Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Helmonteringsbilleder til visualisering og kvantificering af perifer linsestruktur, cellemorfologi og organisation

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66017
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1,3
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware
* These authors contributed equally

Summary

De nuværende protokoller beskriver ny helmonteret billeddannelse til visualisering af perifere strukturer i den okulære linse med metoder til billedkvantificering. Disse protokoller kan bruges i undersøgelser til bedre at forstå forholdet mellem linsemikroskalastrukturer og linseudvikling/funktion.

Abstract

Den okulære linse er et gennemsigtigt fleksibelt væv, der ændrer sin form for at fokusere lys fra forskellige afstande på nethinden. Bortset fra en kældermembran, der omgiver organet, kaldet kapslen, er linsen helt cellulær bestående af et monolag af epitelceller på den forreste halvkugle og en bulkmasse af linsefiberceller. Gennem hele livet spredes epitelceller i den spirende zone ved linseækvator, og ækvatoriale epitelceller migrerer, forlænger og differentierer sig til nydannede fiberceller. Ækvatoriale epitelceller ændrer væsentligt morfologi fra tilfældigt pakkede brostensformede celler til justerede sekskantformede celler, der danner meridionalrækker. Nydannede linsefiberceller bevarer den sekskantede celleform og forlænges mod de forreste og bageste poler og danner en ny skal af celler, der er overlejret på tidligere generationer af fibre. Lidt er kendt om de mekanismer, der driver den bemærkelsesværdige morfogenese af linseepitelceller til fiberceller. For bedre at forstå linsens struktur, udvikling og funktion er der udviklet nye billeddannelsesprotokoller til afbildning af perifere strukturer ved hjælp af hele monteringer af okulære linser. Her vises metoder til kvantificering af kapseltykkelse, epitelcelleareal, cellekerneområde og form, meridional rækkecellerækkefølge og pakning og fibercellebredder. Disse målinger er afgørende for at belyse de cellulære ændringer, der opstår under livslang linsevækst og forstå de ændringer, der opstår med alder eller patologi.

Introduction

Den okulære linse er et fleksibelt, gennemsigtigt væv placeret i den forreste del af øjet, der fungerer til finfokus lys på nethinden. Linsens evne til at fungere kan delvis tilskrives dens indviklede arkitektur og organisation 1,2,3,4,5,6. Omkring linsevævet er kapslen, en kældermembran, der er afgørende for at opretholde linsestruktur og biomekaniske egenskaber 7,8,9. Linsen selv er helt cellulær, bestående af to celletyper: epitel- og fiberceller. Epitellaget består af et monolag af kuboide celler, der dækker linsens forreste halvkugle10. Gennem hele livet spredes epitelcellerne og migrerer langs linsekapslen mod linseækvator. Forreste epitelceller er hvilende og brostensbelagte i tværsnit, og nær linseækvator formerer epitelceller sig og begynder at gennemgå differentieringsprocessen i nye fiberceller11,12. Ækvatoriale epitelceller omdannes fra tilfældigt pakkede celler til organiserede meridionalrækker med sekskantformede celler. Sekskantet celleform opretholdes på basalsiden af disse differentierende celler, mens den apikale side indsnævres og forankres ved linsens omdrejningspunkt eller modiolus 4,13,14,15. Da ækvatoriale epitelceller begynder at forlænge sig til nydannede fiberceller, migrerer cellernes apikale spidser langs den apikale overflade af forreste epitelceller mod den forreste pol, mens de basale spidser bevæger sig langs linsekapslen mod den bageste pol. Nye generationer af fiberceller overlejrer tidligere generationer af celler og skaber sfæriske skaller af fibre. Under celleforlængelses- og modningsprocessen ændrer fiberceller væsentligt deres morfologi 11,12,16. Disse fiberceller udgør hovedparten af linsemassen 11,12,16,17,18.

De molekylære mekanismer, der bidrager til etablering af indviklede linsemikrostrukturer, cellemorfologi og unik cellulær organisation, er ikke helt kendt. Desuden er linsekapslens og cellestrukturens bidrag til den samlede linsefunktion (gennemsigtighed, ændring af linseform) uklar. Imidlertid belyses disse forhold ved hjælp af nye billeddannelsesmetoder og kvantitative vurderinger af linsestrukturelle og cellulære egenskaber 2,4,19,20,21,22. Nye protokoller til billede af hele linser, der giver mulighed for visualisering med høj rumlig opløsning af linsekapslen, epitelceller og perifere fiberceller, er blevet udviklet. Dette inkluderer metode til kvantificering af kapseltykkelse, cellestørrelse, cellekernestørrelse og cirkularitet, meridional rækkerækkefølge, fibercellepakning og fibercellebredder. Disse visualiserings- og billedkvantificeringsmetoder muliggør dybdegående morfometrisk undersøgelse og har fordele i forhold til andre visualiseringsmetoder (billeddannelse af flade monteringer eller vævssektioner) ved at bevare den samlede 3D-vævsstruktur. Disse metoder har gjort det muligt at teste nye hypoteser og vil muliggøre fortsatte fremskridt i forståelsen af linsecellemønsterudvikling og funktion.

Til de følgende eksperimenter bruger vi vildtype- og Rosa26-tdTomat mus tandem dimer-Tomat (B6.129 (Cg) -GT (ROSA) (tdTomato) 23 (Jackson Laboratories) i C57BL / 6J baggrund mellem 6 og 10 uger af begge køn. tdTomato-musene giver mulighed for visualisering af cellulære plasmamembraner i levende linser via ekspression af tdTomat-protein fusioneret med de N-terminale 8 aminosyrer i et muteret MARCKS-protein, der er målrettet plasmamembranen via N-terminal myristylering og interne cystein-palmitoyleringssteder23. Vi bruger også NMIIAE1841K / E1841K mus24 oprindeligt opnået fra Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Som beskrevet tidligere20 er NMIIAE1841K / E1841K mus i FvBN / 129SvEv / C57Bl6 baggrund, der har tab af CP49 perleformet mellemliggende filamentprotein (opretholder moden fibercellemorfologi og hele linsebiomekanik), backcrossed med C57BL6 / J vildtypemus. Vi screenede afkomene for tilstedeværelsen af vildtypen CP49-allel.

