Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekylebilleddannelse af lateral mobilitet og ionkanalaktivitet i lipiddobbeltlag ved hjælp af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64970
Automatic Translation
1, 1
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man bruger TIRF-mikroskopi til at spore individuelle ionkanaler og bestemme deres aktivitet i understøttede lipidmembraner og derved definere samspillet mellem lateral membranbevægelse og kanalfunktion. Den beskriver, hvordan man forbereder membranerne, registrerer dataene og analyserer resultaterne.

Abstract

Højopløsningsbilleddannelsesteknikker har vist, at mange ionkanaler ikke er statiske, men underlagt meget dynamiske processer, herunder forbigående forening af poredannende og hjælpeunderenheder, lateral diffusion og klyngedannelse med andre proteiner. Imidlertid er forholdet mellem lateral diffusion og funktion dårligt forstået. For at nærme os dette problem beskriver vi, hvordan lateral mobilitet og aktivitet af individuelle kanaler i understøttede lipidmembraner kan overvåges og korreleres ved hjælp af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Membraner fremstilles på et ultratyndt hydrogelsubstrat ved hjælp af dråbegrænsefladen dobbeltlag (DIB) teknik. Sammenlignet med andre typer modelmembraner har disse membraner den fordel, at de er mekanisk robuste og egnede til meget følsomme analyseteknikker. Denne protokol måler Ca 2+ ionflux gennem enkeltkanaler ved at observere fluorescensemissionen af et Ca2+-følsomt farvestof tæt på membranen. I modsætning til klassiske enkeltmolekylesporingsmetoder kræves der ingen fluorescerende fusionsproteiner eller etiketter, som kan forstyrre lateral bevægelse og funktion i membranen. Mulige ændringer i ionflux forbundet med konformationelle ændringer af proteinet skyldes kun proteinets laterale bevægelse i membranen. Repræsentative resultater vises ved hjælp af mitokondrieproteintranslokationskanalen TOM-CC og bakteriekanalen OmpF. I modsætning til OmpF er gatingen af TOM-CC meget følsom over for molekylær indeslutning og arten af lateral diffusion. Derfor er understøttede dråbe-interface dobbeltlag et kraftfuldt værktøj til at karakterisere forbindelsen mellem lateral diffusion og funktionen af ionkanaler.

Introduction

Denne protokol har til formål at beskrive, hvordan man kan studere sammenhængen mellem membranmobilitet og ionkanalpermeabilitet af membranproteiner i polymerunderstøttede dråbegrænseflade dobbeltlagsmembraner (DIB) 1,2,3.

Den nuværende teknik supplerer et imponerende udvalg af avancerede optiske og overfladeanalytiske værktøjer, såsom enkeltpartikelsporing 4,5, fluorescenskorrelationsspektroskopi6,7 og højhastighedsatomkraftmikroskopi 8,9,10. Disse giver værdifuld indsigt i den dynamiske sammensætning og struktur af membraner, der påvirker membranbaserede reaktioner11,12,13. Mens bevægelse og lateral diffusion af proteiner afhænger af den lokale tæthed af proteiner i membranen, kan individuelle proteinmolekyler også fanges i lipidflåder14 og ved protein-proteininteraktioner15,16. Afhængigt af proteindomænerne, der stikker ud fra membranen ind i det ekstracellulære miljø eller cytosolen, kan proteinmobiliteten variere fra meget mobil til fuldstændig immobil. På grund af membranens kompleksitet og dens perifere strukturer er det imidlertid ofte vanskeligt at dechiffrere samspillet mellem arten af lateral mobilitet og proteinfunktion17.

DIB-membraner har vist sig at være en effektiv platform til biofysiske enkeltmolekyleanalyser af membranproteiner 18,19,20,21,22. De dannes ved lipid selvmontering gennem kontakt mellem vandige dråber og hydrogelunderstøttede substrater i en lipid / oliefase. I lighed med de almindeligt anvendte understøttede lipiddobbeltlag (SLB'er)1,23,24,25 tillader DIB'er lokal indstilling af lateral mobilitet ved midlertidig eller permanent binding af proteiner til polymermatrixen, når de funktionaliseres med passende ligander17. Sidstnævnte kan tjene som et modelsystem for biokemiske processer i cellemembraner med en heterogen proteinfordeling10.

Den eksperimentelle tilgang, der beskrives her, er afhængig af fluorescensen af Ca 2+-følsomme farvestoffer til måling af Ca 2+ ionfluxen gennem individuelle kanaler tæt på membranen 2,22 ved hjælp af TIRF-mikroskopi. Denne optiske fremgangsmåde begrænser prøvens belysning til en afstand tæt på membranen, hvilket på grund af de fysiske egenskaber af det evanescent excitationslys fører til en signifikant reduktion af fluorescensbaggrunden. Sidstnævnte er en forudsætning, hvis der kræves høj rumlig og tidsmæssig opløsning til påvisning af enkeltmolekyler. I modsætning til klassiske elektrofysiologiske metoder26,27 kræves der ingen membranspændinger for at studere ionflux gennem individuelle kanaler. Desuden kræver metoden ikke mærkning med fluorescerende farvestoffer eller molekyler, der kan forstyrre kanalernes laterale bevægelse i membranen.

Metoden er især nyttig til at studere proteinkanaler indlejret i membranen på enkeltmolekyleniveau uden brug af klassisk elektrofysiologi. Ved hjælp af mitokondrieproteinledende kanal TOM-CC fra Neurospora crassa28,29,30 og OmpF, som understøtter diffusion af små hydrofile molekyler over den ydre membran af Escherichia coli17,31, illustrerer vi, hvordan membranmobiliteten og kanalaktiviteterne af de to proteiner kan studeres og korreleres. Vi foreslår, at denne tilgang, selvom den er optimeret til TOM-CC og OmpF, let kan anvendes på andre proteinkanaler.

Protocol

1. Proteinproduktion

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver proceduren for isolering af OmpF fra Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, som mangler LamB og OmpC, og TOM-kernekompleks fra Neurospora crassa (figur 1)28,29. Sidstnævnte kræver mitokondrier isoleret fra en N. crassa-stamme 28, der indeholder en 6xHis-mærket form af TOM-underenheden Tom22 (figur 1A), som kan isoleres som beskrevet28. Følgende protokoller giver normalt 1-2 mg N. crassa TOM-CC og 10 mg E. coli OmpF. Hvis mængden skal justeres, er det vigtigt, at forholdet mellem protein og vaskemiddel opretholdes nøjagtigt. Medmindre andet er angivet, skal alle trin udføres ved 4 °C.

