Summary
在这里，我们提出了一种来自 海蜥蜴 纤维蛋白溶解酶的亲和纯化方法，该方法简单、廉价且高效。
Abstract
海蕊纤溶酶（sFE）是一种新型纤溶剂，既能将纤溶酶原激活成 纤 溶酶，又能直接降解纤维蛋白，与传统溶栓剂相比具有很大的优势。然而，由于缺乏结构信息，所有sFE的纯化程序都基于多步色谱纯化，过于复杂和昂贵。本文首次基于sFE的晶体结构开发了sFE亲和纯化方案;它包括粗样品和赖氨酸/精氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱的制备、亲和纯化和纯化 sFE 的表征。按照该方案，一批sFE可以在1天内纯化。此外，纯化的sFE的纯度和活性分别增加到92%和19，200 U/mL。因此，这是一种简单、廉价且高效的sFE纯化方法。该方案的开发对于sFE和其他类似药物的进一步利用具有重要意义。
Introduction
血栓形成是对公共卫生的主要威胁，尤其是在 Covid-19 全球大流行之后1，2。临床上，许多纤溶酶原激活剂（PAs），如组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和尿激酶（UK），已被广泛用作溶栓药物。PA可以将患者的纤溶酶原激活为活性纤溶酶以降解纤维蛋白。因此，它们的溶栓效率受到患者纤溶酶原状态3，4的严重限制。纤维蛋白溶解剂，如金属蛋白酶纤溶酶和丝氨酸纤溶酶，是另一种临床溶栓药物，还包括纤溶酶（FE），如纤溶酶，可直接溶解凝块，但被各种纤溶酶抑制剂迅速灭活5。随后，报道了一种新型的纤维蛋白溶解剂，它不仅可以通过将纤溶酶原激活为纤溶酶，还可以直接降解纤维蛋白6-来自古代花生蠕虫Sipunculus nudus（sFE）的纤维蛋白溶解酶6来溶解血栓6。与传统的溶栓药物相比，这种双功能赋予了sFE其他优势，特别是在纤溶酶原状态异常方面。与其他双功能纤维蛋白溶解剂7，8，9相比，sFE在药物开发方面表现出几个优势，包括安全性，特别是对于口服药物。这是因为海蜥的生物安全性和生物相容性已经确立10.
与从微生物、蚯蚓和蘑菇中分离的其他天然纤维蛋白溶解剂类似，从裸蚯蚓中纯化sFE非常复杂，包括组织匀浆、硫酸铵沉淀、脱盐、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱和分子筛等多个阶段10，11，12.这样的净化系统不仅要依靠熟练的技能和昂贵的材料，还需要几天的时间才能完成整个过程。因此，一个简单的sFE纯化方案对sFE的进一步发展具有重要意义。幸运的是，两个sFE晶体（PDB：8HZP;PDB：8HZO）已成功获得（见补充文件1和补充文件2）。通过结构分析和分子对接实验，我们发现sFE的催化核心可以特异性地与含有精氨酸或赖氨酸残基的靶标结合。
本文首次提出了一种基于sFE晶体结构的亲和纯化系统。通过遵循该方案，可以在单个亲和纯化阶段从粗提取物中纯化高纯度和高活性sFE。这里开发的方案不仅对sFE的大规模制备很重要，而且可用于纯化其他纤维蛋白溶解剂。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 准备
- 样品处理
- 仔细解剖新鲜的 裸粒链球菌 （100克）并收集肠道及其内部液体。
- 加入 300 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）进行均质化（1，000 rpm，60 s）。
- 将匀浆冻融3倍。
- 离心样品（10，956× g，0.5小时，4°C）并收集上清液。将样品储存在4°C直至进一步使用。
- 蛋白质沉淀
- 将上清液与饱和硫酸铵溶液（九体积）混合，让混合物在4°C下静置12小时。
注意：协议可以在此处暂停，稍后继续。 - 离心（10，956× g，0.5小时，4°C）得到蛋白质沉淀;将其储存在4°C以备后用。
- 将上清液与饱和硫酸铵溶液（九体积）混合，让混合物在4°C下静置12小时。
- 蛋白质重悬