Konfokal billeddannelse blev udført på et laserscanning konfokal fluorescensmikroskop med en 20x (NA = 0,8, arbejdsafstand = 0,55 mm, 1x zoom), en 40x (NA = 1,3 oliemål, arbejdsafstand = 0,2 mm, 1x zoom) eller en 63x (NA = 1,4 oliemål, arbejdsafstand = 0,19 mm, 1x zoom) forstørrelse. Alle billeder blev erhvervet ved hjælp af en pinhole størrelse, som er en determinant for optisk sektionstykkelse, til 1 Airy Unit (de resulterende optiske tykkelser er angivet i figurforklaringer). Billeder blev behandlet på Zen Software. Billeder blev eksporteret til .tif format og derefter importeret til FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus er anbragt i University of Delaware dyrefacilitet, opretholdt i et patogenfrit miljø. Alle dyreforsøg, herunder eutanasi ved CO2 indånding, blev udført i overensstemmelse med godkendte dyreprotokoller af University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Forberedelse og billedbehandling af hele objektivmonteringen

  1. Fastgørelse af objektiver til helmonteret billeddannelse
    1. Efter aktiv dødshjælp, enukleatøjne og dissekere linser som tidligere beskrevet25. Efter dissektion overføres linserne straks til frisk 1x fosfatbufret saltvand (PBS; 1,1 mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na2HPO4-7H 2O; pH 7,4) ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Cellulær morfologi kan ændres, hvis linser opbevares i PBS i længere tid, derfor anbefales det at rette straks inden for ~ 10 minutter efter dissektion.
    2. Til helmonteret billeddannelse af objektivets forreste område fastgøres hele linser ved at nedsænke 0,5 ml frisklavet 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i et mikrocentrifugerør ved stuetemperatur. Efter 30 minutter vaskes linserne 3x (5 min pr. vask) med 1x PBS. Fortsæt til trin 1.2 eller opbevar i 1x PBS ved 4 °C. Faste linser kan opbevares i op til 5 dage.
    3. Til helmonteret billeddannelse af objektivets ækvatoriale område fastgøres hele linser ved at nedsænke 0,5 ml frisklavet 4% PFA i 1x PBS i et mikrocentrifugerør ved stuetemperatur. Efter 1 time vaskes linserne 3x (5 min pr. vask) med 1x PBS. Fortsæt til trin 1.3 eller opbevar i 1x PBS ved 4 °C. Faste linser kan opbevares i op til 5 dage.
  2. Hele monteringen af det forreste objektivområde (fast eller strømførende)
    1. For helmonterede billeder af faste lygteglas fortsættes til trin 1.2.3.
    2. Til helmonteret billeddannelse af levende linser overføres linser til en brønd i en 48-brønds plade indeholdende 1 ml medium 199 (phenolrødfri), der indeholder 1% antibiotikum/antimykotikum. Inkuber linser ved 37 °C og 5% CO2 indtil billeddannelse. Før billeddannelsen inkuberes linserne i en opløsning indeholdende fluorescerende mærket hvedekimagglutinin (WGA-640, 1:500) og Hoechst 33342 (1:500) i medium 199 i mindst 10 minutter. Fortsæt til trin 1.5.
    3. For at plette linsekapsel, F-actin og kerner af faste linser anbringes linserne i en 500 μL opløsning indeholdende WGA-640 (1:500), rhodamin-phalloidin (1:50) og Hoechst 33342 (1:500) i permeabiliserings-/blokeringsbuffer (1x PBS indeholdende 0,3% Triton, 0,3% bovint serumalbumin (fraktion V) og 3% gedeserum) i et mikrocentrifugeglas. Plet linser ved 4 °C natten over.
    4. Efter inkubation natten over vaskes linserne 3x (5 min pr. vask) med 1 ml 1x PBS. Fortsæt til billedlinser.
    5. For at stabilisere den faste linse til konfokal billeddannelse skal du oprette linseimmobiliseringsdivots i agarose på en billedskål som tidligere beskrevet21 (figur 1).
      1. Opvarm og bland forsigtigt 2% agarose i PBS ved hjælp af en mikrobølgeovn, indtil opløsningen er flydende. Der pipetteres 250 μL flydende 2 % agarose i et glasbundsfad (figur 1A), og agarosen flades hen over skålen ved hjælp af et fleksibelt plastdæksel (figur 1B). Når agarosen er afkølet og helt størknet, fjernes dæksedlen ved hjælp af pincet med fin spids (figur 1C) og brug en 3 mm biopsistans til at skabe et hul i agarose i midten af skålen (figur 1D).
      2. Fjern overskydende agarose ved hjælp af en delikat opgaveserviet (figur 1E). Hold agaroseskimmel hydreret med 1x PBS og vedligehold ved 4 °C indtil brug. Agaroseforme er blevet opbevaret med succes i op til 1 uge.
    6. Brug embryotang til forsigtigt at overføre den levende eller faste linse til divoten i agarose (figur 1F), der indeholder ~ 2 ml 1x PBS (fast linse) eller phenol rødfri medium 199 (levende linse), og placer derefter skålen på et omvendt mikroskoptrin. For at bekræfte, at linsen er placeret med det forreste område, der vender mod målet, skal du visualisere kernefarvning. Hvis der ikke observeres kerner, kan den bageste region vende mod målet.
    7. For at vende linsen skal du bruge buede tang og forsigtigt dreje linsen ~ 180 °, så det forreste område vender mod målet. Få billeder ved hjælp af et konfokalmikroskop.
    8. Til visualisering af linsekapsler skal du erhverve z-stack-billeder ved hjælp af et 40x mål med en trinstørrelse på 0,3 μm. Få det første billede før overfladen af linsekapslen (angivet ved WGA-farvning) og det sidste billede efter epitelcellernes apikale overflade. For at visualisere epitelceller skal du erhverve z-stack-billeder ved hjælp af et 63x-mål med en trinstørrelse på 0,3 μm til visualisering af linseepitelceller.
      BEMÆRK: Disse mikroskopparametre giver mulighed for tilstrækkelig tredimensionel (3D) rekonstruktion af billeder, hvilket er afgørende for billedkvantificering af kapseltykkelse eller epitelcelleområde. Det er også muligt at afbilde suturer i levende linse tdTomatlinser ved at afbilde forbi epitelcellemonolaget som tidligere beskrevet4.
  3. Linse ækvatorial epitel og fibercellefarvning
    1. I et mikrocentrifugeglas anbringes faste linser i en 0,5 ml opløsning af rhodamin-phalloidin (1:300), WGA-640 (1:250) og Hoechst 33342 (1:500) i permeabiliserings-/blokeringsopløsning (3 % BSA, 3 % gedeserum og 0,3 % Triton). Vedligeholdes ved 4 °C natten over.
    2. Efter inkubation natten over vaskes linserne 3x i 1 ml 1x PBS (5 min pr. vask).
    3. Opret linseimmobilisering agarose kiler som tidligere beskrevet 4,10.
      1. Kort fortalt skal du oprette agarosekiler i glasbundede skåle (FD35-100, WPI) ved at hælde ~ 5-6 ml smeltet 2% agarose i 1x PBS i skåle (figur 2A). Når agarose størkner (figur 2B), oprettes en trekantet divot med et skarpt blad (figur 2C). Fjern agarosekilen, og læg 1 ml 1x PBS i agaroseskålen (figur 2D).
      2. Opsug eventuel resterende agarose, der måtte være efterladt fra skæring af agarose. Der kan oprettes flere kiler pr. skål, så de passer til flere forskellige størrelser linser (ikke vist). For at opbevare agaroseformen skal du placere 1 ml 1x PBS på agaroseformen og opbevare den ved 4 °C. Kiler kan opbevares i op til 1 uge.
    4. Brug buet pincet til at placere linsen i en agarosekile indeholdende 1 ml 1x PBS og justere, så linsens ækvatoriale område vender ned mod mikroskopglas over det konfokale mål (figur 2E-F). For at bekræfte, at ækvatorialområdet er i fokus, visualiser kerner og sørg for, at kerner er justeret i rækker ved ækvator. De ækvatoriale epitelceller kan også identificeres, da de er uregelmæssigt pakket og formet. Desuden er meridionalrækkecellerne nøjagtigt justeret og sekskantet, indikeret ved F-actinfarvning ved cellemembranerne.
    5. Hvis kerner i synsfeltet er tilfældigt pakket, vender den forreste side af linsen mod målet. Hvis kerner ikke kan observeres, vender den bageste side af linsen sandsynligvis mod målet. Hvis linsen ikke sidder på ækvator, skal du orientere linsen igen og bruge den buede pincet til at dreje linsen, indtil de præcist justerede kerner ved linseækvator observeres.
    6. Billede linsens ækvatoriale epitel- og fiberceller ved hjælp af et laserscanningskonfokalmikroskop (20x objektiv, NA = 0,8, trinstørrelse 0,5 μm og / eller 40x oliemål, NA = 1,3, trinstørrelse 0,4 μm). Drej billederne før z-stack-samling, hvor ækvatoriale epitelceller er øverst, efterfulgt af meridional række og fiberceller lige under.

