direttamente le cellule tumorali della prostata nel ventricolo sinistro del topo 8,12,13. Questo lo rende un valido modello animale per la ricerca sulle metastasi ossee8. Il metodo di iniezione intracardiaca mostra un tasso di metastasi ossee di circa il 75%9,14, molto più alto rispetto al metodo di iniezione ortotopica. Pertanto, l'iniezione intracardiaca è un metodo ideale per generare un modello animale con metastasi ossee del cancro alla prostata.
Questo lavoro mira a descrivere il processo di creazione di un modello murino di metastasi ossee del cancro alla prostata, consentendo ai lettori di visualizzare l'istituzione del modello. Il lavoro attuale fornisce processi dettagliati, precauzioni e immagini illustrative per generare un modello di xenotrapianto di metastasi ossee tramite iniezione intracardiaca di cellule tumorali della prostata umane in topi atimici. Questo metodo fornisce uno strumento efficace per esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari e gli effetti terapeutici in vivo delle metastasi ossee del cancro alla prostata.
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Protocol
Topi atimici maschi BALB/c di sei-otto settimane (n = 10) sono stati alloggiati in gabbie di topi ventilate individualmente (5 topi/gabbia) in una stanza per animali priva di agenti patogeni specifici (SPF) nelle condizioni di 12 ore di ciclo luce/buio, con libero accesso al mangime SPF e all'acqua sterile. I topi sono stati nutriti in modo adattivo per una settimana prima degli esperimenti. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato per il benessere degli animali dell'Università di Shanghai di medicina tradizionale cinese.
1. Preparazione delle cellule
- Il giorno dell'iniezione di cellule tumorali della prostata, lavare due volte l'80% -90% di cellule PC-3 marcate con luciferasi confluente (PC-3-luciferasi) coltivate in un piatto di coltura cellulare da 10 cm con PBS sterile pre-freddo (pH 7,4). Tripsinizzare per 3 minuti con 1,5 ml di tripsina allo 0,25% e raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml dopo aver spento la tripsina con 6 ml di terreno F-12 contenente il 10% di siero.
NOTA: La linea cellulare PC-3-luciferasi è derivata dalla linea cellulare PC-3 dopo essere stata trasfettata con il vettore pLV-luciferasi15. - Utilizzare un contatore automatico delle celle e calcolare la concentrazione della cella trasferendo 20 μL della sospensione cellulare alla piastra di conteggio delle celle (vedere Tabella dei materiali).
- Centrifugare le celle a 800 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
- Utilizzare una pipetta per eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel mezzo F-12 (vedere Tabella dei materiali) fino a una densità cella finale di 1 x 107 cellule/ml.
- Tenere le cellule sempre ghiacciate fino all'iniezione.
- Portare le cellule nella sala operatoria e terminare l'iniezione cellulare entro 2 ore.
NOTA: Preparare sospensioni cellulari aggiuntive (di solito volumi raddoppiati secondo necessità) per garantire dosi di iniezione accurate (ad esempio, per evitare gli spazi morti all'interno delle siringhe).
2. Chirurgia per iniezione intracardiaca delle cellule tumorali della prostata umana
NOTA: L'apparato chirurgico utilizzato per l'iniezione intracardiaca è una siringa da 1 mL (Figura 1). Fornire supporto termico durante tutta la procedura fino al recupero dell'animale dall'anestesia.
- Tieni il mouse nella stanza degli animali SPF. Eseguire tutte le procedure con apparecchi sterilizzati all'interno di un armadio asettico.
- Anestetizzare il topo usando isoflurano al 2% con ossigeno al 98% sotto una portata di ossigeno di 2 L/min.
NOTA: Spalmare una piccola quantità di unguento oftalmico sugli occhi del topo per evitare secchezza durante l'anestesia. Eseguire l'intero intervento chirurgico in un'area ben ventilata. Assicurarsi che il topo sia profondamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi del topo prima dell'iniezione cellulare. Se le risposte (ad esempio, uno scatto o una contrazione) rimangono, attendere ulteriore tempo affinché l'anestesia abbia effetto. - Posizionare il topo in posizione supone e immobilizzare entrambi gli arti superiori perpendicolarmente distesi lontano dalla linea mediana (Figura 2A).
- Immobilizzare il mouse dall'addome in giù con nastro adesivo chirurgico. Evitare di premere con forza e spostare gli organi interni (Figura 2B).
NOTA: Mantenere l'anatomia topografica (cioè il fissaggio con nastro adesivo) è essenziale poiché l'iniezione intracardiaca è cieca (cioè, il sito di iniezione accurato sul cuore è invisibile ad occhio nudo). - Disinfettare la pelle del torace con un tampone etanolo al 70%.
- Identificare il processo xifoideo del topo nella depressione all'estremità più bassa dello sterno medio palpando lungo il centro della parete toracica anteriore. Identificare la tacca giugulare del topo nella depressione centrale sul bordo superiore del manubrio palpando dal centro della parete toracica anteriore.
- Etichettare il punto più inferiore del processo xifoideo e la tacca giugulare con un pennarello (Figura 2A). Fai un terzo segno nel mezzo di questi due punti di riferimento e leggermente a destra (a sinistra dell'animale) appena sopra il cuore nel terzo spazio intercostale.
NOTA: Il sito di iniezione si trova a sinistra di 1-2 mm rispetto alla linea mediana e il punto di iniezione si trova tra la terza e la quarta costola del topo (Figura 2A). - Caricare 200 μL della sospensione cellulare in una siringa da 1 ml.
NOTA: Tenere una bolla d'aria nella siringa, come mostrato nella Figura 2C, per assicurarsi che il sangue pulsi. La sospensione cellulare deve essere accuratamente miscelata prima del caricamento. - Inserire verticalmente un ago da 26 G attraverso il sito di iniezione (Figura 2D).
- Tenere la mano che tiene la siringa stabile sul tavolo, o usare l'altra mano per tenerla stabile. Assicurarsi che l'asse lungo della siringa sia perpendicolare al sito di iniezione e inserire la siringa di circa 2 mm per via sottocutanea.
- La pulsazione del sangue rosso vivo è visibile nel mozzo dell'ago e/o nella sospensione cellulare quando la punta dell'ago viene inserita correttamente nel ventricolo sinistro. Se la pulsazione del sangue è invisibile, la punta dell'ago non è nel cuore. Ritrarre e sostituire l'ago (nel caso in cui la coagulazione del sangue all'interno dell'ago interrompa la pulsazione del sangue). Inserire nuovamente l'ago.
- Iniettare le cellule. Iniettare la sospensione cellulare (100 μL) molto lentamente nell'arco di 40-60 s e mantenere la mano che tiene la siringa stabile per tutto il tempo.
NOTA: Tenere d'occhio la sospensione cellulare nella siringa e non iniettare la bolla d'aria all'interno della siringa nel cuore. - Applicare pressione sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone asciutto per 15 s per garantire l'emostasi quando l'ago è retratto.
- Riportare il mouse nella gabbia pulita e monitorare l'animale fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia.
- Immagina il topo con un sistema di bioluminescenza in vivo entro 24 ore dall'iniezione per garantire che le cellule tumorali siano entrate nella circolazione sistemica.
NOTA: Le cellule tumorali correttamente iniettate entrano nella circolazione arteriosa attraverso il ventricolo cardiaco sinistro, che è visibile dalla segnalazione di bioluminescenza visibile su tutto il corpo (ad esempio, vedere Figura 3A). - Eseguire l'imaging a bioluminescenza in vivo.
- Accendere lo strumento e il computer. Aprire il software quando l'indicatore di alimentazione dello strumento e del computer si illumina, quindi aprire la finestra Acquisizione immagini .
- Identificare il sistema di imaging in vivo collegato al computer nel riquadro dei dispositivi. Posizionare il mouse da visualizzare nella camera di imaging in posizione supina. Quindi chiudere lo sportello della camera di imaging.
- Impostare i parametri nel riquadro Impostazioni fornito nella finestra Acquisizione immagini .
- Imposta i parametri con Lens > Zoom > 1x, Lens > Focus > 108 e Lens > Iris > F 2.8 per rendere chiare le immagini.
- Impostare il canale di ripresa in Filter&Light: Filter&Light > Filter > Luminescence, Filter&Light > Light > OFF e Filter&Light > Light Intensity > Middle.
- Impostare il tipo di immagine da scattare: Imaging > Type > Single-Frame, Imaging > Tempo di esposizione > 500 ms, Imaging > HDR Mode > Low GainMode. Fare clic sul pulsante Acquisisci per acquisire l'immagine.
- Visualizza la crescita metastatica del cancro con bioluminescenza in vivo .
NOTA: In ogni punto temporale della visualizzazione, iniettare per via intraperitoneale 200 μL del substrato di luciferina in un topo da 20 g (150 mg/kg) e attendere 15 minuti prima dell'anestesia (isoflurano al 2% miscelato con ossigeno al 98% in una camera di induzione). Posizionare il mouse sulla piattaforma del sistema di imaging a bioluminescenza. Mantenere l'anestesia attraverso una maschera nasale con isoflurano al 2%.
3. Indagine patologica
- Quattro settimane dopo l'iniezione cellulare, sacrificare il topo per inalazione di CO2 e poi dislocazione cervicale.
- Immobilizzare il mouse in posizione supina. Fare un'incisione verticale (circa 6 cm) dall'addome al torace con forbici chirurgiche per esporre ed esaminare grossolanamente tutti gli organi dell'addome e del torace per lesioni cancerose e / o alterazioni patologiche.
NOTA: Per uno studio di iniezione intra-cardiaca di cellule tumorali, le lesioni tumorali nel mediastino adiacente al cuore suggeriscono cellule tumorali iniettate in modo errato (cellule non iniettate nel ventricolo cardiaco sinistro); Pertanto, questi topi non sono inclusi nella raccolta dati finale. - Eliminare i tumori metastatici con le forbici. Misurare i diametri lunghi (a) e i diametri corti (b) del tumore usando calibri per calcolare il volume del tumore (V) usando la formula V = 1/2 × a × b2 e pesare il tumore usando una bilancia elettronica.
- Fissare i tessuti tumorali in una soluzione di formalina al 10% seguita dall'incorporazione in paraffina. In alternativa, congelare i tumori in azoto liquido.
- Asportare le ossa (arti posteriori, vertebre e/o costole) con lesioni metastatiche. Fissare il campione di ciascun topo in una provetta da 50 mL contenente 20 ml di soluzione di formalina al 10% per 24 ore dopo aver rimosso la pelle e i muscoli, seguita da decalcificazione per 14 giorni in soluzione di EDTA al 10% con frequenti cambi di tampone (ogni 3 giorni).
- Incorporare il campione in paraffina e sezionare i campioni per l'esame istologico di routine16.
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Representative Results
L'imaging a bioluminescenza offre enormi vantaggi nel monitoraggio dello sviluppo della lesione metastatica per un modello di iniezione intracardiaca. Subito dopo l'iniezione di cellule tumorali (entro 24 ore), è stata utilizzata la bioluminescenza per visualizzare le cellule tumorali che entrano nella circolazione generale (Figura 3A). L'evidente segnalazione di bioluminescenza su tutto il corpo sarà visibile quando le cellule tumorali vengono iniettate correttamente nella circolazione arteriosa. I dati dei topi che mostrano segnali di bioluminescenza solo nel sito di iniezione (cuore) devono essere esclusi dalla raccolta finale dei dati. Sono state osservate lesioni metastatiche negli arti posteriori (Figura 3B-D) 2 settimane dopo l'iniezione cellulare. Col passare del tempo, le lesioni metastatiche sono diventate più grandi e sono apparse in altri siti, tra cui lo sterno, le costole e la mandibola.
Le immagini a raggi X hanno mostrato la distruzione ossea che rappresenta le lesioni metastatiche nell'osso (Figura 4A). La distruzione ossea è stata rilevata anche mediante scansione micro-CT. La scansione micro-CT è stata eseguita in modalità 3D utilizzando un micro-CT (μCT80) associato a 3Dcalc, ricostruzione del cono e un'applicazione software di visualizzazione del modello. È stata ottenuta una ricostruzione dei dati bitmap per costruire il modello 3D. Un'immagine micro-TC rappresentativa della distruzione ossea nella tibia prossimale è mostrata nella Figura 4B. Le lesioni metastatiche sono state ulteriormente confermate nei tessuti incorporati in paraffina mediante colorazione H & E (Figura 4C).
Figura 1: Apparato chirurgico. Una siringa da 1 ml. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Iniezione intracardiaca di cellule tumorali della prostata . (A) Il pannello illustra la tacca giugulare, il processo xifoideo, la gabbia toracica (margine inferiore) e la linea mediana. Il sito di iniezione è equidistante dal processo xifoideo e dalla tacca giugulare. (B) Il nastro chirurgico viene utilizzato orizzontalmente sull'addome per impedire il movimento del topo durante l'iniezione. (C) Una siringa caricata con la sospensione cellulare e la presenza di una bolla d'aria. La bolla d'aria aiuta a visualizzare la pulsazione del sangue. (D) L'ago viene inserito verticalmente attraverso il sito di iniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Conferma del modello di iniezione intracardiaca con un sistema di imaging a bioluminescenza in vivo. (A) Imaging a bioluminescenza in vivo di un topo atimico maschio 24 ore dopo l'iniezione di cellule PC-3 marcate con luciferasi (1 × 106 cellule) nel ventricolo cardiaco sinistro. Le cellule tumorali correttamente iniettate nella circolazione sistemica sono viste dal segnale di bioluminescenza rilasciato da tutto il corpo. (B-D) Immagini di bioluminescenza di un topo rappresentativo che mostra uno sviluppo progressivo di metastasi. (B) Un'immagine che mostra le cellule tumorali della prostata 2 settimane dopo l'iniezione. (C) Un'immagine che mostra le cellule tumorali della prostata 3 settimane dopo l'iniezione. (D) Un'immagine che mostra le cellule tumorali della prostata 4 settimane dopo l'iniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Diversi metodi di rilevamento delle metastasi ossee indotte dalle cellule tumorali del cancro alla prostata. (A) un'immagine rappresentativa a raggi X; La freccia rossa mostra la distruzione ossea nella tibia prossimale. (B) Un'immagine micro-TC rappresentativa della tibia. (C) Immagine H & E che mostra metastasi ossee delle cellule tumorali della prostata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'iniezione intracardiaca di cellule tumorali della prostata umane per generare metastasi ossee è un modello murino ideale per esplorare le funzioni e i meccanismi delle metastasi ossee del cancro alla prostata e valutare l'efficacia terapeutica. Gli studi hanno dimostrato che il danno osseo si verifica molto probabilmente nella tibia prossimale e nel femore distale17, che può essere dovuto alla loro elevata vascolarizzazione e attività metabolica.
Poiché la metastasi ossea è una lesione metastatica frequentemente osservata nei pazienti con carcinoma mammario, il modello di metastasi ossea prodotto mediante iniezione intracardiaca di cellule di cancro al seno è anche comunemente usato negli studi sul cancro al seno18,19. Pertanto, il lavoro attuale potrebbe aiutare a sviluppare un modello di metastasi ossee prodotte da iniezione intracardiaca con cellule tumorali al seno e alla prostata.
Per una formazione tumorale coerente, ci sono alcune considerazioni chiave. Le cellule devono essere iniettate il prima possibile dopo il distacco dalla coltura. I topi dovrebbero essere randomizzati in gruppi sperimentali dopo l'iniezione di cellule tumorali. Il volume di iniezione deve essere costante e la stessa persona deve iniettare cellule tumorali a tutti i topi usando la stessa tecnica.
L'intera procedura contiene diversi passaggi critici. Se il sito di iniezione è posizionato correttamente, durante l'iniezione deve essere osservato sangue pulsato. La perdita di stabilità della mano che tiene la siringa e il cambiamento nella posizione dell'ago durante l'avanzamento dello stantuffo della siringa sono potenziali problemi. Una siringa con un mozzo colorato all'interno rende la pulsazione del sangue facilmente visibile. Se nel mozzo dell'ago compaiono bolle d'aria durante l'inserimento dell'ago (indicando un errato inserimento nei polmoni), l'ago deve essere rimosso e reinserito dopo il trasferimento. Se non vi è alcun impulso rosso del sangue nel mozzo dell'ago, ma la persona che inietta è sicura che il sito di iniezione sia corretto, tiri leggermente lo stantuffo della siringa per verificare l'iniezione nel ventricolo cardiaco. La mancanza di metastasi dopo 2-3 settimane di iniezione di cellule tumorali indica un'iniezione errata. Confermare la circolazione delle cellule tumorali in tutto il corpo mediante imaging a bioluminescenza entro 24 ore dall'iniezione20. La segnalazione di bioluminescenza potrebbe essere vista in tutto il corpo se le cellule tumorali fossero iniettate accuratamente nel ventricolo cardiaco. Inoltre, il tasso metastatico, la posizione e il numero di tumori metastatici possono differire in diverse linee cellulari 8,21.
Dopo l'intervento chirurgico, i topi devono essere controllati regolarmente. A causa dell'intervento chirurgico e dell'esposizione anestetica, i topi possono sperimentare un disagio significativo o addirittura morire. Pertanto, la prima settimana dopo l'intervento chirurgico è critica e i topi devono essere attentamente monitorati. Durante un esperimento di metastasi ossea, i topi devono essere monitorati quotidianamente per i cambiamenti nei livelli di attività, nella mobilità e nell'insorgenza della cachessia (una sindrome paraneoplastica nei topi caratterizzata da perdita di peso, atrofia muscolare e debolezza, aspetto arcuato e letargia22,23). I topi dovrebbero essere eutanizzati quando il 10% -20% del loro peso corporeo è perso; la progressione del tumore altera la mobilità (ad esempio, frattura dell'osso lungo, inclinazione della testa, paraplegia); o i topi sembrano essere in difficoltà respiratoria24.
Il vantaggio di questo modello è che le cellule tumorali rilevate nell'osso hanno "seminato il terreno" 25, replicando così la progressione più naturale della formazione di micro-metastasi delle cellule tumorali disseminate. Questo modello ha anche diverse limitazioni. Questo è un modello di cancro xenotrapianto che utilizza topi immunodeficienti. Questo modello non è utile per studiare l'interazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie nel microambiente delle metastasi ossee. Si stima che circa il 30% dei topi morirà durante la modellazione; Pertanto, la pratica migliorerà notevolmente il tasso di successo dello sviluppo del modello. Inoltre, la lesione da metastasi può verificarsi anche nel cervello, nei polmoni e nei reni; La formazione di metastasi multiple interferisce con lo studio dei meccanismi delle metastasi ossee 9,26,27,28. Sebbene il tasso di metastasi ossee sia molto più alto per iniezione intracardiaca che per iniezione ortotopica, la tecnica di iniezione intracardiaca mostra un tasso di metastasi ossee di circa il 75% anziché del 100%9,14. La minore efficienza può essere dovuta al fatto che le cellule tumorali iniettate non sono riuscite a entrare nella circolazione sanguigna o alla morte del topo ricevente durante un'iniezione cardiaca a causa dell'ago che perfora il cuore o il polmone.
Nonostante queste limitazioni, questo modello murino consolidato di metastasi ossee del cancro alla prostata ha dimostrato di essere uno strumento eccellente per studiare la diafonia ossea e del cancro e valutare potenziali terapie per prevenire la progressione del cancro e interrompere il ciclo di distruzione ossea indotta da metastasi.
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Disclosures
Tutti gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 e 2020YFE0201600), della National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408), dei progetti di ricerca all'interno del budget della Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047) e dello Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes and needles | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | The cells were injected into the ventricles of mice |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | Equipment for anesthetizing mice |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | For counting cells |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | Male | 6-8 week old, male mice |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | |
| EDTA solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1105 | For decalcification of bone tissure |
| F-12 medium | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 21700075, GIBCO | Cell culture medium |
| Formalin solution | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | BL539A | For fixing the specimen of each mouse |
| Isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | For anesthesia |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027, Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| PC-3 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | TCHu 158 | Prostate cancer cell line |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | Wash the human osteosarcoma cells |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | For detaching the cells |
| Vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid for transfection |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | For obtaining x-ray images to detect tumor growth |
| μCT80 | Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd | Scanco Medical AG,Switzerland | For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction, and μCT Ray V3.4A model visualization software. |
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