  1. Isolering af TOM-kernekompleks
    1. Opløseliggøre oprensede N. crassa-mitokondrier (2 g protein) opnået ved differentiel sedimentering fra ca. 1,5 kg (vådvægt) hyfer, ifølge Bausewein et al.30, ved en proteinkoncentration på 10 mg/ml i 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1% (w/v) DDM, 20% (v/v) glycerol, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) i 30 minutter ved 4 °C.
      FORSIGTIG: PMSF er giftigt. Brug passende personlige værnemidler.
    2. De opløselige mitokondrier overføres til ultracentrifugeglas, og de ikke-opløselige membraner adskilles fra opløselige membranproteiner ved ultracentrifugering ved 130.000 x g i 40 minutter ved 4 °C og filtrering med filterpapir af standardkvalitet.
    3. En færdigpakket Ni-NTA-kolonne (volumen på 5 ml) afbalanceres med ca. 5 kolonnevolumener (CV) buffer A1 (tabel 1) ved hjælp af et automatiseret proteinrensningssystem. Kør Ni-NTA-kolonnen med en konstant strømningshastighed på 1 ml/min under alle trin. Brug en kolonne med lavere volumen (1 ml), hvis proteinerne er blevet isoleret fra mindre end 2 g mitokondrier.
    4. Den opløselige proteinprøve lægges på Ni-NTA-kolonnen med en strømningshastighed på 1 ml/min.
    5. Ni-NTA-kolonnen vaskes med 5 CV buffer A1 (tabel 1) for at fjerne ubundne proteiner.
    6. Eluer His-mærket TOM-CC med 30% buffer A2 (tabel 1; 300 mM imidazol) og opsaml proteintoppen, som den vises i 280 nm kromatogrammet (figur 1B).
    7. For yderligere rensning af TOM-CC afbalanceres den færdigpakkede anionbytterkolonne (1 ml) med 5 CV hver af buffer B1, B2 og B1 (tabel 1) ved hjælp af det automatiserede proteinrensningssystem. Kør anionudvekslingskolonnen med en konstant strømningshastighed på 1 ml / min under alle trin.
    8. Læg TOM-CC-spidsfraktionen (trin 1.1.6) på anionudvekslingskolonnen (strømningshastighed på 1 ml / min).
    9. De ubundne proteiner fjernes ved at vaske kolonnen med 5 CV buffer B1 (tabel 1) og en lineær saltgradient på 0%-20% buffer B2 (tabel 1).
    10. Eluer TOM-CC med en lineær saltgradient på 20% -35% buffer B2, og opsaml proteintopfraktionen, som den vises i 280 nm-kromatogrammet (figur 1C).
    11. Vurder prøvens renhed ved hjælp af SDS-PAGE (figur 1D), og bestem proteinkoncentrationen ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt proteinassay i henhold til producentens protokol (se materialetabel).
    12. Proteinprøverne fryses ned i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C indtil videre brug.
      FORSIGTIG: Flydende nitrogen skal håndteres i godt ventilerede områder. Brug passende personlige værnemidler.
       
  2. Isolering af OmpF
    1. E. coli-stammen BE BL21(DE3) omp6, der mangler LamB og OmpC32, genvindes fra en frossen glycerolstamme under sterile forhold, og der strides på en Luria-Bertani (LB) agarplade (tabel 2). For at gøre dette skal du gradvist sprede prøven jævnt over hele pladen.
    2. Prøven lader den trække ned i agaren i 5 minutter, inden pladen vendes på hovedet med låget lukket og udruges natten over ved 37 °C.
    3. Vælg en enkelt E. coli-koloni , pod 7,5 ml LB-medium (tabel 2) med denne ene koloni ved hjælp af en steril tandstikker, og lad den vokse natten over (14 timer) med omrøring (170 o / min) ved 37 ° C.
    4. 2 x 1 ml E. coli-celler med sterile pipetter overføres til 2 x 500 ml LB-medium (tabel 2), og lad dem vokse natten over (~14 timer) ved 37 °C med omrøring (~170 omdr./min.) i en ryster.
    5. Cellerne høstes ved centrifugering ved 5.000 x g i 20 minutter ved 4 °C, pellet fryses ned i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C indtil videre brug.
      BEMÆRK: Cellepillens våde vægt er typisk 5 g pr. 1 liter kultur. På dette tidspunkt kan protokollen sættes på pause.
    6. Cellerne (2 g) optøs og resuspenderes i 20 ml lysisbuffer C1 (tabel 2), og suspensionen ledes tre gange ved 1.000 psi gennem et forkølet (4 °C) højtrykscelleforstyrrelsessystem med et maksimalt prøvevolumen på 35 ml i henhold til producentens anvisninger.
      FORSIGTIG: Brug af en fransk presse kan føre til alvorlige kvæstelser. Overskrid aldrig trykgrænsen for den anvendte celle. Brug passende personlige værnemidler.
    7. Ubrudte celler fjernes fra lysatet ved centrifugering ved 4 000 x g i 15 minutter, og supernatanten opsamles.
    8. Membranerne opsamles ved ultracentrifugering ved 100.000 x g i 1 time.
    9. Membranpelleten resuspenderes i 10 ml buffer C2 (tabel 2), og blandes med et tilsvarende volumen SDS-buffer C3 (tabel 2) under anvendelse af en kuglelejeglashomogenisator.
      FORSIGTIG: β-mercaptoethanol i buffer C3 er giftigt. Følg alle relevante sikkerhedsforskrifter.
    10. Suspensionen inkuberes i vandbad ved 50 °C i 30 minutter.
    11. Prøven centrifugeres ved 100.000 x g ved 20 °C i 1 time.
    12. Membranpelleten resuspenderes i 10 ml SDS-buffer C4 (tabel 2) ved hjælp af en kuglelejeglashomogenisator, og suspensionen inkuberes i et vandbad ved 37 °C i 30 minutter.
      BEMÆRK: Hvis pellet ikke kan resuspenderes, tilsættes mere SDS-buffer C4 op til et volumen på 20 ml.
    13. Prøven centrifugeres ved 100 000 x g ved 20 °C i 30 minutter, og supernatanten opsamles.
    14. Supernatanten blandes med octylpolyoxyethylen (octyl-POE) til en endelig koncentration af vaske- og rengøringsmidler på 0,5 % (w/v), og prøven dialyseres to gange mod buffer C5 (tabel 2) ved 4 °C i 24 timer. Til dette formål skal du bruge dialyseslanger med en afskæring på 20 kDa i henhold til producentens anvisninger og placere prøven i dialyseslangen eller enheden.
      BEMÆRK: Afskæringen af dialyseslangen skal justeres, hvis proteiner med andre molekylmasser dialyseres.
    15. Vurder prøvens renhed ved SDS-PAGE og bestem proteinkoncentrationen ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt proteinassay i henhold til producentens protokol (materialetabel).
      BEMÆRK: Prøver opvarmet til 95 °C viser monomere OmpF. Prøver, der ikke opvarmes, viser OmpF i sin trimeriske form (figur 1F).
    16. OmpF i alikvoter i flydende nitrogen frysefryses med dialyseret og opbevares ved -20 °C indtil yderligere brug.
      FORSIGTIG: Flydende nitrogen skal håndteres i godt ventilerede områder. Brug passende personlige værnemidler.