2. Metode til billedanalyse

  1. Måling af objektivkapseltykkelse
    1. Ved hjælp af z-stack-billeder opnået med et 40x mål (0,3 μm trinstørrelse) af enten levende tdTomato-objektiver mærket med WGA eller faste linser mærket med WGA og rho-phalloidin, opnå en optisk 2D-projektion i XZ-visningen af 3D-rekonstruktionen og gem i .tif format. Behandl billeder ved hjælp af Zen-software.
    2. Åbn XZ-skivebilleder (.tif) i FIJI ImageJ-softwaren.
    3. For at måle objektivkapseltykkelsen skal du bruge den lige linjefunktion (vist i figur 3A, B). Indstil stregbredden til 50 pixel ved at vælge Rediger > Indstillinger > Stregbredde. Denne linjebredde blev empirisk bestemt til at give et højt signal-støj-forhold med mikroskopindstillingerne. Den optimale linjebredde kan variere på andre mikroskoper/mikroskopindstillinger eller ved brug af linser fra andre arter. Træk derefter en linje fra kapslens øverste overflade til under epitelcellernes basale region.
    4. Gem linjen som et område af interesse ved at trykke på Ctrl + T.
    5. Adskil kanaler i faner til billed-, farve- og opdelte kanaler.
    6. Mål intensiteten langs linjen for kapselkanalen ved at trykke på Ctrl + K.
    7. I et regneark plottes intensitetsværdier som en funktion af afstanden og bestemmer intensitetstoppe for kapslen og F-actin, som repræsenterer henholdsvis kapseloverfladen og basalområdet af epitelceller. På x-aksen er linjeafstanden.
    8. Beregn derefter kapseltykkelsen ved at bestemme afstanden mellem kapsel- og epitelfluorescerende intensitetstoppe (figur 3C, D).
  2. Analyse af celleareal
    1. Ved hjælp af z-stack-billeder opnået ved hjælp af en 63x objektivlinse (NA = 1,4; 0,3 μm trinstørrelse) på levende tdTomat-linser eller faste linser mærket med phalloidin, analyserer du en XY-visningsskive fra et z-stack-konfokalbillede svarende til, hvor det midterste (laterale) område af epitelceller er i fokus. Bemærk, at laterale membraner er synlige ved hjælp af tdTomato-membranfarvestoffet eller ved at visualisere phalloidin, som er til stede ved laterale cellemembraner.
      BEMÆRK: På grund af objektivets krumning (som det ses i en XZ-visning; Figur 4A-C), vil ikke alle epitelceller være i fokus i billedet. Den midterste region af epitelet svarer til det område, hvor både cellelaterale membraner (figur 4D-E) og kerner (figur 4G-I) er i fokus.
    2. Eksporter billedet som en .tif, og åbn det i FIJI ImageJ.
    3. For at indstille skalaen i FIJI ImageJ til analyse skal du bruge linjeværktøjet til at oprette en linje, der er længden af en skalabjælke fra det konfokale billede.
    4. Registrer linjens pixellængde og skalalinjens længde. Gå til Analysér i værktøjslinjemenuen, og vælg Indstil skala. Indtast antallet af pixel, dvs. linjens længde, i Afstand i pixel, og indtast den kendte længde på skalabjælken i Kendt afstand, i Kendt afstand.
    5. Brug tdTomato- eller rhodamin-phalloidinfarvning som en indikation af cellegrænser til manuelt at skitsere en population af celler, der er i fokus i billedet ved hjælp af det polygonale værktøj. Spor kun celler, hvor laterale membraner er synlige (figur 4E), og undgå at spore delvist synlige celler (dvs. i kanten af billederne). Gem ROI ved at trykke på Ctrl+T. Gå til Rediger i værktøjslinjemenuen, og vælg Ryd udenfor. Mål nu det samlede celleareal (ROI) ved at trykke på Ctrl + M i FIJI ImageJ.
    6. Beregn det gennemsnitlige celleareal ved at dividere ROI-området med det samlede cellenummer. En enkel måde at bestemme antallet af celler på er ved at tælle antallet af kerner. Gå til kernekanalen (blå). I menuen Investeringsafkast skal du vælge den gemte ROI-kontur for celler (figur 4G). Ryd uden for investeringsafkastet ved at gå til Rediger og derefter klikke på Ryd uden for (figur 4H). Brug flerpunktsværktøjet til at tælle kernerne ved at klikke på individuelle kerner.
  3. Cellulært nukleart område og formanalyse
    1. Til kerneareal- og formanalyse skal du analysere et XY-planvisningsoptisk afsnit fra et z-stack-konfokalbillede svarende til, hvor det midterste (laterale) område af tdTomatepitelceller er i fokus. Analyser en z-stack-skive fra et konfokalbillede, hvor det nukleare område er det største (figur 5A); Dette repræsenterer den midterste del af kernerne.
      BEMÆRK: Bemærk, at på grund af objektivets krumning vil ikke alle kerner være i fokus, som det kan ses i XZ-visningen (figur 4G og figur 5A).
    2. Vælg en delpopulation af kerner, der er i fokus, og gem et investeringsafkast.
    3. Brug funktionen Ryd udvendigt . Inden for ROI skal du ved hjælp af frihåndsmarkeringsværktøjet (fjerde menuknap fra venstre) omhyggeligt spore kernernes grænser (figur 5B). Gem hvert nukleart spor i ROI-vinduet ved at trykke på Ctrl + T. Omrids kun kerner, hvor de komplette kerner kan ses, og kernerne ikke rører hinanden.
    4. Når alle kernerne er skitseret, måles de enkelte cellers nukleare areal og form (dvs. cirkularitet) ved at trykke på Ctrl + M.
    5. Kopier og indsæt data i et regneark, og beregn det gennemsnitlige nukleare areal og cirkularitet (figur 5C).
  4. Meridional række epitel pakning
    1. For at måle meridional rækkeforstyrrelse skal du erhverve billeder ved hjælp af et 20x mål (0,5 μm trinstørrelse).