- 用 30 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）重悬蛋白质沉淀。将此粗蛋白溶液储存在4°C以备后用。
2. 亲和色谱
- 溶液过滤
- 通过0.22μm滤膜过滤粗蛋白溶液。将此样品储存在4°C以备后用。
- 色谱柱填料
- 将适量的赖氨酸-琼脂糖基质培养基和精氨酸-琼脂糖基质上样到5 mL空色谱柱中，将精氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱和赖氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱装入5 mL空色谱柱中。
注意：色谱柱可以储存在2-8°C，基质浸入储存缓冲液（20%乙醇）中。
- 将适量的赖氨酸-琼脂糖基质培养基和精氨酸-琼脂糖基质上样到5 mL空色谱柱中，将精氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱和赖氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱装入5 mL空色谱柱中。
- 亲和纯化
- 首先用ddH2O平衡亲和色谱柱（1 mL/min，10柱体积），然后使用Tris-HCl缓冲液（0.02 M，pH 8.0，1 mL/min，5柱体积）。
- 将蛋白质溶液样品加载到预平衡柱（1 mL/min，1/3柱体积）上。
注意：样品上样量取决于sFE的浓度。 - 用Tris-HCl缓冲液（0.02 M，pH 8.0，五柱体积）洗涤色谱柱。
- 依次用0.15 M、0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M和0.65 M NaCl（1 mL/min，5 个色谱柱体积）洗脱色谱柱。
- 寻找应出现在0.15 M NaCl洗脱中的洗脱峰，然后将馏分收集在5 mL管中。
- 使用3 kD超离心过滤器（3，944 × g，1.5小时，4°C）浓缩洗脱样品。将此样品储存在-80°C以备后用。
3. 纯度评估
- 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备
- 根据Laemmli的方法使用5%浓缩凝胶和12%分离凝胶13制备SDS-PAGE凝胶。
- 电泳
- 将样品（15μL）与5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（1/4体积）混合，在沸水中加热5分钟，上样到SDS-PAGE凝胶上，并在80 V，60 mA下运行凝胶1.5小时。
- 分析
- 电泳后，根据制造商的方案用银染试剂盒对凝胶进行染色，并使用化学发光成像系统观察染色凝胶。
- 使用以下公式分析目标蛋白质的纯度：目标蛋白质的纯度=目标蛋白质的强度值/总蛋白质的强度值。
4. 纤维蛋白溶解活性评估
- 纤维蛋白板制备
- 通过将25mg纤维蛋白原与1.25mL生理盐水混合来制备纤维蛋白原溶液。
- 通过将100U凝血酶与1.05mL生理盐水完全混合来制备凝血酶溶液。
- 通过将 0.5 g 琼脂糖加入 22.5 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.4）中来制备琼脂糖溶液。混合并在100°C下加热琼脂糖溶液，直到完全溶解。
- 将琼脂糖溶液冷却至约50°C并加入纤维蛋白原溶液。然后，立即加入凝血酶溶液，快速混合，并将它们倒入60毫米培养皿中。
- 装载
- 使用无菌钻孔器在准备好的纤维蛋白板上打孔 3 mm 孔，并用 10 μL 样品填充孔。
- 分析
- 在37°C孵育18小时后，通过计算其降解区的大小来测量纤维蛋白溶解活性。纤维蛋白溶解活性=（样品的区域大小/尿激酶的区域大小）x 100U.区域大小=直径x直径。
注意：生理盐水缓冲液，粗蛋白（在方案步骤1.3.1中获得的样品）和尿激酶分别用于空白，阴性对照和阳性对照。与尿激酶相比，我们发现纯化的sFE的纤维蛋白溶解活性为~19，200 U / mL。
- 在37°C孵育18小时后，通过计算其降解区的大小来测量纤维蛋白溶解活性。纤维蛋白溶解活性=（样品的区域大小/尿激酶的区域大小）x 100U.区域大小=直径x直径。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
按照该方案，提取粗组织裂解物，建立精氨酸-琼脂糖基质和赖氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱，得到纯化的sFE，分别用SDS-PAGE和纤维蛋白板测定纯化sFE的纯度和纤维蛋白溶解活性。
离心后，收集的上清液为透明的棕褐色粘稠液体。当该上清液与饱和硫酸铵溶液（九体积）混合时开始沉淀。静置12 h后，在管底形成重沉淀。当用Tris-HCl缓冲液重悬时，蛋白质沉淀迅速消失并溶解在缓冲液中，呈透明的淡黄色液体。
当将蛋白质溶液上样到精氨酸-琼脂糖基质亲和柱上时，~40 min处出现明显的峰（峰1，流出峰），并在~66 min停止洗脱。在梯度洗脱阶段，当用0.15 M NaCl洗脱时，在~94 min处出现明显的峰（峰2，洗脱峰），并在~110 min停止洗脱。在剩余的洗脱阶段（0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M和0.65 M NaCl）中没有出现明显的洗脱峰（图1A）。在这项研究中，我们重复使用精氨酸-琼脂糖基质亲和柱多达10次，发现色谱柱的性能没有显着变化。
当将蛋白质溶液上样到赖氨酸-琼脂糖基质亲和柱上样时，在~38 min处出现一个明显的峰（峰1，流通峰），并在~60 min处停止洗脱。在梯度洗脱阶段，当用0.15 M NaCl洗脱时，在~80 min处出现明显的峰（峰2，洗脱峰），并在~86 min处停止洗脱。在其余洗脱阶段（0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M和0.65 M NaCl）中未出现明显的洗脱峰（图1B）。精氨酸-琼脂糖基质亲和柱和赖氨酸-琼脂糖基质亲和柱的洗脱曲线相似。如前所述，重复使用精氨酸-琼脂糖基质亲和柱多达10次不会改变该色谱柱的性能。
将纯化的sFE（10 μL，洗脱峰样品，峰2）加入到制备的纤维蛋白板中。此外，阳性对照、空白和阴性对照分别使用 10 μL 尿激酶 （100 U）、10 μL 生理盐水缓冲液和 10 μL 粗蛋白（在方案步骤 1.3.1 中获得的样品）。孵育18小时后，两个纤维蛋白板呈现相似的结果：尿激酶对照中出现裂解区（直径1.3cm）;在生理盐水缓冲液中未观察到裂解区;粗蛋白孔中出现裂解区（直径2.1厘米）;纯化的sFE孔中出现裂解区（直径1.8厘米）（图2）。与尿激酶相比，我们发现纯化的sFE的纤维蛋白溶解活性为~19，200 U / mL。当洗脱峰样品调整到与上样到亲和柱上的样品体积相同时，亲和柱的回收率由纤维蛋白板上裂解区的大小（直径x直径）表示。亲和柱的回收率为~73.5%。
使用粗蛋白（在方案步骤1.3.1中获得的样品）和纯化的sFE（洗脱峰样品，峰2）进行纯度分析。SDS-PAGE和染色后，粗蛋白中出现三个主要蛋白质条带（25、26和27 kD）和六个次要条带（20、24、28、35、40和45 kD）。在纯化的sFE中呈现一个主条带（27 kD）和两个次要条带（26和28 kD）（图3）。通过灰度值分析，我们发现纯化的sFE纯度高达~92%。
图 1：亲和纯化曲线。 （A）粗sFE样品经精氨酸-琼脂糖基质亲和纯化纯化。~40 min处出现明显的流出峰，并在~66 min处停止洗脱。~94 min处出现明显的洗脱峰，并在~110 min处停止洗脱。 （B）粗sFE样品通过赖氨酸-琼脂糖基质亲和纯化纯化。~38 min处出现明显的流出峰，并在~60 min处停止洗脱。~80 min处出现明显的洗脱峰，并在~86 min处停止洗脱。 请点击此处查看此图的大图。
图2：纤维蛋白溶解活性评估。 将样品加入纤维蛋白板中，18小时后通过其在平板上的降解区测量和评估其纤维蛋白溶解活性。经过不同处理的样品由红色阿拉伯数字表示。（A）精氨酸-琼脂糖基质亲和柱纯化的sFE的纤维蛋白溶解活性。#1，100U尿激酶;#2，生理盐水缓冲液;#3，粗蛋白（在方案步骤1.3.1中获得的样品）;#4，纯化的sFE（洗脱峰样品，峰2）。（B）赖氨酸-琼脂糖基质亲和柱纯化的sFE的纤维蛋白溶解活性。#1，100U尿激酶;#2，生理盐水缓冲液;#3，粗蛋白（在方案步骤1.3.1中获得的样品）;#4，纯化的sFE（洗脱峰样品，峰2）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：纯度分析。 通过SDS-PAGE分析纯化sFE的纯度。（A）精氨酸-琼脂糖基质亲和柱纯化的sFE纯度。M：蛋白质标志物;泳道1：粗蛋白（在方案步骤1.3.1中获得的样品）;泳道2：纯化的sFE（洗脱峰样品，峰2）。（B）赖氨酸-琼脂糖基质亲和柱纯化的sFE纯度。M：蛋白质标志物;泳道1：粗蛋白（在方案步骤1.3.1中获得的样品）;泳道2：纯化的sFE（洗脱峰样品，峰2）。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：8ZHP：snFPITE-n1的晶体结构。 PDB X 射线结构验证报告。 请点击此处下载此文件。
补充文件2：8ZHO：snFPITE-n2的晶体结构。 PDB X 射线结构验证报告。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
由于sFE的确切基因序列不可用，目前使用的sFE是从新鲜 的S. nudus14中提取的。此外，文献报道的sFE纯化程序复杂且昂贵，因为它们基于sFE的一些一般特征，如分子量，等电点，离子强度和极性15，16。迄今为止，尚未报道sFE的亲和纯化方案。本研究基于sFE晶体结构知识，成功开发了sFE亲和纯化方案。与报道的纯化方法相比，该亲和纯化方法操作简便、价格低廉且用户友好。此外，使用该方法观察到活性sFE的回收率相当高。
尽管已经报道了许多纤维蛋白溶解酶的亲和纯化方法，但它们基于抗体17，抑制剂18，配体和受体16。这些抗体、抑制剂、配体和受体的制备在技术上具有挑战性且费力。此外，将这些分子与基质结合需要额外的努力。相比之下，精氨酸-琼脂糖基质和赖氨酸-琼脂糖基质是商业材料，即用型、高度稳定且易于放大19。最近，赖氨酸-琼脂糖基质已被用于纤溶酶原20，21的亲和纯化;然而，纤溶酶原是纤溶酶的前酶，而不是活性形式15。赖氨酸-琼脂糖基质是否适合纤溶酶的亲和纯化仍不确定。从理论上讲，本研究中利用精氨酸-琼脂糖基质和赖氨酸-琼脂糖基质纯化的sFE只是活性形式，因为晶体模型表明只有sFE的催化三元组才能与精氨酸和赖氨酸残基相互作用。因此，该方案可以应用于其他丝氨酸纤溶酶的纯化，加速其他丝氨酸纤溶酶药物的开发。
由于sFE与亲和柱之间的结合不是很强，因此保持精确的NaCl浓度和适当的洗脱速度对于成功纯化至关重要。另一个关键因素是系统的pH值，这会严重影响纯化。这三个参数都经过了我们的优化。诚然，本研究中活性sFE的回收率相对较低，并且可能受到琼脂糖基质表面可用精氨酸残基或赖氨酸残基数量少的限制。因此，赖氨酸/精氨酸与琼脂糖基质之间的接头需要延长以提高其回收率。同时，我们不能排除与sFE具有相似催化三联征的其他丝氨酸蛋白在该体系下洗脱的可能性。因此，最好添加基于分子量的纯化技术，例如超滤，以从sFE中分离其他丝氨酸蛋白。同样，许多其他问题，如增强结合能力、延长寿命和进一步简化程序，应在未来的工作中通过相应的策略来解决（例如，用聚精氨酸/赖氨酸代替精氨酸/赖氨酸并修饰接头）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
本研究由厦门市科技局（3502Z20227197）和福建省科技局（编号：2019J01070，No.2021Y0027）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B.
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