2. Optisk enkeltkanaloptagelse af ionkanaler i DIB-membraner

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver proceduren til fremstilling af DIB-membraner i mikrofabrikerede polymethylmethacrylatkamre( PMMA) 2 til overvågning af lateral proteinbevægelse og ionflux gennem enkeltionkanaler17. Dimensionerne og de nøjagtige tegninger til fremstilling af kammeret findes i Lepthin et al.2. Figur 2 giver et overblik over samlingen af PMMA-kammeret2 og dannelsen af DIB-membranerne. Medmindre andet er angivet, udføres alle trin ved stuetemperatur (RT). Figur 3 viser en skematisk repræsentation af en DIB-membran, og hvordan Ca2+ flux gennem et enkeltkanalprotein bruges til at overvåge både bevægelse i membranen og kanalens åbne-lukkede tilstand.

  1. Fremstilling af lipider
    1. Lipidstamopløsningen indeholdende 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (25 mg/ml DPhPC) opløst i chloroform fjernes fra fryseren ved -20 °C og opvarmes til RT. Til dette formål er det generelt tilstrækkeligt at opvarme prøven langsomt i hånden i et par minutter.
      FORSIGTIG: Chloroform er giftigt. Brug passende personlige værnemidler, og udfør alle procedurer, der involverer chloroform under en stinkhætte.
    2. Overfør 380 μL DPhPC-stamopløsning (25 mg/ml DPhPC) til et hætteglas. Undgå pipetter med gummipakninger. Brug i stedet mikroliter glassprøjter med stempel i rustfrit stål.
    3. Efter håndtering af lipidstamopløsningen overlejres lipidstamopløsningen med Ar- ellerN2-gas for at forhindre lipidoxidation. Brug den lavest mulige gasstrøm for at undgå fordampning af det organiske opløsningsmiddel, hvori lipiderne opløses, eller sprøjtning af sprøjt med solvens fra hætteglasset. Sørg for, at lågene på hætteglassene med lipider med organisk solvens er belagt med polytetrafluorethylen (PTFE) på indersiden.
    4. Lipidprøven (trin 2.1.2) tørres under en strøm afN2, og det resterende organiske opløsningsmiddel fjernes fra lipidprøven natten over under vakuum (2,0 mbar) ved hjælp af en oliefri vakuumpumpe.
    5. Opløs lipidfilmen i hexadecan/silikoneolieopløsning ved at tilsætte lige store mængder hexadecan og silikoneolie (500 μL hver) ved hjælp af en mikroliter glassprøjte til en endelig lipidkoncentration på 9,5 mg/ml.
      BEMÆRK: Lipidopløsningen er stabil ved RT i flere uger.
  2. Fremstilling af agarosehydrogel
    1. Der fremstilles ca. 1 ml lavsmeltende agaroseopløsning (0,75 % [w/v]) i dobbeltdeioniseret vand, og der opvarmes til 85 °C i en varmeblok i 20 minutter, der skal anvendes til centrifugering af glasdæksler.
      BEMÆRK: Agaroseopløsningen kan opbevares på RT i flere uger og kan opvarmes flere gange.
    2. Der fremstilles lavsmeltende 2,5 % (w/v) agaroseopløsning i 0,66 MCaCl2 og 8,8 mM HEPES (pH 7,2), og der opvarmes til 85 °C i en varmeblok i 20 minutter. Sørg for, at agaroseen er godt smeltet.
      BEMÆRK: Agaroseopløsningen kan opbevares i flere uger ved RT og kan opvarmes flere gange, ligesom agaroseopløsningen (trin 2.2.1), der anvendes til spinbelægning.
  3. Polymethylmethacrylat (PMMA) kammersamling og dannelse af lipidmonolag ved grænsefladen mellem hydrogelhexadecan/silikoneolie
    1. Placer nogle glasdæksler (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) i en dækselholder i rustfrit stål, og rengør dem i et glasbægerglas i 10 minutter med acetone i en ultralydsrenser. Brug lige nok acetone til at nedsænke dækslerne og dække bægerglasset løst med en glasplade for at skabe et trykfrit, lukket system, der minimerer udslip af dampe under rengøringsprocessen.
      FORSIGTIG: Acetone er et meget brandfarligt opløsningsmiddel med et lavt flammepunkt. Damp/luft-blandinger er eksplosive. Betjen ultralydsrenseren i et godt ventileret område. Brug passende personlige værnemidler og overhold officielle sikkerhedsforanstaltninger (f.eks. Ingen åben ild og ingen gnister).
    2. Skyl glasdækslerne med dobbeltdeioniseret vand og tør dem under en strøm afN2.
      BEMÆRK: Dæksedler, der rengøres på denne måde, kan opbevares i flere uger.
    3. Yderligere rengøres og hydrofiliseres en dæksel i en plasmarenser med ilt (0,5 mbar) i 5 min.
      BEMÆRK: Udfør dette trin umiddelbart før spinbelægning med agaroseopløsning, da den hydrofile effekt af plasmarensning aftager over tid.
    4. Monter en plasmabehandlet dæksel på en spincoater (figur 2, trin 1).
    5. Overtræk dæksedlen med en submikrometer tyk film af agarose ved langsomt at tilsætte 140 μL opvarmet 0,75 % (w/v) lavsmeltende agarose (trin 2.2.1) ved 3.000 o/min i 30 sek. ved hjælp af en 200 μL pipette (figur 2, trin 1).
      BEMÆRK: Agarosefilmens tykkelse kan bestemmes ved atomkraftmikroskopi (AFM), som beskrevet17.
    6. Fastgør straks det spinbelagte dæksel med det tynde lag agarosehydrogel til undersiden af PMMA-kammeret2. Sørg for, at agarosehydrogelen peger opad (figur 2, trin 2).
    7. Fastgør kanterne på dæksedlen til PMMA-mikrobearbejdet enhed med gennemsigtig tape.
    8. PMMA-enheden anbringes på en varmeplade opvarmet til 35 °C (figur 2, trin 3).
    9. Hæld forsigtigt 200 μL 2,5% agaroseopløsning (trin 2.2.2) i kammerets indløb med en pipette (figur 2, trin 3) uden at skabe luftbobler, så den tynde hydrogel, der påføres ved spinbelægning, kan ekvilibrere med bufferen af 2,5% agaroseopløsningen og forblive hydreret. Sørg for, at 2,5% agaroseopløsningen spredes omkring den spinbelagte agarosehydrogel, men ikke over den (figur 3A), hvilket kan undgås ved forsigtigt at trykke PMMA-kammeret på varmepladen.
    10. PMMA-kammerets huller (figur 2, trin 4) dækkes straks med i alt 60 μL lipid/olie-opløsning (trin 2.1.5) for at indlede dannelse af lipidmonolag ved agarose-olie-grænsefladen og for at undgå dehydrering af den spindede agarose i hullerne i PMMA-kammeret. Opbevar apparatet på en kogeplade ved 35 °C i ca. 2 timer.
      BEMÆRK: De cirkulære brønde i PMMA-kammeret har en diameter på 0,5 mm og en dybde på 1,8 mm, ifølge tidligere offentliggjort arbejde2.
  4. Fremstilling af lipidbelagte vandige dråber i hexadecan/silikoneolieopløsning
    1. 20 μL lipidhexadecan/silikoneolieopløsning (trin 2.1.5) anbringes i hver af flere mikrofabrikerede brønde i et dråbeinkubationskammer (figur 2, trin 4). Egnede beholdere til lipidhexadecan/silikoneolieopløsningen er små fordybninger på 40 mm x 30 mm x 3,5 mm i en tynd PMMA-plade2.
    2. Forbered en mikrokapillær glasnål med en åbningsdiameter på 20 μm ved hjælp af en lodret eller vandret mikropipettetrækker (f.eks. bruges til fremstilling af plasterpipetter eller skarpe glaselektroder). Anslå åbningsdiameteren af mikrokapillærglasnålen under et kikkertstereomikroskop ved lav forstørrelse i et zoomområde mellem 7,5x og 35x.
      BEMÆRK: Indstillingerne for forvarmningstilstanden, før glaskapillæret trækkes, opvarmningstilstanden til træk og trækkraften skal bestemmes eksperimentelt på forhånd i henhold til producentens specifikationer for trækanordningen og kapillærtypen.
    3. Mikrokapillærglaskanylen fyldes med 5 μL vandig injektionsopløsning indeholdende 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl og 30 nM TOM-kernekomplekset eller alternativt 20 nM OmpF ved hjælp af en mikrokapillærpipettespids. Brug kun dobbeltdestilleret vand, der tidligere er behandlet med en chelaterende harpiks, der binder multivalente metalioner (Ca2+) til fremstilling af den vandige injektionsopløsning.
    4. Monter mikrokapillærglasnålen med den vandige injektionsopløsning på en piezodrevet nanoinjektor.