    2. Identificer objektivets omdrejningspunkt/modiolus på billeder. Omdrejningspunktet er det område, hvor de apikale spidser af forlængende epitelceller indsnævres for at danne et ankerpunkt under indledende fibercelledifferentiering og forlængelse ved ækvator. Identificer omdrejningspunktet baseret på lys F-actinintensitet (angivet med pilespids i XZ-visning i figur 6A; angivet med en rød stiplet linje i figur 6B) og ændring i cellulær organisation i et enkelt optisk afsnit ved XY-visning.
      BEMÆRK: Derudover er F-actinfarvning af både de basale og apikale regioner af epitelceller tydelige over omdrejningspunktet, mens kun basalområdet i de forlængende celler er tydelige under omdrejningspunktet (figur 6A). Epitelcellerne over omdrejningspunktlinjen er uregelmæssigt pakket og har tendens til at danne rosetter, mens fibercellerne under omdrejningspunktet er arrangeret i parallelle rækker, angivet ved lys F-actinfarvning ved membranen (figur 6B).
    3. Når omdrejningspunktet er identificeret hos 2 måneder gamle mus, skal du vælge den enkelte optiske sektion ~ 4,5-5 μm perifer til omdrejningspunktet (mod linsekapslen) i XY-planet. Denne afstand vælges ud fra observationen af, at alle kernerne i meridionalrækkecellerne i 2 måneder gamle mus er i fokus, når de er ~ 5 μm perifere til omdrejningspunktet. Gem den enkelte optiske sektion (.tif). Åbn billedet på FIJI.
      BEMÆRK: Denne analyse er kun udført på 2 måneder gamle mus, og det kan derfor ikke konkluderes, om denne afstand ændrer sig med alderen.
    4. Før du udfører billedanalyse, skal du indstille skalaen til μm i ImageJ ved hjælp af trin 2.2.2.
    5. Manuel skitsere hele meridionalrækkeregionerne ved hjælp af frihåndslinjeværktøjet (interesseområde/ROI) ved at identificere nuklear linjeføring, som vist i figur 7A. Gem ROI ved at trykke på Ctrl+T. Gå til Rediger i værktøjslinjemenuen, og vælg Ryd udenfor. Mål det samlede celleareal (ROI) ved at trykke på Ctrl + M i FIJI ImageJ.
    6. Identificer eventuelle uordensområder, der er angivet ved F-actinfarvning ved at skitsere ved hjælp af frihåndslinjeværktøjet i FIJI ImageJ. Kriterier for uordnede regioner omfatter forgrening af rækker, uregelmæssig pakning og forkert justering af rækker (figur 7B), som vist tidligere20.
    7. Mål det skitserede uordnede område/patched ved at trykke på Ctrl + M i FIJI ImageJ. Sum det samlede uordnede område i et regneark.
    8. Opdel det samlede uordnede område med ROI-området, og gang derefter med 100 for at få et procent uordnet område. Hvis der ikke observeres nogen lidelse, skal du placere en værdi på 0% for det uordnede område.
  5. Meridional række antal naboceller
    1. For at måle antallet af naboceller skal du bruge F-actinfarvede billeder erhvervet med 40x oliemål (0,4 μm trinstørrelse).
    2. Identificer et optisk snit (XY-plan) ved basalområdet af meridionalrækkecellerne indad fra linsekapslen, hvor F-actin er beriget omkring hele omkredsen af meridionalrækkecellerne, alle meridionale rækkeceller er i fokus og er på samme plan.
    3. Tæl antallet af tilstødende celler, som hver meridionalrækkecelle har (figur 8). Mål den gennemsnitlige procentdel af celler med seks tilstødende celler i et regneark.
      BEMÆRK: Bestem antallet af tilstødende celler med et 20x mål. Det er dog betydeligt lettere at observere sekskantformen med et 40x mål.
  6. Billedanalyse af ækvatoriale fiberceller
    1. Tag z-stack konfokale billeder af rhodamin phalloidin farvede linser med et 20x mål (0,5 μm trinstørrelse).
    2. Omdrejningspunktet identificeres som angivet i trin 2.4.2. Når omdrejningspunktet er identificeret, skal du vælge en enkelt optisk sektion. Til standardiseringsformål og for at sammenligne mellem linser kvantificeres fibercellebredder ~ 10 μm indad fra omdrejningspunktet i XY-planet (figur 9A).
    3. Eksporter raw-billeder til FIJI ImageJ. I FIJI ImageJ skal du tegne en linje (normalt ~ 300-400 μm lang) over flere tilstødende fiberceller for at måle afstanden mellem F-actin-farvede toppe (linjescanningsanalyse; Figur 9A; lyserød linje).
    4. Få den fluorescerende intensitet over linjescanningsafstanden i FIJI ved at trykke på Ctrl+K. Eksporter derefter data til regnearket for at beregne afstanden mellem spidsbelastningerne (eksempel vist i figur 9A-B). Dette svarer til fibercellebredder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forreste linsekapsel, epitelcelleområde og nukleart område
For at analysere linsekapseltykkelsen farvede vi linsekapsler i enten levende eller faste linser med WGA. Vi identificerede linseepitelceller ved at mærke membraner med tdTomato i levende linser (figur 2A) eller via rhodamin-phalloidinfarvning for F-actin ved cellemembranerne i faste linser (figur 2B). I en ortogonal (XZ) projektion giver farvning til WGA og tdTomato/rhodamin-phalloidin os mulighed for at udføre peak-to-peak line scanningsanalyse af fluorescensintensitet. Den største top i WGA-kanalen indikerer kapseloverfladen, mens den store top i tdTomato/rhodamin-phalloidin-kanalen angiver epitelcellernes basale region. Ved at beregne afstanden mellem disse toppe kan vi opnå kapseltykkelse. Linjescanningsanalysen viser, at kapsler fra en 9 uger gammel mus levende linse havde en tykkelse på 11,2 μm, og kapsler fra en 9 uger gammel mus fast linse havde en tykkelse på 12,5 μm. Disse observerede kapseltykkelser er repræsentative for tidligere fund 2,4.

Helmonteret billeddannelse af tdTomato-mærkede transgene muselinser (eller rhodamin-phalloidinfarvede linser; ikke vist) giver mulighed for live visualisering af epitelcellemorfologi. Den ortogonale (XZ) projektion giver et sidebillede af linseepitelcellen, mens den plane (XY) visning ved de laterale regioner giver mulighed for visualisering af den epitelpolygonale form. I sunde linser observerer vi ingen mellemrum mellem cellerne. Vi kan beregne det gennemsnitlige celleareal ved at spore en population af celler i et billede og dividere området med antallet af celler inden for ROI. Antallet af celler bestemmes ved at tælle antallet af Hoechst-farvede kerner i et givet investeringsafkast. Analysen viser et gennemsnitligt celleareal på 260 μm2, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser 2,4.

Hoechsts farvning af kerner gør det også muligt at undersøge linseepitelcellekernemorfometri i epitelceller. De ortogonale (XZ) fremspring giver mulighed for et sidebillede af kerner. Den plane (XY) visning viser kernernes cirkulære/ellipsoide former. Sporing af kerner gør det muligt at beregne individuelle cellers nukleare areal og andre formparametre såsom cirkularitet. Analysen viser et gennemsnitligt nukleart areal på 64 μm2 med en gennemsnitlig cirkularitet på 0,8. Cirkularitetsværdier tæt på 1 indikerer en perfekt cirkel, mens værdier, der nærmer sig 0, indikerer en mere langstrakt morfologi.

Ækvatorial epitelcellepakning, fibercelle sekskantet pakning og fibercellebredder
Den plane (XY) visning af linsens ækvatoriale region demonstrerer sekskantformede og regelmæssigt pakkede linseepitelceller, der konvergerer ved omdrejningspunktet. Omdrejningspunktet er, hvor de apikale spidser af forlængende epitelceller indsnævres for at danne et ankerpunkt under indledende fibercelledifferentiering og forlængelse ved ækvator 4,13,14,15 (figur 6B, angivet med en rød stiplet linje). Omdrejningspunktet kan lokaliseres baseret på øget F-actinfarvning, der danner en kontinuerlig linje, der adskiller ækvatoriale epitelceller og fiberceller (figur 6B, rød stiplet linje). F-actinfarvningen ved cellemembranerne viser også ændringer i celleform, hvor celler under omdrejningspunktet er nøjagtigt justeret og arrangeret i parallelle rækker (figur 6). Cellekerner er også justeret under omdrejningspunktet.

For at visualisere linsemeridionalrækkeepitelceller og fiberceller vælges et billede 4,5-5 μm perifert til omdrejningspunktet (mod linsekapslen) i XY-planet, hvor basalområdet af meridionalrækkeceller er synligt, som beskrevet tidligere20. For at måle meridional rækkeforstyrrelse er en region af interesse (ROI) skitseret (figur 7A; gul boks). Arealet af ROI i wildtype-objektivbilledet er 15.833 μm2. Da der ikke er nogen observerbar lidelse, er arealet af lidelsesprocent 0. Den kritiske rolle, som ikke-muskelmyosin IIA (NMIIA) spiller i cellesekskantet pakning ved hjælp af mus med en NMIIA-E1841K-mutation, er tidligere beskrevet20. Figur 7A viser et repræsentativt NMIIAE1841K / E1841K linseækvatorialbillede for at demonstrere meridional rækkecelleforstyrrelse. Den meridionale række ROI var 20.757μm2. Dernæst blev det samlede areal af uordnede pletter sporet. Det samlede areal af lidelse var 3.185 μm2. Den beregnede procentdel af lidelse blev bestemt til at være 15,3% (uordnet område x 100/total ROI; Figur 7B). Denne procent uordnede område ligger inden for området i en tidligere undersøgelse20.

Dernæst blev der påvist en undersøgelse af sekskantet pakning i vildtypemeridionalrækkeceller20. Fordi F-actin er beriget omkring hele omkredsen af meridional rækkeceller og i alle seks hjørner af de basale regioner af cellemembraner i vildtype (dvs. NMIIA+/+) linser, blev F-actinfarvning brugt til at vurdere celleformer og pakningsorganisation. På repræsentativt billede 1 blev celler mærket, og antallet af tilstødende celler omkring hver celle blev talt. På billede 1 har alle ti celler seks tilstødende celler, hvilket tyder på, at disse celler er arrangeret i en bikagepakningsorganisation (figur 8). I modsætning hertil har otte ud af 10 celler (80% af cellerne) seks tilstødende celler i billede 2, der indikerer, at cellerne er uregelmæssigt pakket (figur 8).

Endelig, for at måle fibercellebredden, blev de perifere fiberceller placeret ~ 10 μm indad fra omdrejningspunktet i faste vildtypelinser mærket med rhodamin-phalloidin undersøgt (figur 9A) 2,4. Bemærk, at det også er muligt at måle fibercellebredder ved hjælp af levende tdTomato-mus, men signalet fra linser, der er heterozygote for tdTomato, har tendens til at være svagt i ækvatoriale regioner. Derfor anbefales det at bruge mus, der er homozygote til tdTomato, da de har vist sig at have stærkere fluorescens (ikke vist). Afstanden mellem de F-actinfarvede cellegrænser ved hjælp af linjescanningsanalyse blev målt som tidligere beskrevet for at indikere fibercellebredde 2,4 (figur 9B). Denne analyse afslørede, at den gennemsnitlige interpeakafstand i vildtypelinser er 11,45 ± 2,11 μm (N = 117 fiberceller fra 4 forskellige muselinsebilleder, figur 9B).

Figure 1
Figur 1: Trin til oprettelse af agarosedivot til immobilisering af linsen under billeddannelse. (A) Ved hjælp af en glasbundskål gøres pipetten flydende 2% agarose. (B) Flad med et fleksibelt dækselslip, og (C) fjern det med pincet med fin spids, når det er afkølet. (D) Til divoten oprettes et hul ved hjælp af en 3 mm biopsistans. E) Opsug restagaros, skyl med PBS, tør overfladen ren med et fnugfrit væv. (F) Monter forsigtigt hele objektivet i divot. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Trin til oprettelse af agarosedivot til billeddannelse af linseækvatoriale epitel- og fiberceller. (A) Hæld 2% smeltet agarose i vævskulturskålen. (B) Agarose afkøles ved stuetemperatur, indtil den størkner helt. (C) Opret en trekantet divot med et skarpt blad. (D) Kom 1 ml 1x PBS i vævskulturskålen. (E) Placer den dissekerede linse i kilen med (F) linsen støttet op på ækvator klemt fast mellem agarosevæggene (rød pil). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af objektivkapseltykkelse. Sagittale (X, Z plan view) optiske sektioner fra rekonstruktioner af konfokale z-stakke af (A) levende og (B) faste linsekapsler. Fluorescerende intensitet af linjescanning af (C) levende og (D) faste linser viser en enkelt WGA (grøn) top, der svarer til kapslens øverste overflade og basalområdet af epitelceller (rød) ved siden af kapslen. Afstanden mellem de to toppe måles for at kvantificere kapseltykkelsen. Billeder taget ved hjælp af et 40x oliemål med et pinhole på 1 luftig enhed, hvilket resulterer i optiske sektioner på 1,0 μm og 1,2 μm i henholdsvis tdTomato/Rhodamin-Phalloidin- og WGA-kanalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Kvantificering af epitelcelleareal. (A) X, Z-plan billede af linseepitelcellerne mærket med (B) tdTomato for cellemembraner og (C) Hoechst for kerner. (D) X, Y-plan billede af det midterste område af linseepitelceller. (E) tdTomato-signal bruges som en guide til at definere et interesseområde svarende til en gruppe celler, der er i fokus. F) Arealet af det afgrænsede dyrkningsområde bestemmes. G) Hoechst-farvning af kerner anvendes til at bestemme antallet af celler i det afgrænsede område. (H) Antallet af kerner tælles ved hjælp af (I) FIJI ImageJ's multipointværktøj. For at beregne det gennemsnitlige celleareal divideres det samlede areal af det definerede interesseområde med det samlede antal celler. Billeder taget ved hjælp af et 63x oliemål med et pinhole på 1 luftig enhed, hvilket resulterer i optiske sektioner på 0,7 μm og 1,0 μm i henholdsvis Hoechst- og tdTomato-kanalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Bestemmelse af kerneareal og -form. (A) XY-plan billede af kernernes midterste område. (B) Der blev defineret en region af interesse, hvor kerner er i fokus. Kerner inden for ROI er skitseret. (C) Arealet og cirkulariteten af kerner i individuelle celler blev opstillet i tabelform, og gennemsnit for areal og cirkularitet blev beregnet. Billeder taget med et 63x oliemål med et pinhole på 1 luftig enhed, hvilket resulterer i et optisk snit på 0,7 μm i Hoechst-kanalen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Identifikation af linsens omdrejningspunkt. F-actin og kerner kan bruges til at identificere omdrejningspunktet og meridionalrækkerne. (A) XZ-visning viser beriget phalloidinfarvning for F-actin, som svarer til omdrejningspunktet. (B) Enkelt optisk XY-planvisningssektion med objektivets omdrejningspunkt i fokus. Hoechst-farvning af kerner viser, at kernerne over omdrejningspunktet er uregelmæssigt pakket, mens kernerne under omdrejningspunktet er nøjagtigt justeret (øverst til højre). Phalloidinfarvning for F-actin viser, at cellerne over omdrejningspunktet er uregelmæssigt formet, mens cellerne under omdrejningspunktet er pakket i parallelle rækker (nederst til venstre). Den røde stiplede linje viser placeringen af omdrejningspunktet. Billeder taget ved hjælp af et 20x mål med et pinhole på 1 luftig enhed, hvilket resulterer i optiske sektioner på henholdsvis 1,5 μm, 2,0 μm og 2,2 μm i kanalerne Hoechst, Rhodamin-Phalloidin og WGA-640. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Bestemmelse af meridional rækkeforstyrrelse. (A) Enkelt XY-plan visning af det optiske snit af vildtypen og NMIIAE1841K/E1841K meridionale rækkeceller ~ 5 μm væk fra omdrejningspunktet (mod linsekapslen). Hele meridionalrækkecellerne er skitseret i blåt baseret på nuklear justering. F-actin (rød) farvning i wildtype linse viser, at meridional rækkeceller er nøjagtigt justeret uden tegn på lidelse (0%). En repræsentativ ordnet region i vildtype er skitseret (orange). I linser med uordnede celler skitserer vi de uordnede områder (gul). (B) Høj forstørrelse af ordnet område fra vildtype (orange boks i A). (C) Høj forstørrelse af uordnede områder, der viser forskellige typer forstyrrelser, herunder (I) forgrening af rækker, (II) uregelmæssig celleform og tab af bikagepakning og (III) forkert justering af rækker. Billeder fra NMIIAE1841K/E1841K linse viser 15,3% meridional rækkecelleforstyrrelse. Billeder taget ved hjælp af et 20x mål med et pinhole på 1 luftig enhed, der resulterer i optiske sektioner på henholdsvis 1,5 μm og 2,0 μm i Hoechst- og Rhodamin-Phalloidin-kanalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Analyse af linsemeridional rækkecelle bikagepakning. (A) Enkelte optiske XY-sektioner af meridionalrækkeceller farvet med rhodamin-phalloidin til F-actin. Billeder med lav forstørrelse (øverste panel) viser de celler, der evalueres (nummereret med lyserødt). Det område, der er markeret med gult, er forstørret (nederste panel). De gule romertal er tællingerne af tilstødende celler. Billede 1 viser celler, der alle er sekskantede i form, hver med 6 tilstødende celler. Billede 2 har uregelmæssigheder med celle nummer 1 og 5, der har henholdsvis 5 og 7 tilstødende celler. (B) Data registreres og tabuleres med procentdelen af sekskantede celler, der beregnes. Billeder erhvervet ved hjælp af et 40x mål med et 1 luftigt enheds pinhole, hvilket resulterer i en optisk sektion på 1,0 μm i Rhodamin-Phalloidin-kanalen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Analyse af fibercellebredder. (A) Enkelt optisk XY-visningssektion af linsefibercellerne ~ 10 μm ind fra omdrejningspunktet. Celler blev farvet med rhodamin-phalloidin til F-actin visualisering ved cellemembranerne. En linje (pink; bindestreg) trækkes over et antal fiberceller. (B) Repræsentativ linjescanning af F-actinintensiteter som funktion af afstanden. Interpeakafstanden repræsenterer fibercellebredden. Billeder erhvervet ved hjælp af et 40x mål med et pinhole på 1 luftig enhed, hvilket resulterer i en optisk sektion på 1,0 μm i Rhodamin-Phalloidin-kanalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beskrevne protokoller muliggør visualisering med høj rumlig opløsning af perifere linsestrukturer og celler i linsens forreste og ækvatoriale regioner. I denne undersøgelse blev der vist metoder til visualisering af objektivets perifere strukturer ved hjælp af intakte (levende eller faste) linser, hvor den overordnede 3D-linsearkitektur bevares. Derudover blev der leveret enkle metoder til morfometrisk kvantitativ analyse ved hjælp af offentligt tilgængelig FIJI ImageJ-software. Hele monteringsvisualiserings- og kvantificeringsmetoderne er blevet brugt i tidligere undersøgelser. Disse metoder gjorde det muligt for os at forstå responsen fra den forreste kapsel og celler på linseformændring eller aldring 2,4. Disse metoder er også blevet brugt til at undersøge ækvatorial fibercelleudvidelse på grund af linseformændring eller aldring 2,4 og til at bestemme NMIIAs rolle i etablering af præcise sekskantede former og perifer fibercelleorganisation20.

Helmonteret billeddannelse giver mulighed for høj rumlig opløsning en face imaging af objektivstrukturen. I det forreste linseområde er helmonteret billeddannelse fordelagtig i forhold til fladmonteret billeddannelse ved at forhindre skader, der kan ændre kapselstrukturens integritet og/eller epitelcellulær morfologi. Derudover bevares grænsefladen mellem epitel- og fiberceller. Denne metode giver fordele i forhold til visualisering af linsesektioner, da billeddannelse giver større rumlig opløsning og tillader analyse af epitelcelleareal og nukleart område / form det valgte område (dvs. midtlateralt, som vist her) eller andre celleområder. Desuden giver billeddannelsesmetoderne mulighed for at kvantificere morfologiske træk på bestemte punkter langs linsens ækvatoriale regioner, hvilket muliggør visualisering af sekskantede former, meridional rækkecellepakning, omdrejningspunkt og fibercellebredder, hvilket ikke ville være let opnåeligt via billedfarvede linsesektioner på grund af manglende rumlig opløsning og vævsforvrængning, der kan forekomme under sektionering.

De skitserede protokoller giver også mulighed for billeddannelse af levende linser for at spore specifikke linsestrukturer og celler over tid. Live linsebilleddannelsesprotokollen var medvirkende til en tidligere undersøgelse, hvor gentagne målinger af kapseltykkelse og epitelcelleareal fra en subpopulation af celler fra den samme linse før og efter linsekomprimering for at inducere linsefladning blev udført4. Det blev fastslået, at linsekompression inducerede et fald i kapseltykkelsen og en stigning i epitelcellearealet. På grund af betydelig variation i kapseltykkelse og epitelcelleareal mellem individuelle linser og størrelsen af effekter på disse parametre forårsaget af linsekomprimering, ville det være vanskeligt at opdage forskelle, hvis der blev brugt et uafhængigt måledesign (dvs. sammenligning af individuelle ikke-komprimerede linser versus individuelle komprimerede linser). Ved hjælp af live imaging metoder er helmonteret billeddannelse på levende muselinser, der endogent udtrykker LifeACT-GFP26 for at visualisere F-actin i epitelceller22, hvilket muliggør sporing af F-actin reorganisering i levende epitelceller, blevet udført.

Mens de skitserede protokoller blev udviklet til billeddannelse af muselinser og kan tilpasses til at visualisere linsestrukturer i andre arter, er farvningsprotokollerne til visualisering af linsen både forreste og ækvatoriale perifere strukturer i andre gnaverlinser (rotte, marsvin) såvel som i andre pattedyrlinser (ko, makak og menneske; data ikke vist). Visualisering af strukturer i større linser kræver længere fiksering (4% PFA, på is, 4 timer), blokering (1 time) og farvning (natten over, 4 °C). Det skal bemærkes, at billeddannelsen i forskellige arter kun blev udført på faste linser. Live imaging af linser fra andre arter kan være udfordrende, da live imaging protokollen bruger linser fra transgene mus, der udtrykker fluorogene proteiner. Derfor kan denne billeddannelse udelukke billedlinser af andre arter, hvor genetiske modifikationer ikke er almindelige. Vi har dog været i stand til at udføre live visualisering af linseepitelcellemembraner eller F-actin ved at prætainere muselinser med henholdsvis den lipofile sonde, FM4-64 eller en F-actinbindingssonde, SiR-Jasplakinolid (SiR-actin) (ikke vist). Det kan være muligt at bruge sådanne sonder til at afbilde levende linser fra andre arter. Der skal dog udvises forsigtighed ved brug af sådanne sonder for at undgå virkninger uden for målet; for eksempel kan SiR-Jasplakinolide føre til ændret F-actin dynamik27. En anden begrænsning af farvningsmetoderne, hvad enten det er på levende eller faste linser, er, at sådanne sonder har begrænset penetration. Derfor er billeddannelse begrænset til perifere regioner. Det er muligt at afbilde indre områder (dvs. dybe fiberceller) ved hjælp af linser fra tdTomato transgene mus4, som igen er afhængig af den transgene ekspression af fluorogene proteiner. Udtrykket skal også være højt nok til lyse signaler i dybe fiberceller.

Ikke desto mindre har de skitserede protokoller muliggjort effektiv morfologisk kvantificering af perifere linsefunktioner 2,4,20. Kvantificeringsmetoderne er effektive og bruger open source, offentligt tilgængelig FIJI ImageJ-software. Mens manuelle sporingsværktøjer blev brugt til at identificere interesseområder, kan det være muligt at automatisere identifikationen af interesseområder. Automatisering kan være så simpelt som at anvende fluorescerende tærskel for at forbedre kontrasten til FIJI ImageJ-baseret identifikation af bestemte strukturer (dvs. kernegrænser) eller mere komplekse maskinlæringsalgoritmer til at detektere celleformforskelle (dvs. uregelmæssige epitel- eller fibercelleformer). Mere kompleks analyse kan kræve enten specialiserede plugins eller billedbehandlingssoftware. Specialiserede plugins eller software kan også give mulighed for at opnå 3D-volumetriske morfologiske målinger fra erhvervede z-stacks. Samlet set, mens de beskrevne kvantificeringsmetoder er let tilgængelige, omkostningseffektive og egnede til mange nyttige resultatmål 2,4,20, kan billedprotokolplatformen i kombination med sofistikeret softwareanalyse give et væld af yderligere morfologiske målinger til fremtidige undersøgelser.

Linsen er et indviklet biologisk væv med specialiserede funktioner, der er afhængige af placering og dybdeafhængige geometrier af cellerne og deres tilknyttede strukturer. Brug af billeddannelsesprotokoller og kvantificeringsmetoder, der er demonstreret her, vil give mulighed for en større forståelse af, hvordan linsestrukturer og objektivets komplekse organisation etableres. Desuden vil billeddannelsesprotokollerne og kvantificeringsmetoderne hjælpe med at afgrænse forholdet mellem linsestruktur og funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Eye Institute Grant R01 EY032056 til CC og R01 EY017724 til VMF samt National Institute of General Medical Sciences under bevillingsnummer P20GM139760. STI blev støttet af NIH-NIGMS T32-GM133395 som en del af Chemistry-Biology Interface predoctoral træningsprogram og af en University of Delaware Graduate Scholars Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Biopsy Punch Acuderm Inc NC9084780
Agarose Apex BioResearch Products 20-102GP
Antimycotic/Antibiotic Cytiva SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Prometheus 25-529
Delicate task wipes Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish) World Precision International FD35-100
Hoescht 33342 Biotium 40046
Laser scanning confocal Microscope 880 Zeiss
MatTek Imaging Dish MatTek Life Sciences P35G-1.5-14
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 100503-917
PBS GenClone 25-507B
Phenol red-free medium 199 Gibco 11043023
Rhodamine-Phalloidin Thermo Fisher 00027
Triton X100 Sigma-Aldrich 11332481001
WGA-640 Biotium CF 640R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

Tags

Biologi nr. 203
Helmonteringsbilleder til visualisering og kvantificering af perifer linsestruktur, cellemorfologi og organisation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., … More

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., Fowler, V. M., Cheng, C., Parreno, J. Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization. J. Vis. Exp. (203), e66017, doi:10.3791/66017 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter