Summary
Burada, kemik metastazı lezyonları olan bir fare modeli oluşturmak için insan prostat kanseri hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
En sık görülen erkek malignitesi olan prostat kanseri (PK), esas olarak %65-75 kemik metastazı oranı nedeniyle mortalitede ikinci sırada yer almaktadır. Bu nedenle, prostat kanseri kemik metastazının sürecini ve ilgili mekanizmalarını anlamak, yeni terapötiklerin geliştirilmesi için esastır. Bunun için, kemik metastazının bir hayvan modeli önemli bir araçtır. Burada, prostat kanseri hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu yoluyla bir kemik metastazı fare modeli oluşturmak için ayrıntılı prosedürler sunuyoruz. Bir biyolüminesans görüntüleme sistemi, prostat kanseri hücrelerinin kalbe doğru bir şekilde enjekte edilip edilmediğini belirleyebilir ve metastatik lezyon gelişimini izlemede büyük avantajlara sahip olduğu için kanser hücresi metastazını izleyebilir. Bu model, kemikte mikro-metastaz oluşturmak için yayılmış kanser hücrelerinin doğal gelişimini çoğaltır ve prostat kanseri kemik metastazının patolojik sürecini taklit eder. Moleküler mekanizmaların ve bu hastalığın in vivo terapötik etkilerinin daha fazla araştırılması için etkili bir araç sağlar.
Introduction
Prostat kanseri, 112 ülkede erkeklerde en sık görülen kanserdir ve yüksek insani gelişme endeksi ülkelerinde ölüm oranı açısından ikinci sırada yer almaktadır 1,2. Prostat kanseri hastalarında ölümlerin çoğu metastazdan kaynaklanır ve vakaların yaklaşık% 65-75'inde kemik metastazı gelişir 3,4. Bu nedenle, prostat kanseri hastalarının klinik sonuçlarını iyileştirmek için prostat kanseri kemik metastazlarının önlenmesi ve tedavisine acilen ihtiyaç vardır. Kemik metastazının hayvan modeli, prostat kanseri kemik metastazının her aşamasında yer alan çok aşamalı süreci ve moleküler mekanizmaları keşfetmek, böylece terapötik hedefleri belirlemek ve yeni terapötikler geliştirmek için vazgeçilmez bir araçtır5.
Prostat kanseri kemik metastazının deneysel hayvan modellerini oluşturmak için en yaygın yöntemler, ortotopik, intra-diyafiz (intra-tibial gibi) ve prostat kanseri hücrelerinin intra-kardiyak enjeksiyonunu içerir. Ortotopik enjeksiyonlu kemik metastazı modeli, prostat kanseri hücrelerinin bir farenin prostatına doğrudan enjekte edilmesiyle oluşturulur 6,7. Bu deneysel hayvan modeli, prostat kanseri kemik metastazı ile çok benzer klinik özelliklere sahiptir. Bununla birlikte, metastaz esas olarak kemikte değil, aksiller lenf nodu ve akciğerde gerçekleşir 8,9. Prostat kanseri için intra-tibial enjeksiyon modeli, prostat kanseri hücrelerini kemikte yüksek tümör oluşum hızına sahip tibiaya doğrudan enjekte eder (tibia)10,11; Bununla birlikte, kemik korteksi ve kemik iliği boşluğu kolayca zarar görebilir. Ek olarak, tibial enjeksiyon yöntemi, kanser hücrelerinin dolaşım yoluyla kemiği kolonize ettiği prostat kanseri kemik metastazının patolojik sürecini uyaramaz. Kanser hücrelerinin dolaşımını, vasküler ekstravazasyonunu ve daha yüksek kemik metastazı oranı ile uzak metastazlarını araştırmak için, prostat kanseri hücrelerinin farenin sol ventrikülüne doğrudan enjekte edilmesiyle intrakardiyak enjeksiyon tekniği geliştirilmiştir 8,12,13. Bu, onu kemik metastazı araştırması için değerli bir hayvan modeli yapar8. İntrakardiyak enjeksiyon yöntemi, ortotopik enjeksiyon yönteminden çok daha yüksek olan yaklaşık %759,14'lük bir kemik metastazı oranı göstermektedir. Bu nedenle, intra-kardiyak enjeksiyon, prostat kanseri kemik metastazı olan bir hayvan modeli oluşturmak için ideal bir yöntemdir.
Bu çalışma, prostat kanseri kemik metastazlarının fare modelini oluşturma sürecini tanımlamayı ve okuyucuların model kuruluşunu görselleştirmelerini sağlamayı amaçlamaktadır. Mevcut çalışma, atimik farelerde insan prostat kanseri hücrelerinin intra-kardiyak enjeksiyonu yoluyla bir kemik metastazı ksenograft modeli oluşturmak için ayrıntılı süreçler, önlemler ve açıklayıcı resimler sunmaktadır. Bu yöntem, prostat kanseri kemik metastazının moleküler mekanizmalarını ve in vivo terapötik etkilerini daha fazla araştırmak için etkili bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Altı ila sekiz haftalık erkek BALB / c atimik fareler (n = 10), SPF yemine ve steril suya serbest erişime sahip, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngü koşulları altında spesifik patojen içermeyen (SPF) bir hayvan odasında ayrı ayrı havalandırılan farelerin kafeslerine (5 fare / kafes) yerleştirildi. Fareler, deneylerden önce bir hafta boyunca uyarlanabilir bir şekilde beslendi. Tüm hayvan deneyleri, Şangay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi hayvan refahı komitesi tarafından onaylandı.
1. Hücre hazırlığı
- Prostat kanseri hücresi enjeksiyonu gününde, soğuk öncesi steril PBS (pH 7.4) ile 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında kültürlenmiş% 80-90 konfluent lusiferaz etiketli PC-3 hücrelerini (PC-3-lusiferaz) iki kez yıkayın. 1.5 mL% 0.25 tripsin ile 3 dakika boyunca deneyin ve tripsini% 10 serum içeren 6 mL F-12 ortamı ile söndürdükten sonra hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın.
NOT: PC-3-lusiferaz hücre hattı, pLV-lusiferaz vektörü15 ile transfekte edildikten sonra PC-3 hücre hattından türetilir. - Otomatik bir hücre sayacı kullanın ve hücre süspansiyonunun 20 μL'sini hücre sayım plakasına aktararak hücre konsantrasyonunu hesaplayın (bkz.
- Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 800 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı atmak için bir pipet kullanın ve hücre peletini F-12 ortamında ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 x 107 hücre/mL'lik nihai hücre yoğunluğuna geri askıya alın.
- Enjeksiyona kadar hücreleri her zaman buz üzerinde tutun.
- Hücreleri ameliyathaneye getirin ve hücre enjeksiyonunu 2 saat içinde bitirin.
NOT: Doğru enjeksiyon dozlarını sağlamak için (örneğin, şırıngaların içindeki ölü boşlukları önlemek için) ek hücre süspansiyonları (genellikle gerektiğinde iki katına çıkarılmış hacimler) hazırlayın.
2. İnsan prostat kanseri hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu için cerrahi
NOT: İntrakardiyak enjeksiyon için kullanılan cerrahi aparat 1 mL'lik bir şırıngadır (Şekil 1). Hayvanın anesteziden kurtulmasına kadar prosedür boyunca termal destek sağlayın.
- Fareyi SPF hayvan odasında tutun. Tüm prosedürleri aseptik bir kabin içinde sterilize edilmiş aparatlarla gerçekleştirin.
- 2 L/dak oksijen akış hızının altında %2 izofluran ve %98 oksijen kullanarak fareyi uyuşturun.
NOT: Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için farenin gözlerine az miktarda oftalmik merhem sürün. Tüm ameliyatı iyi havalandırılan bir alanda gerçekleştirin. Hücre enjeksiyonundan önce farenin ayak parmaklarını sıkıştırarak farenin derin anestezi aldığından emin olun. Yanıtlar (örneğin, bir sarsıntı veya seğirme) kalırsa, anestezinin etkili olması için ek süre bekleyin. - Fareyi bir sırtüstü pozisyona yerleştirin ve orta çizgiden dikey olarak gerilmiş her iki üst ekstremiteyi de hareketsiz hale getirin (Şekil 2A).
- Fareyi cerrahi yapışkan bantla karnından aşağı doğru hareketsiz hale getirin. Sert bastırmaktan ve iç organları yerinden oynatmaktan kaçının (Şekil 2B).
NOT: Topografik anatominin korunması (yani, yapışkan bantla sabitleme) esastır, çünkü kalp içi enjeksiyon kör (yani, kalpteki doğru enjeksiyon bölgesi çıplak gözle görülemez). - Toraksın cildini% 70 etanol çubukla dezenfekte edin.
- Orta sternumun en alt ucundaki depresyondaki fare ksifoid sürecini, ön göğüs duvarının ortasından palpe ederek tanımlayın. Manubriumun üst sınırındaki merkezi çöküntüdeki fare juguler çentiğini, ön göğüs duvarının ortasından palpe ederek tanımlayın.
- Ksifoid işlemin en alt noktasını ve juguler çentiği bir işaretleyici kalemle etiketleyin (Şekil 2A). Bu iki işaretin ortasında ve üçüncü interkostal alanda kalbin hemen üzerinde hafifçe sağa (hayvanın solunda) üçüncü bir işaret yapın.
NOT: Enjeksiyon bölgesi orta hattın 1-2 mm solundadır ve enjeksiyon noktası farenin üçüncü ve dördüncü kaburgaları arasındadır (Şekil 2A). - Hücre süspansiyonunun 200 μL'sini 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.
NOT: Kanın titreştiğinden emin olmak için şırıngada Şekil 2C'de gösterildiği gibi bir hava kabarcığı bulundurun. Hücre süspansiyonu, yüklemeden önce iyice karıştırılmalıdır. - Enjeksiyon bölgesinden dikey olarak 26 G'lık bir iğne yerleştirin (Şekil 2D).
- Şırıngayı masanın üzerinde sabit tutan elinizi tutun veya sabit tutmak için diğer elinizi kullanın. Şırınganın uzun ekseninin enjeksiyon bölgesine dik olduğundan emin olun ve şırıngayı deri altından yaklaşık 2 mm yerleştirin.
- Parlak kırmızı kan pulsasyonu, iğne ucu sol ventriküle doğru şekilde yerleştirildiğinde iğne göbeğinde ve / veya hücre süspansiyonunda görülebilir. Kan atışı görünmezse, iğne ucu kalpte değildir. İğneyi geri çekin ve değiştirin (iğnenin içindeki kanın pıhtılaşmasının kan nabzını durdurması durumunda). İğneyi bir kez daha yerleştirin.
- Hücreleri enjekte edin. Hücre süspansiyonunu (100 μL) 40-60 sn üzerinde çok yavaş bir şekilde enjekte edin ve şırıngayı tutan eli her zaman sabit tutun.
NOT: Şırıngadaki hücre süspansiyonunu yakından takip edin ve şırınganın içindeki hava kabarcığını kalbe enjekte etmeyin. - İğne geri çekildiğinde hemostazı sağlamak için enjeksiyon bölgesine 15 sn boyunca kuru bir pamuklu çubukla basınç uygulayın.
- Fareyi temiz kafese geri döndürün ve anesteziden tamamen iyileşene kadar hayvanı izleyin.
- Kanser hücrelerinin sistemik dolaşıma girdiğinden emin olmak için fareyi enjeksiyondan sonraki 24 saat içinde in vivo biyolüminesans sistemi ile görüntüleyin.
NOT: Doğru şekilde enjekte edilen kanser hücreleri, vücudun her yerinde görülebilen biyolüminesans sinyali ile görülen sol kalp ventrikülü yoluyla arteriyel dolaşıma girer (örneğin, bkz. Şekil 3A). - İn vivo biyolüminesans görüntüleme gerçekleştirin.
- Cihazı ve bilgisayarı açın. Cihazdaki ve bilgisayardaki güç göstergesi aydınlandığında yazılımı açın ve ardından Görüntü Yakalama penceresini açın.
- Aygıt bölmesinde bilgisayara bağlı in vivo görüntüleme sistemini tanımlayın. Görüntülenecek fareyi sırtüstü pozisyonda görüntüleme odasına yerleştirin. Ardından görüntüleme odasının kapısını kapatın.
- Görüntü Alma penceresinde sağlanan Ayar bölmesinde parametreleri ayarlayın.
- Görüntüleri netleştirmek için parametreleri Lens > Zoom > 1x, Lens > Focus > 108 ve Lens > Iris > F 2.8 ile ayarlayın.
- Çekim kanalını Filtre ve Işık: Filtre ve Işık > Filtre > Lüminesans, Filtre ve Işık > Işık > KAPALI ve Filtre ve Işık > Işık Yoğunluğu > Orta olarak ayarlayın.
- Çekilecek görüntünün türünü ayarlayın: Görüntüleme > Türü > Tek Kare, Görüntüleme > Pozlama Süresi > 500 ms, HDR Modu > Görüntüleme > Düşük Kazanç Modu. Görüntüyü elde etmek için Al düğmesine tıklayın.
- Metastatik kanser büyümesini in vivo biyolüminesans ile görselleştirin.
NOT: Görselleştirmenin her zaman noktasında, intraperitoneal olarak 20 g lusiferin substratının 200 μL'sini 20 g'lık bir fareye (150 mg / kg) enjekte edin ve anesteziden önce 15 dakika bekleyin (bir indüksiyon odasında% 98 oksijen ile karıştırılmış% 2 izofluran). Fareyi biyolüminesans görüntüleme sistemi platformuna yerleştirin. Anesteziyi% 2 izofluran içeren bir burun maskesi ile koruyun.
3. Patolojik araştırma
- Hücre enjeksiyonundan dört hafta sonra, fareyi CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile feda edin.
- Fareyi sırtüstü pozisyonda hareketsiz hale getirin. Karın ve torakstaki tüm organları kanserli lezyonlar ve / veya patolojik değişiklikler açısından ortaya çıkarmak ve büyük ölçüde incelemek için cerrahi makasla karından toraksa dikey bir kesi (yaklaşık 6 cm) yapın.
NOT: Bir intra-kardiyak kanser hücresi enjeksiyon çalışması için, kalbe bitişik mediastendeki kanser lezyonları, yanlış enjekte edilmiş kanser hücrelerini (sol kardiyak ventriküle enjekte edilmeyen hücreler) önermektedir; Bu nedenle, bu fareler nihai veri koleksiyonuna dahil edilmez. - Metastatik tümörleri makasla tüketin. V = 1/2 × a × b2 formülünü kullanarak tümör hacmini (V) hesaplamak için kumpaslar kullanarak tümörün uzun çaplarını (a) ve kısa çaplarını (b) ölçün ve tümörü elektronik bir ölçek kullanarak tartın.
- Tümör dokularını% 10 formalin çözeltisine sabitleyin ve ardından parafine gömün. Alternatif olarak, tümörleri sıvı azot içinde tutturun-dondurun.
- Metastatik lezyonlarla kemikleri (arka bacaklarda, omurlarda ve/veya kaburgalarda) eksize edin. Her farenin örneğini, cildi ve kasları çıkardıktan sonra 24 saat boyunca 20 mL% 10 formalin çözeltisi içeren 50 mL'lik bir tüpe sabitleyin, ardından sık tampon değişimi ile (her 3 günde bir) % 10 EDTA çözeltisinde 14 gün boyunca dekalsifikasyon yapın.
- Numuneyi parafine gömün ve rutin histolojik inceleme için örnekleri kesitleyin16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyolüminesans görüntüleme, intrakardiyak enjeksiyon modeli için metastatik lezyon gelişiminin izlenmesinde muazzam avantajlar sunmaktadır. Kanser hücresi enjeksiyonundan kısa bir süre sonra (24 saat içinde), genel dolaşıma giren kanser hücrelerini görselleştirmek için biyolüminesans görüntüleme kullanıldı (Şekil 3A). Vücudun her yerinde belirgin biyolüminesans sinyali, kanser hücreleri arteriyel dolaşıma düzgün bir şekilde enjekte edildiğinde görülecektir. Sadece enjeksiyon bölgesinde (kalp) biyolüminesans sinyalleri gösteren farelerden elde edilen veriler, nihai veri koleksiyonunun dışında tutulmalıdır. Hücre enjeksiyonundan 2 hafta sonra arka ekstremitelerde metastatik lezyonlar gözlendi (Şekil 3B-D). Zaman ilerledikçe, metastatik lezyonlar büyüdü ve sternum, kaburgalar ve mandibula dahil olmak üzere diğer bölgelerde ortaya çıktı.
X-ışını görüntülerinde kemikteki metastatik lezyonları temsil eden kemik yıkımı görüldü (Şekil 4A). Mikro-BT taraması ile kemik yıkımı da tespit edildi. Mikro-BT taraması, 3Dcalc, koni rekonstrüksiyonu ve bir model görselleştirme yazılımı uygulaması ile ilişkili bir mikro-BT (μCT80) kullanılarak 3D modunda gerçekleştirildi. 3B modeli oluşturmak için bitmap verilerinin yeniden yapılandırılması elde edildi. Proksimal tibiadaki kemik yıkımının temsili bir mikro-BT görüntüsü Şekil 4B'de gösterilmiştir. Metastatik lezyonlar parafin gömülü dokularda H&E boyaması ile doğrulandı (Şekil 4C).
Resim 1: Cerrahi aparat. 1 mL şırınga. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Prostat kanseri hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu . (A) Panel juguler çentik, ksifoid süreç, göğüs kafesi (alt kenar boşluğu) ve orta hattı göstermektedir. Enjeksiyon bölgesi, ksifoid işlemden ve juguler çentikten eşit uzaklıktadır. (B) Enjeksiyon sırasında fare hareketini önlemek için karın boyunca yatay olarak cerrahi bant kullanılır. (C) Hücre süspansiyonu ve bir hava kabarcığının varlığı ile yüklü bir şırınga. Hava kabarcığı kan nabzını görselleştirmeye yardımcı olur. (D) İğne, enjeksiyon bölgesinden dikey olarak sokulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İn vivo biyolüminesans görüntüleme sistemi ile intrakardiyak enjeksiyon modelinin doğrulanması. (A) Sol kalp ventrikülüne lusiferaz etiketli PC-3 hücreleri (1 × 106 hücre) enjekte edildikten 24 saat sonra bir erkek atimik farenin in vivo biyolüminesans görüntülemesi. Sistemik dolaşıma doğru enjekte edilen kanser hücreleri, tüm vücuttan salınan biyolüminesans sinyali ile görülür. (B-D) Progresif metastaz gelişimi gösteren temsili bir farenin biyolüminesans görüntüleri. (B) Enjeksiyondan 2 hafta sonra prostat kanseri hücrelerini gösteren bir görüntü. (C) Enjeksiyondan 3 hafta sonra prostat kanseri hücrelerini gösteren bir görüntü. (D) Enjeksiyondan 4 hafta sonra prostat kanseri hücrelerini gösteren bir görüntü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Prostat kanseri hücresi kaynaklı kemik metastazlarının farklı tespit yöntemleri. (A) Temsili bir röntgen görüntüsü; Kırmızı ok, proksimal tibiada kemik yıkımını gösterir. (B) Tibia'nın temsili bir mikro-BT görüntüsü. (C) Prostat kanseri hücrelerinin kemik metastazını gösteren H&E görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemik metastazı oluşturmak için insan prostat kanseri hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu, prostat kanseri kemik metastazının fonksiyonlarını ve mekanizmalarını araştırmak ve terapötik etkinliği değerlendirmek için ideal bir fare modelidir. Çalışmalar, kemik hasarının büyük olasılıkla proksimal tibia ve distal femur17'de meydana geldiğini ve bunun da yüksek vaskülarizasyon ve metabolik aktivitelerinden kaynaklanabileceğini göstermiştir.
Kemik metastazı meme kanseri hastalarında sık görülen metastatik bir lezyon olduğundan, meme kanseri hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu ile üretilen kemik metastazı modeli meme kanseri ile ilgili çalışmalarda da yaygın olarak kullanılmaktadır18,19. Bu nedenle, mevcut çalışma, meme ve prostat kanseri hücreleri ile intrakardiyak enjeksiyonla üretilen bir kemik metastazı modelinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Tutarlı tümör oluşumu için, bazı önemli hususlar vardır. Hücreler, kültürden ayrıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede enjekte edilmelidir. Fareler, kanser hücresi enjeksiyonundan sonra deney gruplarına randomize edilmelidir. Enjeksiyon hacmi tutarlı olmalı ve aynı kişi aynı tekniği kullanarak tüm farelere kanser hücreleri enjekte etmelidir.
Tüm prosedür birkaç kritik adım içerir. Enjeksiyon bölgesi doğru konumlandırılmışsa, enjeksiyon sırasında nabızlı kan gözlenmelidir. Şırıngayı tutan elin stabilitesini kaybetmesi ve şırınga pistonunu ilerletirken iğne pozisyonunda değişiklik olması potansiyel problemlerdir. İçinde renkli bir göbek bulunan bir şırınga, kan nabzının kolayca görülmesini sağlar. İğneyi yerleştirirken iğne göbeğinde hava kabarcıkları belirirse (akciğerlere yanlış yerleştirildiğini gösterir), iğne çıkarılmalı ve yer değiştirdikten sonra tekrar yerleştirilmelidir. İğne göbeğinde kırmızı kan nabzı yoksa, ancak enjekte eden kişi enjeksiyon bölgesinin doğru olduğundan eminse, kardiyak ventriküldeki enjeksiyonu doğrulamak için şırınga pistonunu hafifçe çekin. Kanser hücresi enjeksiyonundan 2-3 hafta sonra metastaz olmaması yanlış enjeksiyonu gösterir. Enjeksiyondan sonraki 24 saat içinde biyolüminesans görüntüleme ile tüm vücuttaki kanser hücresi dolaşımını doğrulayın20. Biyolüminesans sinyalizasyonu, kanser hücrelerinin kardiyak ventriküle doğru bir şekilde enjekte edilmesi durumunda vücutta görülebilir. Ayrıca, metastatik tümörlerin metastatik hızı, lokalizasyonu ve sayısı farklı hücre hatlarında farklılık gösterebilir 8,21.
Ameliyattan sonra fareler düzenli olarak kontrol edilmelidir. Ameliyat ve anestezik maruziyet nedeniyle, fareler önemli sıkıntılar yaşayabilir veya hatta ölebilir. Bu nedenle, ameliyattan sonraki ilk hafta kritiktir ve fareler dikkatle izlenmelidir. Bir kemik metastazı deneyi boyunca, fareler aktivite seviyelerindeki, hareketlilikteki ve kaşeksi başlangıcındaki değişiklikler için günlük olarak izlenmelidir (farelerde kilo kaybı, kas atrofisi ve zayıflığı, kemerli görünüm ve uyuşukluk ile karakterize paraneoplastik bir sendrom22,23). Fareler, vücut ağırlıklarının% 10-20'si kaybedildiğinde ötenazi yapılmalıdır; tümör ilerlemesi hareketliliği bozar (örneğin, uzun kemik kırığı, baş eğimi, parapleji); veya fareler solunum sıkıntısı içinde görünüyor24.
Bu modelin avantajı, kemikte tespit edilen kanser hücrelerinin "toprağı tohumlamış" olmasıdır 25, böylece yayılmış kanser hücrelerinin mikro-metastaz oluşumunun daha doğal ilerlemesini çoğaltmaktadır. Bu modelin ayrıca birkaç sınırlaması vardır. Bu, immün yetmezlikli fareleri kullanan bir ksenogreft kanseri modelidir. Bu model, kemik metastazı mikro ortamında kanser hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için yararlı değildir. Modelleme sırasında farelerin yaklaşık% 30'unun öleceği tahmin edilmektedir; Bu nedenle, uygulama model geliştirmenin başarı oranını büyük ölçüde artıracaktır. Ayrıca, metastaz lezyonu beyinde, akciğerlerde ve böbreklerde de oluşabilir; Çoklu metastaz oluşumu kemik metastaz mekanizmalarının incelenmesine müdahale eder 9,26,27,28. Kemik metastazı oranı intra-kardiyak enjeksiyon ile ortotopik enjeksiyona göre çok daha yüksek olmasına rağmen, intrakardiyak enjeksiyon tekniği kemik metastaz oranını %100 yerine %75 civarında göstermektedir9,14. Daha düşük verimlilik, enjekte edilen kanser hücrelerinin kan dolaşımına girememesi veya iğnenin kalbi veya akciğeri delmesi nedeniyle kalp enjeksiyonu sırasında alıcı farenin ölümü olabilir.
Bu sınırlamalara rağmen, prostat kanseri kemik metastazının bu yerleşik fare modelinin, kemik ve kanser çapraz konuşmasını incelemek ve kanser ilerlemesini önlemek ve metastaza bağlı kemik yıkımı döngüsünü bozmak için potansiyel terapötikleri değerlendirmek için mükemmel bir araç olduğu kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar birbiriyle çelişen finansal çıkarlar olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2018YFC1704300 ve 2020YFE0201600), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408), Şangay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi (2021LK047) bütçesi dahilindeki araştırma projeleri ve Şangay İşbirliği İnovasyon Merkezi Hastane TCM Hazırlığı Endüstriyel Dönüşüm Merkezi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes and needles | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | The cells were injected into the ventricles of mice |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | Equipment for anesthetizing mice |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | For counting cells |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | Male | 6-8 week old, male mice |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | |
| EDTA solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1105 | For decalcification of bone tissure |
| F-12 medium | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 21700075, GIBCO | Cell culture medium |
| Formalin solution | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | BL539A | For fixing the specimen of each mouse |
| Isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | For anesthesia |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027, Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| PC-3 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | TCHu 158 | Prostate cancer cell line |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | Wash the human osteosarcoma cells |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | For detaching the cells |
| Vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid for transfection |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | For obtaining x-ray images to detect tumor growth |
| μCT80 | Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd | Scanco Medical AG,Switzerland | For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction, and μCT Ray V3.4A model visualization software. |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, R. E.
- Macedo, F., et al.
- Rea, D., et al. Mouse models in prostate cancer translational research: From xenograft to PDX. BioMed Research International. 2016, 9750795 (2016).
- Zhang, Y., et al. Real-time GFP intravital imaging of the differences in cellular and angiogenic behavior of subcutaneous and orthotopic nude-mouse models of human PC-3 prostate cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (11), 2546-2551 (2016).
- Stephenson, R. A., et al. Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice. Journal of the National Cancer Institute. 84 (12), 951-957 (1992).
- Simmons, J. K., et al.
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Research: BCR. 7 (4), 444-454 (2005).
- Corey, E., et al. Establishment and characterization of osseous prostate cancer models: intra-tibial injection of human prostate cancer cells. The Prostate. 52 (1), 20-33 (2002).
- Andersen, C., Bagi, C. M., Adams, S. W. Intra-tibial injection of human prostate cancer cell line CWR22 elicits osteoblastic response in immunodeficient rats. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 3 (2), 148-155 (2003).
- Sudhan, D. R., Pampo, C., Rice, L., Siemann, D. W. Cathepsin L inactivation leads to multimodal inhibition of prostate cancer cell dissemination in a preclinical bone metastasis model. International Journal of Cancer. 138 (11), 2665-2677 (2016).
- Jinnah, A. H., Zacks, B. C., Gwam, C. U., Kerr, B. A. Emerging and established models of bone metastasis. Cancers. 10 (6), 176 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo. The Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Research. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Brylka, L., et al. Spine Metastases in immunocompromised mice after intracardiac injection of MDA-MB-231-SCP2 breast cancer cells. Cancers. 14 (3), 556 (2022).
- Rahman, M. M., Veigas, J. M., Williams, P. J., Fernandes, G. DHA is a more potent inhibitor of breast cancer metastasis to bone and related osteolysis than EPA. Breast Cancer Research and Treatment. 141 (3), 341-352 (2013).
- Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 14, Unit 14.15 (2010).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Fearon, K. C., Glass, D. J., Guttridge, D. C. Cancer cachexia: mediators, signaling, and metabolic pathways. Cell Metabolism. 16 (2), 153-166 (2012).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21 (11), 1262-1271 (2015).
- Talbot, S. R., et al. Defining body-weight reduction as a humane endpoint: a critical appraisal. Laboratory Animals. 54 (1), 99-110 (2020).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Yin, J. J., et al. TGF-beta signaling blockade inhibits PTHrP secretion by breast cancer cells and bone metastases development. The Journal of Clinical Investigation. 103 (2), 197-206 (1999).
- Schneider, A., et al. turnover mediates preferential localization of prostate cancer in the skeleton. Endocrinology. 146 (4), 1727-1736 (2005).
- Padalecki, S. S., et al. Chromosome 18 suppresses prostate cancer metastases. Urologic Oncology. 21 (5), 366-373 (2003).