    5. 100-200 nL vandige dråber (figur 2, trin 4) indeholdende 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl og 30 nM TOM-kernekompleks (trin 1.1.12) eller alternativt 20 nM OmpF (trin 1.2.16) injiceres i hullerne i dråbeinkubationskammeret fyldt med lipidhexadecan/silikoneolieopløsning (se 2.1.5) ved hjælp af nanoinjektoren. Sørg for, at dråberne ikke rører hinanden ved at placere dem flere millimeter (>10 mm) fra hinanden i brøndene. Ellers, hvis lipidmonolag endnu ikke er dannet ved olie / buffergrænsefladen, vil de fusionere til større dråber.
      BEMÆRK: Hvis der ikke findes klassekapillærer og nanoinjektorer, kan dråberne alternativt fremstilles manuelt med enkeltkanals mikroliterpipetter til volumener mellem 0,1 μL og 0,5 μL som beskrevet2. I dette tilfælde er dråbemængderne imidlertid ikke så nøjagtige.
    6. Der tillades dannelse af et lipidmonolag ved dråbe/olie-grænsefladen i ca. 2 timer ved at holde PMMA- og dråbeinkubationskamrene (figur 2, trin 4) på en varmeplade opvarmet til 35 °C.
  5. Forberedelse og billeddannelse af enkeltionkanaler i DIB-membraner
    1. Manuelt overføres individuelle vandige dråber fra brøndene i dråbeinkubationskammeret under et stereomikroskop til brøndene i PMMA-kammeret (figur 2, trin 5) ved hjælp af en enkeltkanals mikroliterpipette med en 10 μL engangspolypropylenspids. Lad dråberne synke ned på lipidmonolagene dannet ved hydrogel-olie-grænsefladerne i ca. 5 minutter for at danne et lipiddobbeltlag (figur 3) mellem dråberne og agarosehydrogelen.
    2. Monter PMMA-kammeret med DIB-membraner på prøveholderen af et inverteret lysmikroskop, og vurder membrandannelse ved hjælp af et 10x Hoffman-modulationskontrastmål (figur 2, trin 6). DIB-membrandannelse er angivet med en klar hvid ring ved grænsefladen mellem dråben og hydrogelen (figur 4A). DIB-membraner, der er brudt, viser ikke denne ring (figur 4B).
      BEMÆRK: Alternativt kan DIB-membranerne visualiseres ved 10x forstørrelse ved fasekontrast eller differentiel interferenskontrast (DIC) mikroskopi.
    3. Hvis der er dannet DIB-membraner, monteres PMMA-kammeret på prøveholderen af et TIRF-mikroskop (figur 2, trin 7) udstyret med en konventionel lyskilde til epifluorescensbelysning, en 488 nm laser (Pmax = 100 mW) og et baggrundsbelyst elektronmultiplicerende CCD-kamera (512 x 512 pixels; >95% QE) for at opnå en pixelstørrelse på ~ 0,16 μm.
    4. Fokuser kanten af en DIB-membran med et 10x forstørrelsesmål under epifluorescensbelysning med en højintensiv lyskilde ved hjælp af et GFP-filtersæt.
    5. Finfokuser den samme kant af DIB-membranen ved høj forstørrelse med et 100x/N.A. 1,49 apochromat olie TIRF-mål, igen under epifluorescensbelysning, med højintensitetslyskilden ved hjælp af et GFP-filtersæt, der gør det muligt at visualisere svag baggrundsfluorescens af det fluorescerende farvestof Fluo-8 i dråben (figur 4C).
    6. Skift filterindstillingen fra GFP til quad-band TIRF-filtersættet.
    7. Tænd for 488 nm-laseren, og indstil laserens intensitet på objektivlinsen til en værdi mellem 8 mW og 10 mW.
      BEMÆRK: Da der ofte ikke er kvantitative oplysninger om laserintensiteten ved objektivobjektivet, skal laserintensitetsindstillingerne kalibreres på forhånd i separate målinger ved objektivet med en optisk lasereffektmåler udstyret med en fotodiodesensor i henhold til producentens specifikationer.
      FORSIGTIG: For at sikre sikker drift af laseren skal operatøren være opmærksom på de mulige farer ved laserstråling og reglerne for forebyggelse af ulykker.
    8. For at visualisere enkeltionkanaler skal du justere TIRF-vinklen og EMCCD-kameraforstærkningen (f.eks. EM-forstærkningsmultiplikatorindstilling: 285), så åbne ionkanaler i DIB-membranen vises som fluorescerende pletter med høj kontrast på en mørk baggrund (figur 4D-G), og signal-til-baggrunds-forholdet, når det inspiceres visuelt, når et maksimum. Sørg for, at pletterne, der svarer til Ca2+-flux gennem enkelte ionkanaler, forbliver i fokus og har en rund form, med høj intensitet i midten og gradvist faldende mod periferien. Membraner uden kanaler viser kun baggrundsfluorescens (figur 4C).
    9. Før du registrerer de enkelte kanalers bevægelse og åbne lukkede aktivitet over tid, skal du kontrollere, at fluorescerende pletter er i fokus for at sikre, at ionkanalerne er rekonstitueret i DIB-membranerne og bevæger sig sideværts i membranplanet. Hvis dette ikke er tilfældet, kan det indikere, at et fluorescerende molekyle dypper ind og ud af det evanescent felt, der genereres af laseren nær membranen.
    10. Optag en række membranbilleder, der muliggør korrekt sporing af positionen og overvågning af den åbne-lukkede tilstand af de enkelte ionkanaler. For at bestemme typen af lateral mobilitet (f.eks. fri bevægelse vs forbigående forankring [for reference, se16]) og tilstanden af kanalaktivitet (f.eks. åben eller lukket), erhverve tilstrækkeligt lange (f.eks. 30 s til 1 min) og godt samplede baner (f.eks. Billedhastighed på 48 s-1).
      BEMÆRK: Observation af kanaliseret, begrænset eller humlediffusion16 kræver, at prøveudtagningshastigheden er tilstrækkelig hurtig til at måle ubegrænset diffusion inden for begrænsende grænser. Sørg desuden for, at dataprøvetagningstiden er tilstrækkelig lang til at måle overgangen fra ubegrænset til begrænset diffusion (for detaljer, se Jacobson et al.16).
  6. Billed- og databehandling
    BEMÆRK: Open source-billedbehandlingspakker33 eller selvskrevne rutiner17 baseret på kommercielle softwarepakker kan bruges til at analysere den rumlige tidsmæssige dynamik i individuelle ionkanaler i DIB'er. For at kunne korrelere lateral membranmobilitet med ionfluxen gennem de enkelte kanaler bør der ikke anvendes filteralgoritmer.
    1. Korrekt billedtidsserie for blegning ved at anvende standardprocedurer34 ved hjælp af selvskrevne rutiner ved at tilpasse den gennemsnitlige billedintensitet Equation 1 af det fulde billede til Equation 2, hvor t er rammeindekset (tid) og aker tilpasningsparametrene. Ret derefter tidsserien i henhold til Equation 3, hvor I(t) er intensiteten. Alternativt kan du til indledende dataanalyser udføre baggrundskorrektioner ved hjælp af open source-software med implementerede rulleboldalgoritmer33 og en rullende kugleradius, afhængigt af kameraets spot og pixelstørrelse (f.eks. 50 pixels).
    2. Bestem de rumlige positioner og amplituder af et fluorescenspunkt inden for et defineret interesseområde (ROI) (f.eks. 30 x 30 pixels) ved at tilpasse I (t) på et givet tidspunkt t til en todimensionel Gaussisk funktion med plan hældning, der tegner sig for mulige lokale belysningsgradienter i henhold til Equation 4. Her er x = (x, y) ROI med fluorescensintensitetsinformationen, A og σ er amplituden og bredden af Gaussian, pk er parametre, der karakteriserer baggrundsintensiteten af ROI, og μ = (x 0, y 0) definerer Gaussianens position. Ionfluxen gennem en individuel kanal er givet ved parameteren A. Kanalens bane er givet ved x og giver mulighed for at bestemme kanalens laterale mobilitet. Alternativt er det muligt at bestemme positioner og intensiteter for individuelle pletter ved hjælp af open source-platforme33 og plug-ins som beskrevet35,36. Anslå positionsnøjagtigheden37 efter konvertering af EMCCD-kameraudlæsningen til fotontal38.
    3. Fluorescensamplituden A versus tiden og den tilsvarende bane x plottes for at bestemme en mulig korrelation mellem kanaldiffusiviteten og ionfluxen gennem kanalen. Udfør dette med enhver grafiksoftware. I tilfælde af fri lateral kanalbevægelse bestemmes den laterale diffusionskoefficient D ved lineær regression af tidsforsinkelsen τ, og den gennemsnitlige kvadratforskydning af pletterne fra x beregnes i henhold til Equation 5.
      BEMÆRK: Typiske diffusionskoefficienter17 for TOM-CC og OmpF, der bevæger sig frit i DIB-membraner, ligger mellem 0,5 og 1,5 μm2 s-1. Molekyler, hvis diffusionskonstant er mindre end 0,01 mm2·s-1 , defineres som immobiliseret17.

Representative Results

Elektrodefri optisk enkeltkanaloptagelse i realtid afslører samspillet mellem lateral proteinbevægelse og funktionen af individuelle ionkanaler i DIB-membraner. Rekonstitution af mitokondrie-TOM-kernekomplekset (figur 1A) i en DIB-membran (figur 4D) illustrerer en stærk tidsmæssig sammenhæng mellem lateral mobilitet og ionpermeabilitet (figur 5A). TOM-CC-gatingen ser ud til at være følsom over for tilstanden for lateral bevægelse17. Bevægelige kanaler viser Ca2+ flux gennem deres porer og høje fluorescenspunktintensiteter. Fangede, ikke-bevægelige molekyler viser lave og mellemstore fluorescensintensiteter. For den generelle proteinimportpore af mitokondrier TOM-CC afslørede denne enkeltmolekyletilgang en stærk tidsmæssig sammenhæng mellem lateral mobilitet og ionpermeabilitet, hvilket tyder på, at TOM-CC-kanalen har mekanofølsomme egenskaber17. Et lateralt stop af frit bevægelige TOM-CC-molekyler ledsages af en delvis eller fuldstændig lukning af TOM-CC-kanalen. Billeddannelse af DIB-membraner med OmpF (figur 1E og figur 4F), som næsten er fuldt indlejret i membranen, viser ingen stop-and-go-effekter (figur 5B). Tilfældige stop af OmpF er ikke forbundet med en ændring i intensitet og dermed med lukningen af porerne. Baseret på fluorescenssignalerne38 kan positionsnøjagtigheden af de enkelte kanaler estimeres i området mellem 5 og 10 nm. Det skal dog bemærkes, at denne nøjagtighed ikke kan opnås, hvis kanalerne vakler lidt på grund af mobil forankring med agarosehydrogelen, som vist for eksempel for TOM-CC-molekylerne i en mellemtilstand med en rodmiddelforskydning på 120 nm (figur 5A).

Figure 1
Figur 1: Isolering af TOM-CC. (A) Cryo EM-struktur af N. crassa TOM-CC30,39. Mitokondrier fra en N. crassa-stamme indeholdende en Tom22 med et 6xHis tag blev opløseligt i DDM og udsat for Ni-NTA-affinitetskromatografi (B) og anionbytningskromatografi (C). (D) SDS-PAGE af isoleret TOM-CC. E) Krystalstruktur (PDB, 1OPF) og (F) SDS-PAGE af renset E. coli OmpF. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Rutediagram over PMMA-kammersamling. Trin 1: En glasdæksel er spin-coated med en agarosehydrogel. Trin 2: Den spin-coatede coverslip monteres i et specialfremstillet PMMA-mikroskopikammer. Trin 3: Yderligere lavsmelteagarose tilsættes i PMMA-kammerets indløbsport på en 35 °C kogeplade. Trin 4: Lipidmonolag dannes omkring vandige dråber ved en buffer / olie-grænseflade (venstre) og på agarosehydrogel / oliegrænsefladen (højre). Trin 5: Individuelle vandige dråber pipetteres ind i brøndene i PMMA-kammeret for at danne et lipiddobbeltlag ved kontakt mellem de to lipidmonolag. Trin 6: Dannelsen af DIB-membranerne valideres ved Hofmann-modulationskontrastmikroskopi. Trin 7: Billeder af udvalgte områder af DIB-membranerne med indsatte ionkanaler erhverves ved TIRF-mikroskopi. Grøn: 0,75% agarose; gul: 2,5% agarose indeholdende Ca2+ ioner; magenta: lipid / oliefase; mørkeblå: vandig dråbebuffer indeholdende Ca2+-følsomt farvestof og protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentel opsætning. (A) Skematisk gengivelse af en DIB-membran i en PMMA-brønd. Dobbeltlaget hviler på en ultratynd 0,75% agarosefilm for at muliggøre TIRF-billeddannelse af Ca 2+-flux gennem en ionkanal over tid ved hjælp af et Ca 2+-følsomt fluorescensfarvestof (Fluo-8) i trans. (B) Ca2+-fluxen styres udelukkende af det osmotiske tryk fra cis til trans. Dette muliggør både bestemmelse af positionen i membranen og kanalens åbne-lukkede tilstand. Kanalen vist her er den proteinledende kanal TOM-CC af N. crassa mitokondrier30. (C) Bane for en enkelt TOM-CC-kanal. Grøn: bevægelig kanal; gul: ikke-bevægelig kanal. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Billeddannelse af TOM-CC og OmpF i DIB-membraner . (A) DIB-membran afbildet ved Hoffmann-modulationskontrastmikroskopi, der viser dobbeltlagskontaktområdet mellem hydrogelen og dråben. (B) Brudt DIB-membran afbildet som i (A). Pil, kant af PMMA-kammer. (C) DIB-membran afbildet ved TIRF-mikroskopi uden proteinkanaler. (D) DIB-membran med rekonstitueret TOM-CC, afbildet ved TIRF-mikroskopi. De hvide firkanter markerer pletter med høj (SH), mellemliggende (SI) og lav (SL) intensitet. (E) Tilpasning af fluorescensintensitetsprofilen for de tre pletter markeret i (A) til todimensionale gaussiske funktioner afslører placeringen af individuelle TOM-CC'er og Ca2+ -fluxen gennem kanalen. (F) DIB-membran med rekonstitueret OmpF. G) Gaussisk pasning af den fluorescerende plet markeret med (F). I modsætning til det to-pore β-tønde proteinkompleks TOM-CC afslører OmpF med tre porer β tønde kun en permeabilitetstilstand. Pixelstørrelse, 0,16 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Kanalaktivitet korrelerer med lateral mobilitet af TOM-CC. (A) Det fluorescerende amplitudespor (øverst) og tilsvarende bane (nederst) af TOM-CC indikerer, at TOM-CC's åbne lukkede kanalaktivitet korrelerer med kompleksets laterale membranmobilitet. Banen viser tre permeabilitetstilstande. Grøn: helt åben tilstand; gul: mellemliggende permeabilitetstilstand; rød: lukket kanaltilstand; rød stjerne: TOM-CC i mellemtilstanden vakler omkring sin middelposition med ca. ±60 nm. Positionsnøjagtighederne37 baseret på fluorescenssignalerne i helt åbne og mellemliggende tilstande ligger mellem 5 nm og 10 nm. B) Fluorescerende amplitudespor (øverst) og tilsvarende bane (nederst) for OmpF. OmpF afslører kun ét intensitetsniveau, uanset om det er i bevægelse eller fanget. Banesegmenterne svarende til tidsperioderne for fangede molekyler er markeret med gråt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Buffer  Reagenskoncentrationer Lydstyrke
A1* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (w/v) n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 10 % (v/v) glycerol, 300 mM NaCl og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) 100 ml
A2* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) DDM, 10% (v/v) glycerol, 1 M imidazol og 1 mM PMSF 100 ml
B1* 20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 2% (v/v) dimethylsulfoxid (DMSO) 100 ml
B2* 20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimethylsulfoxid (DMSO) 100 ml
* Afgass og passér gennem et 0,22 μm filter før brug.

Tabel 1: Bufferopløsninger til TOM-CC-isolering.

Buffer  Reagenskoncentrationer Lydstyrke
LB* 1% (w/v) trypton, 1% (w/v) NaCl og 0,5% (w/v) gærekstrakt 1100 ml
C1 2 mMMgCl2 og ~750 enheder DNAse og 50 mM Tris-HCl pH 7,5 20 ml
C2 50 mM Tris-HCI, pH 7,5 50 ml
C3 4% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), 2 mM β-mercaptoethanol og 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 ml
C4 2% (w/v) SDS, 500 mM NaCl og 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 ml
C5 0,5% (w/v) octylpolyoxyethylen (octyl POE), 1 mM EDTA og 20 mM Tris pH 8,5 1000 ml
* Steriliser før brug.

Tabel 2: Bufferopløsninger til OmpF-isolering.

Discussion

Protokollen, der præsenteres her, giver en introduktion til brugen af DIB-membraner til at studere samspillet mellem lateral ionkanalbevægelse og kanalfunktion ved hjælp af enkeltmolekyle TIRF-mikroskopi. For at opnå de bedst mulige data er fremstilling af stabile DIB-membraner med så mange godt adskilte kanaler som muligt afgørende for at opnå tidsserier af individuelle partikler, som kan analyseres tilfredsstillende.

Kritiske parametre, der skal optimeres, omfatter valg af lipid, lipidkoncentrationen i oliefasen og protein- og vaskemiddelkoncentrationerne i de vandige dråber. De anvendte lipider er usædvanlige, idet de ikke viser nogen klar faseovergang ved lave temperaturer. DPhPC er et almindeligt anvendt lipid til at producere stabile membransystemer40. I princippet kan ethvert lipid, der opretholder sit væskemiljø ved lave temperaturer, være egnet til denne anvendelse. Desuden bør lipidet ikke være følsomt over for oxidation. Koncentrationen af vaskemiddel i dråberne skal være så lav som muligt for at undgå membranbrud. Stabile membraner og gode proteininkorporeringshastigheder opnås generelt med koncentrationer af vaskemiddel under den kritiske micellekoncentration (cmc), da membranproteinet ikke udfældes.

Hvis DIB-membranerne ikke tåler specifikke rengøringsmidler21,41, eller hvis proteinerne ikke integreres fra lav vaskemiddelopløsning i DIB-membranerne, kan proteinkanalerne først rekonstitueres til små unilamellære lipidvesikler (SUV'er), som derefter smeltes sammen med DIB-membranerne fra dråbesiden, som det med succes er vist for E. coli MscL 42 . Nogle gange dannes DIB-membraner ikke, fordi lipidkoncentrationen i oliefasen er for lav. For at forhindre DIB-membraner i at sprænge, skal man også være opmærksom på, at det osmotiske tryk mellem hydrogelen og dråben skal være præcist afbalanceret uden at påvirke Ca2+-fluxen fra cis til trans for meget. Optimeret agarosetykkelse og maskestørrelse synes at være afgørende for at observere diffusionen af membranproteiner. Enhver tørring af agaroselaget bør undgås. Tykkelsen kan bestemmes ved hjælp af atomkraftmikroskopi17. Ved at variere agarosekoncentrationen, volumenet og rotationshastigheden under spinbelægning kan hydrogelens maskestørrelse og tykkelse optimeres. Bemærk dog, at hydrogellagtykkelse påvirker billedkontrasten. For at fange membranproteiner i DIB'er kan agarosehydrogelen erstattes af specialsyntetiseret, ikke-tværbundet, Ni-NTA-modificeret, lavsmeltende agarose for at fange dem via et His-tag17. En for høj fluorescensbaggrund skyldes ofte brud på DIB-membranerne. Dette er især et problem med kamre med flere brønde, da det Ca2+-følsomme farvestof diffunderer ind i hydrogelen. I dette tilfælde bør tilstødende brønde undgås. Fluorescensblegning af det Ca2+-følsomme farvestof over membranen bør ikke være en signifikant begrænsende faktor, da det udveksles med ikke-ophidsede farvestoffer i hovedparten af dråben (figur 3A) uden for TIRF-evanescentfeltet. Lokaliseringspræcisionen for proteinet er givet ved nøjagtigheden af montering af pletterne og pixelstørrelsen.

Svage fluorescenssignaler kan skyldes lav Ca2+-flux gennem kanalen. Mulige årsager omfatter: (i) unøjagtige TIRF-indstillinger (f.eks. laserintensitet), (ii) det osmotiske Ca 2+-tryk over membranen eller (iii) kanalernes iboende Ca2+-permeabilitet er for lav. For at klare det første problem skal laserintensitet, TIRF-vinkel og kameraforstærkning optimeres. De to sidstnævnte problemer kan overvindes ved anvendelse af et elektrisk potentiale over membranen 2,43. Imidlertid kan anvendelsen af eksterne spændinger forvrænge resultatet, da elektriske effekter kan påvirke kanalåbningen af ligand-gated eller mekanofølsomme ionkanaler, der faktisk ikke er spændingsstyrede. Eksempler på sådanne kanaler er mitokondrieproteintranslocasen TOM-CC27 og dens kanaldannende underenhed Tom40 26,44,45,46. Endelig skal det bemærkes, at det er vanskeligt at indsætte membranproteiner i DIB-membraner i en bestemt retning for at opnå en ønsket funktionalitet, og kvantitative undersøgelser er sjældne47,48. I nogle tilfælde er orienteringen af de integrerede proteiner tilfældig. Dette er et alvorligt problem for at studere membranproteiner, fordi visse membranproteiner kun aktiveres på den ene side af membranen.

TIRF-mikroskopi er en kraftfuld metode til adressering af enkeltmolekylehændelser i plane understøttede membraner49. Eksempler inkluderer samling og foldning af vejbelysning af kanalproteiner såsom α-hæmolysin50, perfringolysin O 51 og OmpG52. Disse undersøgelser omfattede FRET som en yderligere teknik. Derudover er aktivering af den mekanofølsomme ionkanal MscL tidligere blevet undersøgt ved mekanisk stimulering af understøttede DIB-dobbeltlag42 ved hjælp af aktuelle målinger. Baseret på dette arbejde kunne fremtidige undersøgelser kombinere platformen beskrevet her med enkeltmolekyle FRET-eksperimenter for at adressere mekanofølsomme kanaler på enkeltmolekyleniveau på en optisk måde17. Injektion af buffer i dråben, strækning af det indre DIB-monolag eller målrettet binding af individuelle kanaler til den underliggende hydrogel kan bruges til yderligere undersøgelse ikke kun af den fysiske mekanisme af mekanisk aktiverede kanaler, som reagerer på membranspænding og / eller krumning som vist for MscL og MscS, to-poredomænet K + -kanaler, TREK-1, TREK-2 og TRAAK og PIEZO (for gennemgang, se53), men også lokal binding til det cellulære cytoskelet, som vist for den berøringsfølsomme ionkanal NOMPC54,55.

Disclosures

Vi erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Beate Nitschke for hendes hjælp med proteinpræparation og Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) og Maximilan Ulbrich (Freiburg) for indsigtsfulde diskussioner. Dette arbejde blev støttet af Stuttgart Research Center Systems Biology (SRCSB) og et tilskud fra Baden Württemberg Foundation (BiofMO-6 til SN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C
100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 Nikon MRD01991 TIRF microscope 
10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
10x objective N.A. 0.25 Nikon MRL00102 TIRF microscope 
40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
488 nm laser, 100 mW   Visitron TIRF microscope 
Adhesive tape
Äkta pure   Cytiva Protein purification system
Bradford assay kit, Pierce Thermo Fisher  23236
CaCl2 Roth 5239.2
Chelax 100 resin Biorad 143-2832
Chloroform  Sigma-Aldrich MC1024452500
Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO Thermo Fisher  87735
DIB chamber  Custom made PMMA chamber for DIB membranes
Digital power meter and energy console Thorlabs PM100D Laser power meter 
Dimethyl sulfoxide Roth  4720.1
Double distilled H2O
Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
EDTA Roth 8042.2
EMCCD camera iXon Ultra 897 Andor TIRF microscope 
Ethanol Sigma-Aldrich 32205-M
Fixed angle rotor Ti70 Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTM Santa Cruz Biotechnology SC-362561 Ca2+-sensitive dye
French press cell disruption homogenizer Igneus Igneus 40000 psi
GFP filter AHF Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source 
Glass capillaries World Precision Instruments 4878
Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm Roth 1870.2
Glycerol Roth 3783.2
Hamilton syringe 10 mL Roth X033.1
Hamilton syringe 100 mL Roth X049.1
Hamilton syringe 500 mL Roth EY49.1
Heating block  Eppendorf Thermomixer comfort
Heating plate Minitube  HT200
Hepes Roth  9205.3
Hexadcane Sigma-Aldrich 296317
His Trap HP 1 mL Cytiva 29051021 Ni-NTA column
Imidazole Sigma-Aldrich 1.04716.1000
KCl Honeywell 10314243
KLM spin coater  Schaefer Tec SCV-10
List medical L/M-3P-A vertical pipette puller Artisan Technology Group 57761-1
Low melting point agarose Sigma-Aldrich  A9414
M8 Stereomicroscope Wild Stereomicrosope 
Matlab  MathWorks R2022a
Methanol Sigma-Aldrich 34860
MicroFil pipette tips World Precision Instruments MF34G-5
N2 gas
NaCl Roth 3957.1
Nanoliter 2010 injector  World Precision Instruments Nanoliter 2010 
n-dodecyl-b-D-maltoside Glycon Biochemicals D97002-C
Ni-NTA agarose, non-crosslinked Cube Biotech 124115393 Custom made
NIS-Elements AR software Nikon MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 Imaging software
n-octyl-polyoxyethylene Sigma-Aldrich 40530
O2 gas
Phenylmethylsulfonyl fluoride Roth  6367.3
Photodiode sensor  Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs S130C Sensor for laser power meter 
Plasma cleaner Diener Electronics Zepto
Preparative ultracentrifuge Optima Beckman Coulter
Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC AHF Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser 
Resource Q 1 mL Cytiva 17117701 Anion exchange column
Silicon oil AR 20 Sigma-Aldrich 10836
Sodium dodecyl sulfate Roth 2326.2
Super LoLux camera JVC Stereomicrosope 
Thermoshaker Gerhardt THL 500/1
Ti-E Fluorescence microscope   Nikon MEA53100
Tris-HCl Sigma-Aldrich 9090.3
Tryptone Roth 8952.2
Ultrasonic bath  Bandelin Sonorex RK 100
Vaccum pump Vacuubrand MD 4C NT
White light source for epifluorescence illumination (100 W) Nikon MBF72655 TIRF microscope 
Yeast extract Roth 2363.2
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  2. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  3. Thompson, J. R., Heron, A. J., Santoso, Y., Wallace, M. I. Enhanced stability and fluidity in droplet on hydrogel bilayers for measuring membrane protein diffusion. Nano Letters. 7 (12), 3875-3878 (2007).
  4. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34 (1), 351-378 (2005).
  5. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysical Journal. 60 (4), 910-921 (1991).
  6. Kusumi, A., Shirai, Y. M., Koyama-Honda, I., Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K. Hierarchical organization of the plasma membrane: Investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy. FEBS Letters. 584 (9), 1814-1823 (2010).
  7. Betaneli, V., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy to examine protein-lipid interactions in membranes. Methods in Molecular Biology. 974, 253-278 (2013).
  8. Ando, T., et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (22), 12468-12472 (2001).
  9. Casuso, I., et al. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (8), 525-529 (2012).
  10. Karner, A., et al. Tuning membrane protein mobility by confinement into nanodomains. Nature Nanotechnology. 12 (3), 260-266 (2017).
  11. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  12. Schink, K. O., Tan, K. -W., Stenmark, H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 143-171 (2016).
  13. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  14. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  15. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  16. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The lateral organization and mobility of plasma membrane components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  17. Wang, S., et al. Spatiotemporal stop-and-go dynamics of the mitochondrial TOM core complex correlates with channel activity. Communications Biology. 5 (1), 471 (2022).
  18. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 265 (2), 595-599 (1999).
  19. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  20. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. Journal of the American Chemical Society. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  21. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  22. Huang, S., Romero-Ruiz, M., Castell, O. K., Bayley, H., Wallace, M. I. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. 10 (11), 986-991 (2015).
  23. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  24. Kiessling, V., Yang, S. -T., Tamm, L. K. Supported lipid bilayers as models for studying membrane domains. Current Topics in Membranes. 75, 1-23 (2015).
  25. Murray, D. H., Tamm, L. K., Kiessling, V. Supported double membranes. Journal of Structural Biology. 168 (1), 183-189 (2009).
  26. Hill, K., et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature. 395 (6701), 516-521 (1998).
  27. Poynor, M., Eckert, R., Nussberger, S. Dynamics of the preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Biophysical Journal. 95 (3), 1511-1522 (2008).
  28. Künkele, K. P., et al. The preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Cell. 93 (6), 1009-1019 (1998).
  29. Ahting, U., et al. The TOM core complex: the general protein import pore of the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 959-968 (1999).
  30. Bausewein, T., et al. Cryo-EM structure of the TOM core complex from Neurospora crassa. Cell. 170 (4), 693-700 (2017).
  31. Cowan, S. W., et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 358 (6389), 727-733 (1992).
  32. Bieligmeyer, M., et al. Reconstitution of the membrane protein OmpF into biomimetic block copolymer-phospholipid hybrid membranes. Beilstein Journal of Nanotechnology. 7, 881-892 (2016).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Vicente, N. B., Zamboni, J. E. D., Adur, J. F., Paravani, E. V., Casco, V. H. Photobleaching correction in fluorescence microscopy images. Journal of Physics: Conference Series. 90 (1), 012068 (2007).
  35. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  36. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  37. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  38. Hirsch, M., Wareham, R. J., Martin-Fernandez, M. L., Hobson, M. P., Rolfe, D. J. A stochastic model for electron multiplication charge-coupled devices - From theory to practice. PLoS One. 8 (1), 53671 (2013).
  39. Bausewein, T., Naveed, H., Liang, J., Nussberger, S. The structure of the TOM core complex in the mitochondrial outer membrane. Biological Chemistry. 401 (6-7), 687-697 (2020).
  40. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta. 555 (1), 147-167 (1979).
  41. Manafirad, A. Single ion-channel analysis in droplet interface bilayer. Methods in Molecular Biology. 2186, 187-195 (2021).
  42. Rosholm, K. R., et al. Activation of the mechanosensitive ion channel MscL by mechanical stimulation of supported Droplet-Hydrogel bilayers. Scientific Reports. 7 (1), 45180 (2017).
  43. Wang, Y., et al. Electrode-free nanopore sensing by DiffusiOptoPhysiology. Science Advances. 5 (9), (2019).
  44. Ahting, U., et al. the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1151-1160 (2001).
  45. Romero-Ruiz, M., Mahendran, K. R., Eckert, R., Winterhalter, M., Nussberger, S. Interactions of mitochondrial presequence peptides with the mitochondrial outer membrane preprotein translocase TOM. Biophysical Journal. 99 (3), 774-781 (2010).
  46. Kuszak, A. J., et al. Evidence of distinct channel conformations and substrate binding affinities for the mitochondrial outer membrane protein translocase pore Tom40. The Journal of Biological Chemistry. 290 (43), 26204-26217 (2015).
  47. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: Experimental verification with the potassium channel KcsA. Journal of the American Chemical Society. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  48. Goers, R., et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Communications Chemistry. 1, 35 (2018).
  49. Castell, O. K., Dijkman, P. M., Wiseman, D. N., Goddard, A. D. Single molecule fluorescence for membrane proteins. Methods. 147, 221-228 (2018).
  50. Thompson, J. R., Cronin, B., Bayley, H., Wallace, M. I. Rapid assembly of a multimeric membrane protein pore. Biophysical Journal. 101 (11), 2679-2683 (2011).
  51. Senior, M. J. T., et al. Single-molecule tracking of perfringolysin O assembly and membrane insertion uncoupling. The FEBS Journal. , (2022).
  52. Weatherill, E. E., et al. Fast slow folding of an outer membrane porin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2121487119 (2022).
  53. Kefauver, J. M., Ward, A. B., Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature. 587 (7835), 567-576 (2020).
  54. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  55. Wang, Y., et al. The push-to-open mechanism of the tethered mechanosensitive ion channel NompC. eLife. 10, 58388 (2021).

Tags

Biokemi nr. 192
Enkeltmolekylebilleddannelse af lateral mobilitet og ionkanalaktivitet i lipiddobbeltlag ved hjælp af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Nussberger, S.… More

Wang, S., Nussberger, S. Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (192), e64970, doi:10.3791/64970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter